Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institutes of Health Research (CIHR-tilskudd #MOP142219).

1. Primær screening: cellekultur og plateseeding
<ol><li>For å forberede poly-L-lysine (PLL)-belagte plater, dispenser 20 μL/brønn på en 25 μg/ml lageroppløsning av PLL i hvite eller svarte 384-brønnoptiske bunnplater ved hjelp av en elektronisk flerkanals pipette eller en reagensdispenser. Inkuber platene ved romtemperatur i 0,5–2 timer. MERK: Hvis du bruker de svarte 384-brønnplatene, forventer bakgrunnssignalet å være lavere sammenlignet med de hvite platene. Svarte plater anbefales å redusere gjenn...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

De konformasjonsdynamiske GPCRs er kraftstasjoner av signaltransduksjon. De fysiokjemiske egenskapene til de bindende lommene til disse heptahelical reseptorene, samt deres fysiologiske relevans understreker behovet for GPCR ligand screening verktøy. Som presentert ovenfor, presto-tango analysen er rask, følsom og brukervennlig, utlån seg til narkotikautvikling. Ikke bare måler denne analysen agonist-indusert aktivering, men den kan også brukes til å kvantifisere aktiviteten til antagonister og allosteric modulator...

G-protein-koblede reseptorer (GPCRs) utgjør den største og mest varierte familien av transmembrane proteiner, opererer som kommunikasjonsgrensesnitt mellom en celle og dens miljø1. Allsidigheten til GPCRs fremheves av deres evne til å oppdage et variert utvalg av ligander – fra nevrotransmittere til nukleotider, peptider til fotoner, og mange flere – samt deres evne til å regulere mange nedstrøms signalkaskader involvert i cellulær vekst, migrasjon, differensiering, apoptose, celleavfyring, etc.2,3. Tatt i betraktning deres ubiquity og engasjement i en rekke fysiologiske prosesser, er denne reseptorfamilien av største terapeutisk betydning, vist av det faktum at mer enn en tredjedel av for tiden tilgjengelige foreskrevne medisiner retter seg mot GPCRs4. Imidlertid retter disse eksisterende terapeutiske bare mot en liten undergruppe av superfamilien (anslagsvis 10%), og farmakologien til mange GPCRs forblir uklar. Videre finnes mer enn 100 GPCRs som foreldreløse reseptorer, da de ikke har blitt matchet med en endogen ligand5. Dermed er GPCR ligand screening kritisk i deorphanization og narkotikautvikling, da det baner veien mot blyoppdagelse og optimalisering, og muligens til den kliniske studiefasen.
Metoder for GPCR ligand screening har tradisjonelt falt i en av to kategorier, G-protein avhengige eller G-protein uavhengig funksjonell analyser6. GPCR-signalering reguleres av heterotrimeric G-proteiner (Gαβγ), som aktiveres ved utveksling av GTP for BNP bundet på Gα-underenheten7. Signaler fra den aktiverte reseptoren overføres av G-proteiner via sekundære budbringere, for eksempel cAMP, Calcium, DAG og IP3, for å megle nedstrøms signalering ved nedstrøms effektorer8. Arten av de funksjonelle konsekvensene av G-protein signalering har blitt utnyttet til å lage cellebaserte analyser som gjenspeiler reseptoraktivering. Disse metodene, som måler proksimale (direkte) eller distale (indirekte) hendelser i G-proteinsignalering, brukes oftest