Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회에 의해 지원되었다 (CIHR 교부금 #MOP142219).

1. 1 차 선별 : 세포 배양 및 플레이트 시딩
<ol><li>폴리-L-리신(PLL) 코팅 플레이트를 준비하려면 전자 멀티채널 파이펫 또는 시약 디스펜서를 사용하여 흰색 또는 검은색 384웰 광학 바닥 플레이트에 PLL의 25 μg/mL 스톡 솔루션의 20 μL/well을 분배합니다. 0.5-2 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오. 참고: 검정색 384웰 플레이트를 사용하는 경우 흰색 플레이트에 비해 배경 신호가 낮아질 것으?...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. 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L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

형태역학적 GPCR은 신호 변환의 강국입니다. 이러한 heptahelical 수용체의 결합 포켓의 생리화학적 특성뿐만 아니라 그들의 생리학적 관련성은 GPCR 리간드 스크리닝 도구의 필요성을 강조한다. 위에서 제시한 바와 같이, PRESTO-탱고 분석은 신속하고 민감하며 사용자 친화적이며 약물 개발에 자신을 빌려주고 있습니다. 이 분석은 작용제 유도 활성화를 측정할 뿐만 아니라 길항제 및 알로스테리컬<sup cl...

G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 세포와 그 환경 사이의 통신 인터페이스로 작동하는 가장 크고 가장 다양한 세포 막 단백질 제품군을 구성합니다1. GPCRs의 다양성은 신경 전달 물질에서 뉴클레오티드, 펩티드, 그리고 더 많은 -뿐만 아니라 세포 성장에 관련된 수많은 다운 스트림 신호 캐시드를 조절하는 능력뿐만 아니라, 세포 성장, 이동, 분화, 세포 발사, 등 등 리간드의 다양한 배열을 감지 할 수있는 능력에 의해 강조된다2,3. 생리적 과정의 무리에 그들의 보편성과 관여를 고려, 이 수용체 가족은 현재 유효한 처방 된 약물의 3 분의 1 이상이 GPCRs4를대상으로한다는 사실에 의해 전시, 가장 치료 중요성이다. 그러나, 이러한 기존 치료는 슈퍼 패밀리의 작은 하위 집합을 대상으로 (추정 된 10%), 그리고 많은 GPCRs의 약리학 은 elucidated 남아. 더욱이, 100개 이상의 GPCR은 내인성 리간드5와일치하지 않았기 때문에 고아 수용체로서 존재한다. 따라서, GPCR 리간드 스크리닝은 납 발견 및 최적화를 향한 길을 열어주며, 아마도 임상 시험 단계로 가는 데 있어 매우 중요합니다.
GPCR 리간드 스크리닝을 위한 방법은 전통적으로 G 단백질 의존성 또는 G-단백질 독립적인 기능성 검사법6의두 가지 범주 중 하나에 빠졌다. GPCR 신호는 이종성 G 단백질(Gαβγ)에 의해 조절되며, 이는 Gα 서브유닛7에결합된 GDP에 대한 GTP의 교환에 의해 활성화된다. 활성화된 수용체로부터의 신호는 cAMP, 칼슘, DAG 및 IP3와 같은 보조 메신저를 통해 G-단백질에 의해 변환되어 다운스트림 이펙터에서 다운스트림 신호를중재한다 8. G 단백질 신호의 기능적 결과의 본질은 수용체 활성화를 반영하는 세포 기지를 둔 분석문을 만들기 위하여 이용되었습니다. 이러한 방법은, G-단백질 신호에서 근위(direct) 또는 원위(direct) 사건을 측정하는, GPCR 리간드 스크리닝에 가장 빈번하게 사용되며 주로 탈판화 연구에서 사용되어 왔다6. GPCR 매개 G 단백질 활성화를 직접 측정하는 분석법의 예는 [35S]GTPγS 결합 분석, 이는 Gα 소단위로 방사성 표지 및 비 가수분해성 GTP 아날로그의 결합을 측정하고, Förster/bio luminescence 공명 에너지 전달(FRET/BRET, 각각) 프로브를 측정하여 GPCR-Gα 및 Gα/Gγ 상호작용을 모니터링하는 프로브로, 이는9,10년동안 더 많은 견인력을 얻고 있다. 말단 이벤트를 모니터링하는 assays는 GPCR 프로파일링에 가장 일반적으로 사용되는 도구입니다. 