Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dai Canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).

1. Screening primario: coltura cellulare e semidici di placche
<ol><li>Per preparare piastre rivestite in poli-L-lisina (PLL), erogare 20 gradi/pozzetto di una soluzione di riserva di 25 g/mL di PLL in piastre ottiche bianche o nere con un pipetta multicanale elettronico o un dispenser reagente. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 0,5–2 h. NOTA: Se si utilizzano le piastre nere 384-well, si aspettano che il segnale di sfondo sia inferiore rispetto alle piastre bianche. Si raccomanda nocedi nere per ridu...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. 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S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

I GPCR conformazionalmente dinamici sono centrali elettriche di trasduzione del segnale. Le proprietà fisiochimiche delle tasche di legame di questi recettori eptahelici, così come la loro rilevanza fisiologica sottolineano la necessità di strumenti di screening dei ligandi GPCR. Come presentato in precedenza, l'analisi PRESTO-Tango è rapida, sensibile e user-friendly, prestandosi allo sviluppo di farmaci. Non solo questo saggio misura l'attivazione indotta dagli agonisti, ma può anche essere utilizzata per quantifi...

I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande e diversificata famiglia di proteine transmembrane, operando come interfacce di comunicazione tra una cellula e il suo ambiente1. La versatilità dei GPR è evidenziata dalla loro capacità di rilevare una vasta gamma di ligandi – dai neurotrasmettitori ai nucleotidi, peptidi ai fotoni, e molti altri - così come la loro capacità di regolare numerose cascate di segnalazione a valle coinvolte nella crescita cellulare, migrazione, differenziazione, apoptosi, cottura cellulare, ecc2,3. Considerando la loro ubiquità e il coinvolgimento in una moltitudine di processi fisiologici, questa famiglia di recettori è della massima importanza terapeutica, dimostrare dal fatto che più di un terzo dei farmaci prescritti attualmente disponibili si rivolgono a GPCR4. Tuttavia, queste terapie esistenti si rivolgono solo a un piccolo sottoinsieme della superfamiglia (circa il 10%) e la farmacologia di molti GPCR rimane non chiarita. Inoltre, più di 100 GP esistono come recettori orfani, in quanto non sono stati abbinati a un ligando endogeno5. Pertanto, lo screening dei ligandi GPCR è fondamentale per la deorfamentizzazione e lo sviluppo di farmaci, in quanto spiana la strada verso la scoperta e l'ottimizzazione dei condotti e, eventualmente, verso la fase di sperimentazione clinica.
I metodi per lo screening dei ligandi GPCR sono tradizionalmente rientrati in una delle due categorie, le analisi funzionali indipendenti dalla proteina G o dalla proteina G6. La segnalazione di GPCR è regolata da proteine G eterotrimerici (G , g , che vengono attivate dallo scambio di GTP con il PIL vincolato alla sottounità7 diG . I segnali provenienti dal recettore attivato vengono trasdotti dalle proteine G tramite messaggeri secondari, come cAMP, Calcio, DAG e IP3, per mediare la segnalazione a valle agli effetti a valle8. La natura delle conseguenze funzionali della segnalazione delle proteine G è stata sfruttata per creare analisi basate sulle cellule che riflettono l'attivazione del recettore. Questi metodi, che misurano gli eventi prossimali (diretti) o distali (indiretti) nella segnalazione delle proteine G, sono più frequentemente utilizzati per lo screening dei ligandi GPCR e sono stati principalmente impiegati negli studi di deorfanotrizzazione6. Esempi di saggi che misurano direttamente l'attivazione delle proteine G mediate da GPCR includono il saggio vincolante [35S]GTP che misura il legame di un analogo GTP radioetichettato e non idrolizzabile alla sottounità di G, e il trasferimento di energia per la risonanza di F.risster/bioluminescenza (FRET/BRET, rispettivamente) sonde per monitorare le interazioni GPCR-G . I saggi che monitorano gli eventi distale sono gli strumenti più comunemente utilizzati per la profilazione GPCR; ad esempio, i saggi cAMP e IP1/3 misurano l'accumulo intracellulare di messaggeri secondari dipendenti dalla proteina G, mentre il flusso [Ca2]e i saggi di reporter che coinvolgono elementi di risposta specifici implicati nell'attivazione della proteina G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) esaminano ulteriormente gli eventi a valle della cascata di segnalazione11. Mentre la maggior parte dei suddetti saggi può essere eseguita a un livello di sono abbastanza sensibili, e vantano alcuni vantaggi specifici per l'analisi (ad esempio, la discriminazione tra agonisti completi/parziali, antagonisti neutri e agonisti inversi nel caso della rilegatura GTPS, o la funzionalità di analisi su cellule vive come [Ca2 ]e IP1/3)6, purtroppo non ci sono metodi dipendenti g-proteina esistenti che si adattino all'interrogatorio dell'intero GPCR-ome farmacologico. Ciò è in gran parte dovuto all'accoppiamento nativo di più sottofamiglie di proteine G ai GPCR, con conseguente segnalazione in diverse cascate e l'accoppiamento sconosciuto delle proteine G agli ORfani GPCR. Per mitigare questo problema, sono stati sviluppati saggi per forzare l'accoppiamento promiscuo di proteine G attraverso un'unica lettura comune di segnalazione, come il cAMP, e Ca2,anche se la maggior parte di essi sono a basso consumo12.