til GPCR ligand screening og har hovedsakelig vært ansatt i deorphanization studier6. Eksempler på analyser som direkte måler GPCR-mediert G-proteinaktivering inkluderer [35S]GTPγS bindingsanalyse, som måler binding av en radiomerket og ikke-hydrolyzable GTP analog til Gα-underenheten, og Förster/bioluminescence resonansenergioverføring (HENHOLDSVIS FRET/BRET) for å overvåke GPCR-Gα- og Gα/Gγ-interaksjoner, som har fått mer trekkraft gjennom årene9,10. Analyser som overvåker distale hendelser er de mest brukte verktøyene for GPCR-profilering; for eksempel, cAMP og IP1/3 analyser måle intracellulær akkumulering av G-protein avhengige sekundære budbringere, mens [Ca2 +] flux og reporter analyser som involverer spesifikke responselementer involvert i G-protein aktivering (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) undersøke hendelser videre nedstrøms signalkaskade11. Mens de fleste av de nevnte analyser kan utføres på et høyt gjennomstrømningsnivå, er ganske følsomme, og skryte av visse analysespesifikke fordeler (f.eks. diskriminering mellom full/delvis agonister, nøytrale antagonister og inverse agonister i tilfelle gtpγs binding, eller analysefunksjonalitet på levende celler som [Ca2 +] og IP1/3)6, er det dessverre ingen eksisterende G-proteinavhengige metoder som passer til avhør av hele druggable GPCR-ome. Dette skyldes i stor grad den innfødte koblingen av flere G-protein subfamilies til GPCRs, noe som resulterer i signalering på flere kaskader og ukjent G-protein kobling på foreldreløse GPCRs. For å redusere dette problemet, analyser har blitt utviklet for å tvinge promiskuøse G-protein kobling gjennom en enkelt felles signalavlesning, for eksempel cAMP, og Ca2 +, om enn de fleste av dem er lav-gjennomstrømning12.
Et viktig aspekt ved GPCR-livssyklusen er avslutningen av G-proteinavhengig signalisering, som i stor grad oppstår gjennom rekruttering av β-arrestiner som induserer dissosiasjon av G-proteinet, og til slutt desensimere reseptoren, som er rettet mot klathrinbelagt internalisering13. De mest allestedsnærværende uttrykte isoformene av β-arrestin er de ikke-visuelle β-arrestin1 og β-arrestin2, også betegnet som arrestin-2 og arrestin-3, henholdsvis14. Skriv inn G-protein uavhengige cellebaserte analyser, som legger til en ny dimensjon til GPCR ligand screening; reseptorhandel, etikettfri hele celle, og β-arrestin rekruttering analyser er alle bemerkelsesverdige eksempler. GPCR-smuglingsanalyser bruker fluorofanermerket ligander eller saminternaliserte antistoffer rettet mot reseptoren15, mens etikettfrie hele celleanalyser bruker biosensorer som oversetter cellulære endringer indusert av ligandbinding til kvantifiserbare utganger, for eksempel elektriske eller optiske signaler16. Spesielt, quintessential GPCR- β-arrestin interaksjoner mote β-arrestin rekruttering analyse som et attraktivt verktøy i repertoar av funksjonelle analyser17. Tango-systemet, først utviklet av Barnea et al. for bare et tiår siden, innebærer innføring av tre eksogene genetiske elementer: en proteinfusjon bestående av β-arrestin2 med en tobakketsevirusprotease (TEVp), en tetracyklintransactivator (tTA) som er bundet