예를 들어, cAMP 및 IP1/3 측정은 G-단백질 의존이 되는 이차 메신저의 세포내 축적을 측정하는 반면, [Ca2+]플럭스 및 리포터 어설션은 G-단백질 활성화에 연루된 특정 반응 요소(CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE)가 시그널링캐스케이드(11)를더 하류로 검사하는 경우이다. 전술한 대부분의 검사는 처리량이 높은 수준에서 수행될 수 있지만, 상당히 민감하고, 특정 분석특이 특이적 이점(예를 들어, GTPγS 결합의 경우 전체/부분 작용제, 중성 길항제 및 역 작용제 간의 차별, 또는 [Ca2+ ]및 IP1/3)와 같은 라이브 세포에 대한 분석 기능6,불행히도 전체 약물 의 심문에 부합하는 기존의 G-단백질 의존적 방법이 없다. 이것은 GPCRs에 다중 G 단백질 하위 가족의 네이티브 결합에 크게 기인합니다, 고아 GPCRs에 몇몇 폭포 및 알려지지 않은 G 단백질 결합에 신호의 결과로. 이 문제점을 완화하기 위하여는, asays는 cAMP와 같은 단 하나 일반적인 신호 판독을 통해 무차별적인 G 단백질 결합을 강제하기 위하여 개발되었습니다, 및Ca2+,이기는 하지만 그들 대부분은 낮은 처리량12입니다.
GPCR 수명 주기의 중요한 양상은 G-단백질-의존성 신호전달의 종결이며, 이는 G-단백질의 해리를 유도하는 β-arrestins의 모집을 통해 상당 부분 발생하고, 궁극적으로 는 클라트린 코팅 내재화를 대상으로 하는 수용체를 둔감화한다13. β-arrestin의 가장 유비쿼터스 표현된 이소폼은 비시각적 β-arrestin1 및 β-arrestin2, 또한 체포-2 및 체포-3로 각각14로표기된다. GPCR 리간드 스크리닝에 새로운 차원을 추가하는 G-단백질 독립적인 세포 기반 검혈을 입력합니다; 수용체 인신 매매, 라벨없는 전체 세포, β-arrestin 모집 세포는 모두 주목할만한 예입니다. GPCR trafficking assays employ fluorophore-labeled ligands or co-internalized antibodies targeting the receptor15, whereas label-free whole cell assays use biosensors which translate cellular changes induced by ligand binding into quantifiable outputs, such as electrical or optical signals16. 특히, 전형적인 GPCR-β-arrestin 상호작용은 β-arrestin 모집 분석법의 레퍼토리에서 매력적인도구로서 17. 불과 10년 전, 바네아 외가 처음 개발한 탱고 시스템, 담배 에칭 바이러스 프로테아제 (TEVp)와 β-arrestin2로 구성된 단백질 융합 , 담배 등 통해 GPCR에 묶여테트라 사이클린 형질 전환기 (tTA)의 세 가지 외인성 유전 요소의 도입을 포함한다 바이러스 프로테아제 분열 부위(TEVcs)는 V2 바소프레신 수용체(V2 tail)의 C-종단으로부터의 서열에 선행되어 체포모집을 촉진하고, 그의 전사가 발동되는 기자 루시퍼라제 유전자는 tTA 전사 인자는 β-arrestin2 모집에 따라 막 앵커링으로부터 해방되는 핵으로전좌(도1)18. GPCR 활성화 및 β-arrestin2 모집의 정량 적 판독은 발광을 위해 판독에 의해 이후에 결정될 수 있다. 주목할 만한 구별은 수용체 인신 매매 및 라벨없는 전체 세포 방법이 상대적으로 낮은 처리량이지만, 탱고는 신호 통합으로 인한 표적 수용체 및 감도에 특이적인 선택적 판독을 포함하여 몇 가지 장점을 가지고 있으며, 이는 더 큰 규모의 리간드 스크리닝에 적합한후보(18)이다.
이러한 전략적 특징을 고려하여, 크로에즈 등은 PRESTO-Tango(병렬 수용체-오메 발현 및 전사 출력 탱고를 통한 스크리닝)를 개발했으며, 탱고 접근법을 사용하여 약물성 GPCR-ome을 병렬 및 동시 방식으로 프로파일링하는 고처리량 오픈 소스플랫폼19를개발했다. 거의 모든 GPCRs에 β-arrestin2의 "무차별"모집을 이용, PRESTO-탱고는 세포 기반 기능 분석의 측면에서 최초의 종류입니다, 거의 모든 비 후각 GPCRs에서 작은 분자 화합물의 빠른 "첫 번째 라운드"스크리닝을 가능하게, 고아를 포함, G-단백질 하위 가족 커플링과 무관.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