Un aspetto importante del ciclo di vita del GPCR è la cessazione della segnalazione dipendente dalle proteine G, che si verifica in gran parte attraverso il reclutamento di arresti z che induce ladissociazione della proteina G, e infine desensibilizzare il recettore, che è mirato per l'internalizzazione rivestita di clatra1in13 . Le isoforme più onnipresentisamente espresse di z-arrestin sono le non visive z-arrestin1 e z-arrestin2, indicate rispettivamente come arrestin-2 e arrestin-3, rispettivamente14. Inserisci i saggi basati sulle cellule indipendenti della proteina G, che aggiungono una nuova dimensione allo screening dei ligandi GPCR; il traffico di recettori, l'intera cellula senza etichetta e i saggi di reclutamento di arresto z sono tutti esempi degni di nota. I saggi di traffico di GPCR utilizzano ligandi con etichetta fluoroforo o anticorpi co-internalizzati che colpiscono il recettore15, mentre i saggi interi cellulari privi di etichetta utilizzano biosensori che traducono i cambiamenti cellulari indotti dal legame del ligando in output quantificabili, come i segnali elettrici o ottici16. In particolare, le interazioni per eccellenza nel GPCR- Il sistema Tango, sviluppato per la prima volta da Barnea et al. solo dieci anni fa, comporta l'introduzione di tre elementi genetici esogeni: una fusione proteica costituita da z-arrestin2 con proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEVp), un transattivatore di tetraciclina (tTA) legato a un GPCR tramite un virus dell'incisione del tabacco (TEVp), un transattivatore di tetraciclina (tTA) legato a un GPCR tramite un virus dell'incisione del tabacco sito di scissione di scissione (TEVcs) ed è preceduta da una sequenza del capoluogo C del recettore V2pressin (coda V2) per promuovere il reclutamento di arrestate, e un gene reporter luciferasi la cui trascrizione è innescata dal TTA fattore di trascrizione traslocazione al nucleo, che viene liberato dall'ancoraggio della membrana in seguito al reclutamento di z-arrestin2 (Figura 1)18. Le letture quantitative dell'attivazione della GPCR e del reclutamento di z-arrestin2 possono essere successivamente determinate leggendo la luminescenza. Una notevole distinzione è che mentre il traffico di recettori e i metodi interi cellulari privi di etichette sono relativamente a bassa velocità effettiva, il Tango ha diversi vantaggi, tra cui la lettura selettiva che è specifica per il recettore bersaglio e la sensibilità a causa dell'integrazione del segnale, che lo rendono un candidato adatto per lo screening dei ligandi su scala più ampia18.
In considerazione di queste caratteristiche strategiche, Kroeze e altri hanno sviluppato PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), una piattaforma open source ad alta velocità che utilizza l'approccio Tango per profilare il GPCR-ome drogabile in modo parallelo e simultaneo19. Sfruttando il reclutamento "promiscuo" di z-arrestin2 in quasi tutti i GPR, PRESTO-Tango è il primo nel suo genere in termini di analisi funzionali basate sulle cellule, consentendo uno screening rapido "di primo round" di piccoli composti molecolari in quasi tutti i GPL non olfattivi, compresi gli orfani, indipendentedall'accoppiamento della sottofamiglia della proteina G.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Essendo la più grande e versatile superfamiglia genica e mediatori di una serie di vie di segnalazione cellulare, i recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) rappresentano uno degli obiettivi più promettenti per l'industria farmaceutica. Ergo, la progettazione, l'implementazione e l'ottimizzazione dei saggi di screening dei ligandi GPCR è fondamentale, in quanto rappresentano strumenti di controllo remoto per la scoperta di farmaci e per la manipolazione della farmacologia e dei risultati del GPCR. In passato, i saggi dipendenti dalla proteina G caratterizzavano quest'area di ricerca, rilevando eventi indotti dal ligando e quantificando la generazione di messaggeri secondari. Tuttavia, dall'avvento della selettività funzionale, così come una maggiore consapevolezza di diversi altri percorsi indipendenti dalla proteina G e dei limiti associati ai saggi dipendenti dalla proteina G, c'è una maggiore spinta verso la creazione di alternative saggi di screening dei ligandi GPCR. A questo scopo, descriviamo l'applicazione di una di queste risorse, la piattaforma PRESTO-Tango, un sistema di giornalista luciferata luciferasi che consente l'interrogatorio parallelo e simultaneo del GPCR-ome umano, un'impresa che in precedenza era considerata tecnicamente ed economicamente irrealizzabile. Sulla base di un saggio di reclutamento indipendente indipendente dalla proteina G-arrestin2, l'universalità della tratta mediata da z-arrestin2 e della segnalazione presso i GPCR rende PRESTO-TANGO uno strumento adatto per studiare circa 300 GPD umani non olfattivi, tra cui circa 100 recettori orfani. La sensibilità e la robustezza di PRESTO-Tango lo rendono adatto per schermi primari ad alto rendimento utilizzando librerie composte, impiegati per scoprire nuovi obiettivi GPCR per farmaci noti o per scoprire nuovi ligandi per i recettori orfani.

