Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR grant #MOP142219).

1. Triagem primária: cultura celular e semeada de placas
<ol><li>Para preparar placas revestidas de poli-L-lysina (PLL), dispense 20 μL/poço de uma solução de 25 μg/mL de pll em placas inferiores ópticas brancas ou pretas de 384 poços usando uma pipeta multicanal eletrônica ou um dispensador de reagente. Incubar as placas à temperatura ambiente por 0,5-2 h. NOTA: Se usar as placas pretas de 384 poços, espere que o sinal de fundo seja menor em comparação com as placas brancas. Placas pretas são recomend...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. 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S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

Os GPCRs conformacionalmente dinâmicos são potências de transdução de sinal. As propriedades fisioquímicas dos bolsos de ligação desses receptores heptaéricos, bem como sua relevância fisiológica ressaltam a necessidade de ferramentas de triagem de ligantes GPCR. Como apresentado acima, o ensaio PRESTO-Tango é rápido, sensível e fácil de usar, emprestando-se ao desenvolvimento de medicamentos. Este ensaio não só mede a ativação induzida por agonistas, mas também pode ser usado para quantificar a ativi...

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior e mais diversificada família de proteínas transmembranas, operando como interfaces de comunicação entre uma célula e seu ambiente1. A versatilidade dos GPCRs é destacada por sua capacidade de detectar uma variedade diversificada de ligantes – de neurotransmissores a nucleotídeos, peptídeos a fótons, e muito mais – bem como sua capacidade de regular numerosas cascatas de sinalização a jusante envolvidas no crescimento celular, migração, diferenciação, apoptose, disparo celular, etc.2,3. Considerando sua ubiquidade e envolvimento em uma infinidade de processos fisiológicos, essa família receptora é de extrema importância terapêutica, demonstrada pelo fato de que mais de um terço dos medicamentos prescritos atualmente disponíveis têm como alvo as RPCRs4. No entanto, essas terapêuticas existentes visam apenas um pequeno subconjunto da superfamília (estimado em 10%), e a farmacologia de muitos GPCRs permanece inelucidada. Além disso, existem mais de 100 GPCRs como receptores órfãos, pois não foram combinados com um ligante endógeno5. Assim, a triagem de ligantes gpcr é fundamental na desordeirização e desenvolvimento de medicamentos, pois pavimenta o caminho para a descoberta e otimização de chumbo, e possivelmente para a fase de ensaio clínico.
Os métodos de triagem de ligantes GPCR tradicionalmente caíram em uma das duas categorias, ensaios funcionais independentes de proteína G ou g-proteína6. A sinalização GPCR é regulada por proteínas G heterotriméricas (Gαβγ), que são ativadas pela troca de GTP por PIB vinculado à subunidade Gα7. Os sinais do receptor ativado são transprovocados por proteínas G através de mensageiros secundários, como cAMP, Cálcio, DAG e IP3, para mediar a sinalização a jusante em efeitos a jusante8. A natureza das consequências funcionais da sinalização da proteína G tem sido explorada para criar ensaios baseados em células que refletem a ativação do receptor. Esses métodos, que medem eventos proximais (diretos) ou distais (indiretos) na sinalização de proteína G, são mais utilizados para a triagem de ligantes GPCR e têm sido empregados principalmente em estudos de desordeiro6. Exemplos de ensaios que medem diretamente a ativação de proteína G mediada pelo GPCR incluem o ensaio de ligação [35S]GTPγS, que mede a vinculação de um GTP radiorotulado e não hidrolisavel análogo à subunidade Gα, e sondas de transferência de energia de ressonância förster/bioluminescência (FRET/BRET, respectivamente) para monitorar as interações GPCR-Gα e Gα/Gγ, que vêm ganhando mais tração ao longo dos anos9,10. Ensaios que monitoram eventos distais são as ferramentas mais utilizadas para a criação de perfis de GPCR; por exemplo, os ensaios cAMP e IP1/3 medem o acúmulo intracelular de mensageiros secundários dependentes da proteína G, enquanto os ensaios de fluxo e repórter [Ca2+]envolvendo elementos de resposta específicos implicados na ativação da proteína G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) examinam eventos mais a jusante da cascata de sinalização11. Embora a maioria dos ensaios acima mencionados possa ser realizada em um nível de alta duração, são bastante sensíveis, e possuem certas vantagens específicas do ensaio (por exemplo, discriminação entre agonistas completos/parciais, antagonistas neutros e agonistas inversos no caso da ligação GTPγS, ou funcionalidade de ensaio em células vivas como [Ca2+] e IP1/3)6, infelizmente não existem métodos dependentes de proteína G condizentes com o interrogatório de todo o GPCR-ome drogado. Isso se deve em grande parte ao acoplamento nativo de múltiplas subfamílias de proteína G aos GPCRs, resultando em sinalização em várias cascatas e o acoplamento desconhecido de proteína G em GPCRs órfãos. Para mitigar esse problema, foram desenvolvidos ensaios para forçar o acoplamento promíscuo de proteína G através de uma única leitura de sinalização comum, como cAMP, e Ca2+,embora a maioria deles seja de baixa produção12.
Um aspecto importante do ciclo de vida do GPCR é o término da sinalização dependente da proteína G, que ocorre em grande parte através do recrutamento de β-arrestins que induz a dissociação da proteína G, e, em última análise, dessensibilização do receptor, que é direcionado para a internalização revestida de clatina13. As isoformas mais expressas de β-arrestin são as β-arrestin1 e β-arrestin2 não-visuais, também denotadas como prisões em-2 e prisões em-3, respectivamente14. Insira ensaios baseados em células independentes de proteína G, que adicionam uma nova dimensão à triagem de ligantes GPCR; tráfico de receptores, célula inteira sem rótulos e β-arrestem em ensaios de recrutamento são todos exemplos notáveis. Os ensaios de tráfico do GPCR empregam ligantes rotulados com fluoroforo ou anticorpos co-internalizados direcionados ao receptor15, enquanto os ensaios celulares inteiros sem rótulos usam biosensores que traduzem alterações celulares induzidas por ligantes em saídas quantificáveis, como sinais elétricos ou ópticos16. Notavelmente, o quintessencial GPCR-β-arrestin interações forma o β-arrestin recrutamento como uma ferramenta atraente no repertório de ensaios funcionais17. O sistema Tango, desenvolvido pela primeira vez por Barnea et al. apenas uma década atrás, envolve a introdução de três elementos genéticos exógenos: uma fusão de proteínas constituída por β-arrestin2 com um vírus etch protease (TEVp), um transativador tetraciclina (TTA) que é amarrado a um GPCR através de um tabaco e tch vírus protease site (TEVcs) e é precedido por uma seqüência do C-terminus do receptor de vasopressina V2 (cauda V2) para promover a prisão no recrutamento, e um gene de luciferase repórter cuja transcrição é desencadeada pelo translocação do fator de transcrição tTA para o núcleo, que é libertado da ancoragem da membrana após β-arrestin2 recrutamento (Figura 1)18. Leituras quantitativas de ativação do GPCR e recrutamento β-arrestin2 podem ser posteriormente determinadas pela leitura para luminescência. Uma distinção notável é que, embora o tráfico de receptores e os métodos celulares inteiros sem rótulos sejam relativamente baixos, o Tango tem várias vantagens, incluindo leitura seletiva específica do receptor alvo e sensibilidade devido à integração de sinais, o que o torna um candidato adequado para a triagem de ligantes em uma escala maior18.
Em vista dessas características estratégicas, Kroeze et al. desenvolveram presto-tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), uma plataforma de código aberto de alto throughput que usa a abordagem Tango para traçar o perfil do GPCR-ome drogado de forma paralela e simultânea19. Explorando o recrutamento "promíscuo" de β-arrestin2 para quase todos os GPCRs, presto-tango é o primeiro de seu tipo em termos de ensaios funcionais baseados em células, permitindo uma rápida triagem "primeira rodada" de pequenos compostos de moléculas em quase todos os GPCRs não olfativos, incluindo órfãos, independente do acoplamento subfamiliar de proteína G.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Como a maior e mais versátil superfamília genética e mediadora de uma gama de vias de sinalização celular, os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) representam um dos alvos mais promissores para a indústria farmacêutica. Em medida, o projeto, a implementação e a otimização dos ensaios de triagem de ligadores GPCR são cruciais, pois representam ferramentas de controle remoto para a descoberta de medicamentos e para manipular a farmacologia e os resultados do GPCR. No passado, ensaios dependentes de proteína G tipificavam essa área de pesquisa, detectando eventos induzidos por ligantes e quantificando a geração de mensageiros secundários. No entanto, desde o advento da seletividade funcional, bem como uma maior consciência de várias outras vias independentes da proteína G e as limitações associadas aos ensaios dependentes da proteína G, há um maior impulso para a criação de alternativas Ensaios de triagem de ligais GPCR. Para este esforço, descrevemos a aplicação de um desses recursos, a plataforma PRESTO-Tango, um sistema baseado em repórteres de luciferase que permite o interrogatório paralelo e simultâneo do GPCR-ome humano, um feito que foi previamente considerado tecnicamente e economicamente inviáveis. Com base em um ensaio de recrutamento β-arrestin2 independente de proteína G, a universalidade do tráfico e sinalização mediados por β-arrestin2 em GPCRs faz do PRESTO-TANGO uma ferramenta adequada para estudar aproximadamente 300 GPCRs humanos não olfativos, incluindo aproximadamente 100 receptores órfãos. A sensibilidade e a robustez do PRESTO-Tango tornam-no adequado para telas primárias de alto desempenho usando bibliotecas compostas, empregadas para descobrir novos alvos de GPCR para drogas conhecidas ou para descobrir novos ligantes para receptores órfãos.