세포 신호 경로의 영역의 가장 크고 가장 다양한 유전자 슈퍼 패밀리 및 중재자로서, G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 제약 산업에 대한 가장 유망한 목표 중 하나를 나타냅니다. GpCR 리간드 스크리닝 분석의 설계, 구현 및 최적화는 신약 발견및 GPCR 약리학 및 결과 조작을 위한 원격 제어 도구를 나타내므로 매우 중요합니다. 과거에, G 단백질 의존적인 희구한 조사는 연구의 이 지역을, 리간드 유도한 사건을 검출하고 이차 메신저의 생성을 정량화했습니다. 그러나, 기능적 선택성의 출현 이후, 뿐만 아니라 여러 다른 G 단백질 독립적 인 경로의 증가 인식과 G 단백질 의존적 인 반응성 반응성 반응성 반응제와 관련된 제한, 대안의 생성을 향한 더 큰 추진이있다 GPCR 리간드 스크리닝 검거 검사. 이러한 노력에 대해, 우리는 이러한 자원 중 하나의 응용 프로그램을 설명, PRESTO-탱고 플랫폼, 인간 GPCR-ome의 병렬 및 동시 심문을 가능하게 하는 luciferase 기자 기반 시스템, 이전에 고려 된 위업 기술적, 경제적으로 실현 불가능합니다. G-단백질 독립적인 β-arrestin2 모집 분석에 근거하여, GPCRs에서 β-arrestin2 중재된 인신 매매 및 신호의 보편성은 PRESTO-TANGO를 대략 100를 포함하여 대략 300의 비 후각 인간 GPCRs를 공부하기위한 적당한 공구를 만듭니다 고아 수용체. PRESTO-Tango의 감도와 견고성은 알려진 약물에 대한 새로운 GPCR 표적을 발견하거나 고아 수용체에 대한 새로운 리간드를 발견하기 위해 사용되는 화합물 라이브러리를 사용하여 1 차적인 고처리량 스크린에 적합합니다.

본 원에 제시된 PRESTO-탱고 프로토콜을 사용하여, 크로마핀 과립(CG) 추출물을 168개의 비후각 GPCR 표적에 대해 스크리닝하였고, 대다수는 고아 수용체이다. 상기 추출물의 프로파일링은 바네아 외18(도 1)에의해 설계된 원리에 기초하여 선택된 수용체에서 β-arrestin2 동원을 조사함으로써 수행되었다. 관심 있는 GPCRs의 플라스미드 cDNA는 PRESTO-탱고 GPCR 키트에서 ...

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Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

GPCRs가 매력적인 약물 성 표적이라는 점을 감안할 때, GPCR 리간드 스크리닝은 따라서 납 화합물의 식별및 탈판화 연구에 필수적입니다. 이러한 노력에 대해, 우리는 PRESTO-탱고, TEV 기반 기자 분석기를 사용하여 약 300 GPCRs에서 과도 β arrestin2 모집의 동시 프로파일링에 사용되는 오픈 소스 자원 플랫폼을 설명합니다.