til en GPCR via et tobakksetse virus protease cleavage site (TEVcs) og innledes med en sekvens fra C-terminus av V2 vasopressin reseptoren (V2 hale) for å fremme arrestin rekruttering, og en reporter luciferase genet hvis transkripsjon utløses av tTA transkripsjonfaktor translokasjon til kjernen, som frigjøres fra membranen forankring etter β-arrestin2 rekruttering (Figur 1)18. Kvantitative avlesninger av GPCR-aktivering og β-arrestin2 rekruttering kan senere bestemmes ved å lese for luminescens. Et bemerkelsesverdig skille er at mens reseptorhandel og etikettfrie hele cellemetoder er relativt lav gjennomstrømning, har Tango flere fordeler, inkludert selektiv avlesning som er spesifikk for målreseptoren og følsomheten på grunn av signalintegrasjon, noe som gjør den til en passende kandidat for ligandscreening i større skala18.
I lys av disse strategiske funksjonene utviklet Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), en høygjennomstrømnings plattform med åpen kildekode som bruker Tango-tilnærmingen til å profilere den druggable GPCR-ome på en parallell og samtidig måte19. Ved å utnytte den "promiskuøse" rekrutteringen av β-arrestin2 til nesten alle GPCRs, er PRESTO-Tango den første av sitt slag når det gjelder cellebaserte funksjonelle analyser, noe som muliggjør rask "første runde" screening av små molekylforbindelser ved nesten alle ikke-olfaktoriske GPCRs, inkludert foreldreløse, uavhengig av G-protein subfamily kobling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Som den største og mest allsidige gensuperfamilien og meklerne av et spekter av cellulære signalveier, representerer G-protein-koblede reseptorer (GPCRs) et av de mest lovende målene for den farmasøytiske industrien. Ergo, design, implementering og optimalisering av GPCR ligand screening analyser er avgjørende, da de representerer fjernstyringsverktøy for narkotikaoppdagelse og for manipulering av GPCR-farmakologi og resultater. Tidligere har G-proteinavhengige analyser preget dette forskningsområdet, oppdageligoginduserte hendelser og kvantifisere generering av sekundære budbringere. Men siden bruk av funksjonell selektivitet, samt økt bevissthet om flere andre G protein-uavhengige veier og begrensningene forbundet med G-proteinavhengige analyser, er det et større press mot etableringen av alternative GPCR ligand screening analyser. Mot dette arbeidet beskriver vi anvendelsen av en slik ressurs, PRESTO-Tango-plattformen, et luciferase reporterbasert system som muliggjør parallell og samtidig avhør av den menneskelige GPCR-ome, en prestasjon som tidligere ble ansett som teknisk og økonomisk umulig. Basert på en G-protein uavhengig β-arrestin2 rekrutteringsanalyse, universaliteten av β-arrestin2-mediert menneskehandel og signalisering ved GPCRs gjør PRESTO-TANGO til et passende verktøy for å studere ca 300 ikke-olfaktoriske menneskelige GPCRs, inkludert ca. 100 foreldreløse reseptorer. PRESTO-Tangos følsomhet og robusthet gjør den egnet for primære skjermer med høy gjennomstrømning ved hjelp av sammensatte biblioteker, ansatt for å avdekke nye GPCR-mål for kjente stoffer eller å oppdage nye ligander for foreldreløse reseptorer.