Utilizzando il protocollo PRESTO-Tango presentato nel presente documento, un estratto di granulo cromaffina (CG) è stato esaminato contro 168 obiettivi GPCR non olfattivi, con la maggior parte dei quali sono recettori orfani. La profilazione di tale estratto è stata eseguita esaminando la mobilitazione di arresto z2 presso i recettori scelti, sulla base del principio progettato da Barnea et al.18 (Figura 1). Plasmid cDNA dei GPCR di interesse è stato preso dal kit ...

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Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.

Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

La piattaforma Presto-Tango è stata ideata per eseguire l'interrogatorio parallelo e simultaneo di tutti i GPCR non olfattivi nel genoma umano, compresi gli obiettivi orfani per profilare il reclutamento beta-arrestin 2 indotto dal ligando. La piattaforma Presto-Tango è l'unica risorsa open source per profilare l'intero genoma GPCR in un approccio parallelo, utilizzando un test di reclutamento beta-arrestin indipendente dalla proteina G. A dimostrare che il processore sarebbe Genevieve Laroche, un'associazione di ricerca nel mio laboratorio, e Manel Zighal, un dottorando nel mio laboratorio.Prima di iniziare la procedura aggiungere 20 microlitri di una soluzione di poli-L-lisina da 25 microgrammi per millilitro ad ogni pozzo del numero sperimentale appropriato di 384 piastre inferiori ottiche e incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti o due ore. Alla fine dell'incubazione, scorrere le piastre sul lavandino per rimuovere l'eccesso di poli-L-lisina e aggiungere 40 microlitri di soluzione antimicotica antibiotica ad ogni pozzo. Quindi incubare le piastre necessarie per la semina cellulare a 37 gradi Celsius e posizionare il resto delle piastre a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.Per seminare cellule HTLA per lo screening primario, sciacquare delicatamente colture cellulari confluenti da 150 millimetri con 10 millilitri di PBS prima di trattare le colture con sei millilitri dello 0,05% di tripside EDTA per piatto. Quando le celle hanno staccato il pool le sospensioni cellulari in un tubo conico da 50 millilitri contenente un volume uguale di DMEM. E raccogliere le cellule per centrifugazione.Sospendere di nuovo il pellet a un 2,2 per 10 alla quinta colonna per millilitro di concentrazione DMEM e scorrere le piastre sul lavandino per rimuovere la soluzione antimicotica antibiotica. Toccare le piastre per asciugare e seminare 45 microlitri di cellule in ogni pozzo. Quindi posizionare le piastre a 37 gradi Celsius e 45% di anidride carbonica durante la notte.Per preparare la piastra sorgente di DNA a 384 pozzetti per la trasfezione distribuire 50 nanogrammi per millilitro di ogni DNA plasmide gratuito che codifica per il costrutto GPRC Tango di interesse in 0,1X Tris-EDTA per pozzo in ogni pozzo di una piastra di pozzo 96. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire manualmente 10 microlitri di soluzione di DNA da ogni pozzo della piastra del pozzo 96 a singoli pozzi di una piastra di sorgente di DNA da 384 porri in quadruplicazione per ogni condizione come illustrato. Successivamente, trasferire 40 microlitri di una soluzione di cloruro di calcio molare 0,313 in ogni pozzo della piastra di origine del DNA e mescolare delicatamente il contenuto di ogni pozzo.Aggiungere 50 microlitri di tampone HEPES 2x ad ogni pozzo della piastra sorgente di DNA del pozzo 384 con miscelazione delicata. Dopo un minuto trasferire 10 microlitri della miscela di trasfezione del DNA dalla piastra sorgente di DNA del pozzo 384 a ciascun pozzo di cellule HTLA sementi e incubare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare durante la notte. Il giorno dopo decantare il mezzo cellulare trasfetto e aggiungere lentamente 40 microlitri di mezzo affamato ad ogni pozzo facendo attenzione a non toccare direttamente le cellule.Quindi aggiungere 20 microlitri del tampone del veicolo per le file alternate senza composto in 20 microlitri del composto di interesse a una concentrazione tre volte superiore nelle file alternate, prima di restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Da 16 a 24 ore dopo la stimolazione decantare il mezzo cellulare trasfetto e aggiungere 20 microlitri di reagente luminoso appena preparato ad ogni pozzo per un'incubazione