PRESTO-탱고 분석기를 사용하여 GPCR 전체 규모의 리간드 스크리닝을 위한 β-Arrestin2 모집의 병렬 심문

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

프레스토 탱고 플랫폼은 리간드 유도 베타 체포 2 모집을 프로파일하는 고아 표적을 포함하여 인간 게놈에 있는 모든 비 후각 GPCRs의 병렬 및 동시 심문을 실행하도록 고안되었습니다. Presto-Tango 플랫폼은 G 단백질 독립적 인 베타 체포 분석법을 사용하여 병렬 접근 법으로 전체 GPCR 게놈을 프로파일링하기위한 유일한 오픈 소스 자원입니다. 프로세서를 시연하는 것은 제네비브 라로슈(Genevieve Laroche)의 연구 준과 제 실험실에서 박사 후보인 마넬 지갈(Manel Zighal)이 될 것입니다.시술을 시작하기 전에 밀리리터 폴리 L-리신 용액 당 25 마이크로리터를 384 개의 광학 바닥 플레이트의 각 우물에 추가하고 30 분에서 2 시간 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 과잉 폴리 L-리신을 제거하고 각 우물에 항생제 항진용액의 40 마이크로 리터를 추가싱크를 통해 플레이트를 쓸어. 그런 다음 세포 파종에 필요한 플레이트를 섭씨 37도에서 배양하고 나머지 플레이트를 섭씨 4도에 배치하여 장기 보관하십시오.1 차 적인 검열을 위한 HTLA 세포를 종자하기 위하여는, 부드럽게 접시 당 0.05%의 트립신 EDTA의 6밀리리터로 배양을 취급하기 전에 PBS의 10 밀리리터와 콘천성 150 밀리미터 세포 배양을 부드럽게 헹구십시오. 세포가 풀을 분리했을 때 동일한 양의 DMEM을 포함하는 50 밀리리터 원판 튜브에서 세포 현탁액. 그리고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.DMEM 농도의 밀리리터 당 5번째 세포에 2.2배 10번으로 펠릿을 다시 중단하고 싱크대 를 통해 플레이트를 쓸어 놓아 항생제 항mycotic 용액을 제거한다. 접시를 탭하여 45마이크로리터의 셀을 각 우물로 자릅니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 45%로 하룻밤 사이에 놓습니다.384개의 잘 된 DNA 소스 플레이트를 제조하기 위해 각 플라스미드 무료 DNA의 밀리리터당 50 나노그램을 분배하여 GPRC 탱고 구조당 0.1X Tris-EDTA에 대한 관심있는 GPRC 탱고 구조가 96 웰 플레이트의 각 웰에 잘 들어갑니다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에서 각 조건별로 4배의 DNA 소스 플레이트 1개중 개별 우물로 DNA 용액 10마이크로리터를 수동으로 전송한다. 다음으로, 0.313 의 어금니 칼슘 염화물 용액40마이크로리터를 DNA 소스 플레이트의 각 웰에 전달하고 각 웰의 내용을 부드럽게 혼합한다.부드러운 혼합384 웰 DNA 소스 플레이트의 각 웰에 2x HEPES 버퍼의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 1분 후 384개의 잘 DNA 소스 플레이트에서 DNA 트랜스포팅 혼합물의 10마이크로리터를 종자 HTLA 세포의 각 웰로 이송하고 하룻밤 동안 세포 배양기에서 세포를 배양한다. 다음 날 전소 세포를 직접 만지지 않도록 주의하여 각 웰에 굶주린 배지의 40 마이크로리터를 천천히 첨가합니다.그런 다음 20 마이크로리터를 교대행으로 3배 농도로 관심 있는 화합물의 화합물 20 마이크로리터에 화합물 없이 교대행에 대한 차량 버퍼 20마이크로리터를 추가하여 세포 배양 배양 배양기로 되돌린다. 