Ved hjelp av PRESTO-Tango-protokollen som presenteres her, ble et kromparagranul (CG) ekstrakt screenet mot 168 ikke-olfaktoriske GPCR-mål, og de fleste var foreldreløse reseptorer. Profilering av nevnte ekstrakt ble utført ved å undersøke β-arrestin2 mobilisering ved de valgte reseptorene, basert på prinsippet designet av Barnea et al.18 (Figur 1). Plasmid cDNA av GPCRs av interesse ble tatt fra PRESTO-Tango GPCR Kit og satt sammen i to 96 brønnplater i ønsk...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Gitt at GPCRs er attraktive druggable mål, GPCR ligand screening er dermed uunnværlig for identifisering av bly forbindelser og for deorphanization studier. Mot dette arbeidet beskriver vi PRESTO-Tango, en åpen kildekode-ressursplattform som brukes til samtidig profilering av forbigående β-arrestin2-rekruttering på ca. 300 GPCRs ved hjelp av en TEV-basert reporteranalyse.

Parallell avhør av β-Arrestin2 Rekruttering for Ligand Screening på en GPCR-wide Scale ved hjelp av PRESTO-Tango Analyse

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Presto-Tango-plattformen ble utviklet for å gjennomføre parallelle og samtidige avhør av alle ikke-olfaktoriske GPCRs i det menneskelige genomet, inkludert at foreldreløse mål til profil ligand-indusert beta-arresti 2 rekruttering. Presto-Tango-plattformen er den eneste åpen kildekode-ressursen for profilering av hele GPCR-genomet i en parallell tilnærming, ved hjelp av en G-protein uavhengig beta-arresti rekrutteringsanalyse. Å demonstrere prosessoren ville være Genevieve Laroche en forskningsmedarbeider i laboratoriet mitt, og Manel Zighal, en ph.d.-kandidat i laboratoriet mitt.Før du begynner prosedyren legge til 20 mikroliter av en 25 mikrogram per milliliter poly-L-lysin løsning til hver brønn av riktig eksperimentell antall 384 optiske bunnplater og inkubere platene ved romtemperatur i 30 minutter til to timer. På slutten av inkubasjonen sveiper platene over vasken for å fjerne overflødig poly-L-lysin og tilsett 40 mikroliter antibiotika antimykotisk løsning til hver brønn. Deretter inkubere platene som trengs for cellesåing ved 37 grader Celsius og plasser resten av platene på fire grader Celsius for langsiktig lagring.For å så HTLA-celler for primærscreening, skyll forsiktig samtidige 150 millimeter cellekulturer med 10 milliliter PBS før du behandler kulturene med seks milliliter på 0,05% trypsin EDTA per tallerken. Når cellene har frittliggende basseng cellen suspensjoner i en 50 milliliter konisk rør som inneholder et likt volum av DMEM. Og samle cellene ved sentrifugering.Re-suspendere pellet på en 2,2 ganger 10 til femte celler per milliliter DMEM konsentrasjon og knipse platene over vasken for å fjerne antibiotika antimykotisk løsning. Trykk platene for å tørke og frø 45 mikroliter celler i hver brønn. Plasser deretter platene ved 37 grader Celsius og 45% karbondioksid over natten.For å forberede 384 brønn DNA kildeplate for transfection distribuere 50 nanograms per milliliter av hver plasmid gratis DNA koding GPRC Tango konstruksjon av interesse i 0,1X Tris-EDTA per godt inn i hver brønn av en 96 brønnplate. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 10 mikroliter dna-løsning manuelt fra hver brønn av 96-brønnplaten til individuelle brønner av en 384-brønns DNA-kildeplate i quadruplicate for hver tilstand som illustrert. Deretter overfører du 40 mikroliter av en 0,313 molar kalsiumkloridløsning til hver brønn av DNA-kildeplaten og blander forsiktig innholdet i hver brønn.Tilsett 50 mikroliter 2x HEPES-buffer til hver brønn av 384-brønnens DNA-kildeplate med skånsom blanding. Etter ett minutt overføre 10 mikroliter av DNA transfection blanding fra 384 godt DNA kildeplate til hver brønn av seeded HTLA celler og inkubere cellene i cellekulturinkubatoren over natten. Neste dag dekantere transfected celle medium og sakte legge til 40 mikroliter av sultende medium til hver godt tar vare ikke å røre cellene direkte.Legg deretter til 20 mikroliter av kjøretøybufferen for de vekslende radene uten forbindelse i 20 mikroliter av interesseforbindelsen ved en tre ganger konsentrasjon i de vekslende radene, før platen returneres til cellekulturinkubatoren. 