da cinque a 20 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Quindi leggere le piastre su un contatore di luminescenza a microschede con un tempo di integrazione di un secondo per pozzo.Per uno screening secondario, sottocultura delle cellule HTLA in piatti da 100 millimetri a una densità totale cellulare di cinque volte 10 per le sei cellule in 11 millimetri di mezzo completo per piatto per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, miscelato 10 microgrammi di DNA gratuito GPCR con 500 microlitri di soluzione di cloruro di calcio Tris-EDTA con vortice seguito dall'aggiunta di 500 microlitri di tampone HEPES. Dopo uno scuotimento vigoroso, incubare la soluzione per un minuto a temperatura ambiente e aggiungere immediatamente un millilitro della soluzione cadere saggio sulle cellule.Dondolare delicatamente per distribuire uniformemente il precipitato e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo, controlla l'efficienza di trasfezione sotto un imager a celle fluorescenti. Le transazioni superiori al 50% di copertura sono ideali.Risciacquare delicatamente le cellule trasfette con soluzione di versene prima di staccare le cellule con tre millilitri dello 0,05% di tripside EDTA. Raccogliere le cellule dissociate per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet a una concentrazione media quattro volte 10 alla quinta per millilitro di concentrazione media affamata. Quindi seminare 45 microlitri di cellule in ogni pozzo di una piastra di pozzo poli-L-lisina codificata 384 e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per almeno quattro ore.Per preparare una piastra di risposta dose-curva a mezzo log aggiungere 270 microlitri di HBSS integrati con HEPES e antimicotico antibiotico a tutti tranne l'ultima riga di una piastra di 96 pozzo e aggiungere 30 microlitri di ogni soluzione di farmaco alto e basso ai pozzi della riga H.Trasferire la soluzione da ogni pozzo di fila H nel pozzo corrispondente della riga G con miscelazione e continuare a diluire serialmente i composti del farmaco fino all'ultima riga della piastra è raggiungibile. Utilizzando lo schema come riferimento, mescolare 20 microlitri delle diluizioni a colonna bassa dalle file da A a G della piastra del pozzo 96 e 20 microlitri delle diluizioni a colonna alta ai pozzi da B a H della piastra del pozzo 96 alla piastra del pozzo 384 precedentemente seduta. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un minimo di 16 ore.Da 16 a 24 ore dopo la stimolazione decantare il mezzo cellulare trasfetto e aggiungere 20 microlitri di reagente luminoso ad ogni pozzo per un'incubazione da cinque a 20 minuti prima di leggere le piastre su un contatore di luminescenza a micro piastra con un tempo di integrazione di un secondo per pozzo. In questo esperimento rappresentativo, dei 168 GPRS che sono stati interrogati nello screening primario, solo il recettore della dopamina D3 e l'opsin 5 erano contendenti come potenziali obiettivi attivi. Il recettore della dopamina D3 ha prodotto un significativo cambiamento di piega log2 di 4,7 mentre l'opsina 5 ha prodotto una risposta leggermente inferiore di 2,39.In confronto, il recettore della dopamina D2, il controllo positivo per lo schermo primario ha prodotto un cambio di piega log2 di 4,58. Queste curve di risposta dallo screening secondario hanno dimostrato che l'estratto di granulo di cromatina produce finestre di segnale simili in valori di concentrazione effettivi mezzo massimi al quinpirolo confermando la sua validità come un colpo attivo al recettore della dopamina D3. Per l'opsin 5 è stata prodotta una curva di dose piatta simile al controllo negativo, escludendo tuttavia questo recettore come possibile bersaglio per l'estratto di granulo di cromatina. Presto-Tango richiede cure speciali in quanto le variabilità nella distribuzione cellulare, nell'efficienza di trasfezione e nelle diluizioni seriali dei farmaci possono causare errori composti, che possono influire sull'accuratezza dei dati.Metodi ortogonali come approcci radioligand-binding, Bioluminescenza Resonance Energy Transfer e Cyclic AMP calcio e internalizzazione test funzionali possono essere utilizzati per confermare ulteriormente e caratterizzare le interazioni del recettore ligando.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

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