자극 이에 따라 16~24시간 전소 배지를 감착하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 5~20분 동안 각 웰에 갓 준비된 광질 시약 20마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 마이크로 플레이트 발광 카운터의 플레이트를 잘 통합한 시간으로 읽습니다.이차 스크리닝의 경우 HTLA 세포를 섭씨 37도에서 24시간 동안 접시당 11밀리미터의 완전한 배지로 5배 10밀리미터 의 6세포 총 세포 밀도로 100밀리미터 의 요리로 배양한다. 다음 날, 500 마이크로리터의 트리스-EDTA 칼슘 염화염화물 용액과 함께 GPCR 무료 DNA 10마이크로그램을 혼합한 후 HEPES 버퍼500마이크로리터를 첨가했습니다. 격렬한 흔들림 후 실온에서 1 분 동안 용액을 배양하고 즉시 용액의 1 밀리리터를 세포에 현명하게 추가하십시오.부드럽게 바위를 흔들어 침전을 고르게 분배하고 접시를 섭씨 37도에서 24시간 동안 놓습니다. 다음 날, 형광 세포 이미저에서 형광 효율을 확인하십시오. 커버리지가 50% 이상인 트랜잭션이 이상적입니다.0.05%의 트립신 EDTA의 3밀리리터로 세포를 분리하기 전에 반감염된 세포를 성구 용액으로 부드럽게 헹구십시오. 원심분리에 의해 해리된 세포를 수집하고 탄환을 기아 중간 농도의 밀리리터 당 5번째 세포로 4회 10회에서 다시 중단한다. 그런 다음 45 마이크로리터의 세포가 폴리 L-리신 코딩 384 웰 플레이트의 각 우물로 파종하고 적어도 4시간 동안 세포 배양 배양 배양에 플레이트를 배치한다.하프 로그 용량 곡선 응답 플레이트를 준비하려면 HEPES및 항생제 항mycotic로 보충된 270마이크로리터를 96웰 플레이트의 마지막 행에 추가하고 각 고저약물 용액의 30마이크로리터를 H.Transfer각 웰의 웰에서 혼합및 혼합및 혼합및 마지막 행까지 연속적으로 희석하기 위해 용액을 전송합니다. 도달합니다. 색다른 기준으로 매틱을 사용하여, 96웰 플레이트의 G를 통해 행 A로부터 낮은 컬럼 희석제 20마이크로리터와 높은 컬럼 희석기 20마이크로리터를 96웰 플레이트의 H를 통해 B를 통해 기존 시트384 웰 플레이트에 혼합한다. 그런 다음 최소 16 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.자극 감소 후 16~24시간 전소 세포 배지를 감착하고 5~20분 동안 각 웰에 20마이크로리터의 글로우 시약을 추가하여 마이크로 플레이트 발광 카운터에서 플레이트를 잘 1초씩 편성하였다. 이 대표적인 실험에서, 1차 선별에서 심문된 168GPCR 중에서도 도파민 수용체 D3와 opsin 5만이 잠재적인 활성 표적으로 경쟁자였습니다. 도파민 수용체 D3는 4.7의 중요한 로그2 접이식 변화를 일으켰고, opsin 5는 2.39의 약간 낮은 반응을 일으켰다.비교하여, 도파민 수용체 D2, 1차 스크린에 대한 양성 대조군은 4.58의 로그2 접이식 변화를 일으켰다. 이차 스크리닝에서 이러한 응답 곡선은 크로마틴 과립 추출물이 도파민 수용체 D3에서 활성 히트로서의 유효성을 확인하는 퀸피롤에 반 최대 유효 농도 값으로 유사한 신호 창을 생성한다는 것을 입증했다. 음의 대조군과 유사한 평평한 투여 곡선은 opsin 5에 대해 생산되었지만 이 수용체를 크롬마틴 과립 추출물에 대한 가능한 표적으로 배제하였다. 프레스토 탱고는 세포 분포, 경질 효율 및 직렬 약물 희석의 가변성이 복합 오차를 초래할 수 있기 때문에 특별한 주의를 기울여야 하며 이는 데이터의 정확성에 영향을 미칠 수 있습니다.Radioligand 결합 접근법, 생물 발광 공명 에너지 전송 및 순환 AMP 칼슘 및 내재 작용과 같은 직교 방법은 리간드 수용체 상호 작용을 더 확인하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

핵산 프로브를 이용한 뉴클레아제 활성의 운동 스크리닝

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...