16 til 24 timer etter stimulering dekantere trans infisert celle medium og legge til 20 mikroliter av nylaget glød reagens til hver brønn i en fem til 20 minutters inkubasjon ved romtemperatur beskyttet mot lys. Les deretter platene på en mikroplate luminescence teller med en integrasjonstid på ett sekund per brønn.For en sekundær screening, subkultur HTLA cellene i 100 millimeter retter på en fem ganger 10 til de seks cellene total celle tetthet i 11 millimeter komplett medium per tallerken i 24 timer ved 37 grader Celsius. Neste dag blandet 10 mikrogram GPCR gratis DNA med 500 mikroliter Tris-EDTA kalsiumkloridoppløsning med vortexing etterfulgt av tillegg av 500 mikroliter HEPES-buffer. Etter kraftig risting, inkuber løsningen i ett minutt ved romtemperatur og legg umiddelbart til en milliliter av oppløsningen faller klokt på cellene.Stein forsiktig for å fordele bunnstippet og plasser platen ved 37 grader Celsius i 24 timer. Neste dag, sjekk transfection effektivitet under en fluorescerende celle imager. Transaksjoner som er større enn 50 % dekning, er ideelle.Skyll forsiktig de trans infiserte cellene med versenoppløsning før du løsner cellene med tre milliliter på 0,05% trypsin EDTA. Samle dissosierte celler ved sentrifugering og re-suspendere pellet på en fire ganger 10 til de femte cellene per milliliter sultende middels konsentrasjon. Deretter frø 45 mikroliter av celler i hver brønn av en poly-L-lysin kodet 384 brønnplate og plasser platen i cellekulturinkubatoren i minst fire timer.For å forberede en halv logg dose-kurve responsplate tilsett 270 mikroliter HBSS supplert med HEPES og antibiotika antimykotisk til alle, men den siste raden av en 96 brønnplate og tilsett 30 mikroliter av hver høy og lav legemiddelløsning til brønnene i rad H.Overfør løsningen fra hver brønn av rad H inn i tilsvarende brønn av rad G med blanding og fortsett å fortynning av stoffet til siste rad av platen er nådd. Bruk skjematisk som referanse, bland 20 mikroliter av de lave kolonnefortynningene fra rad A til G av 96-brønnplaten og 20 mikroliter av de høye kolonnefortynningene til brønner B til H av 96-brønnplaten til den tidligere sittende 384 brønnplaten. Deretter inkubere platen ved 37 grader Celsius i minst 16 timer.16 til 24 timer etter stimulering dekantere trans infisertcellemedium og legge til 20 mikroliter glød reagens til hver brønn i en fem til 20 minutters inkubasjon før du leser platene på en mikroplate luminescence teller med en integrasjonstid på ett sekund per brønn. I dette representative eksperimentet, av de 168 GPCRs som ble avhørt i primærscreeningen, var bare dopaminreseptor D3 og opsin 5 utfordrere som potensielle aktive mål. Dopaminreseptor D3 ga en signifikant log2 ganger endring på 4,7 mens opsin 5 ga en noe lavere respons på 2,39.Til sammenligning, dopamin reseptor D2, den positive kontrollen for den primære skjermen produsert en log2 fold endring av 4,58. Disse responskurvene fra den sekundære screeningen viste at kromatingranulatekstrakt produserer lignende signalvinduer i halvparten maksimale effektive konsentrasjonsverdier til quinpiol som bekrefter gyldigheten som et aktivt treff på dopaminreseptor D3. En flat dosekurve som ligner på den negative kontrollen ble produsert for opsin 5, men utelukker denne reseptoren som et mulig mål for kromatingranulatekstraktet. Presto-Tango krever spesiell forsiktighet som variasjoner i celledistribusjon, transfection effektivitet og serielle narkotika fortynninger kan resultere i sammensatte feil, noe som kan påvirke nøyaktigheten av dataene.Ortogonale metoder som Radioligand-bindende tilnærminger, Bioluminescence Resonance Energy Transfer og Cyclic AMP kalsium- og internaliseringsfunksjonelle analyser kan brukes til å ytterligere bekrefte og karakterisere ligand reseptorinteraksjoner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som metode for å bestemme dissosiasjon konstant reseptor Ligand interaksjon

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalaproduksjon av rekombinant RNAs på en sirkulær stillaset med en Viroid-avledet System i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetic screening av Nuklease aktivitet ved hjelp nukleinsyre acid sonder

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening for fytoøstrogener ved hjelp av en cellebasert østrogenreseptor β Reporter Analyse

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...