Utilizando-se o protocolo PRESTO-Tango aqui apresentado, um extrato de granulo de cromafina (CG) foi examinado contra 168 alvos não olfativos do GPCR, sendo a maioria receptores órfãos. O perfil do referido extrato foi realizado examinando a mobilização β-arrestin2 nos receptores escolhidos, com base no princípio desenhado por Barnea et al.18 (Figura 1). O cDNA plasmático dos GPCRs de interesse foi retirado do Kit GPCR PRESTO-Tango e montado em duas 96 placas-...

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Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Dado que os GPCRs são alvos atraentes para drogados, a triagem de ligantes GPCR é, portanto, indispensável para a identificação de compostos de chumbo e para estudos de desordeiro. Para esses esforços, descrevemos o PRESTO-Tango, uma plataforma de recursos de código aberto usada para o perfil simultâneo de recrutamento transitório β-arrestin2 em aproximadamente 300 GPCRs usando um ensaio de repórter baseado em TEV.

Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

A plataforma Presto-Tango foi concebida para executar o interrogatório paralelo e simultâneo de todos os GPCRs não olfativos no genoma humano, incluindo aqueles alvos órfãos para traçar o perfil de beta-detenção induzido por ligante no recrutamento 2. A plataforma Presto-Tango é o único recurso de código aberto para traçar o perfil de todo o genoma do GPCR em uma abordagem paralela, usando um ensaio de recrutamento de beta-arrestin independente de proteína G. Demonstrando que o processador seria Genevieve Laroche, uma pesquisadora associada no meu laboratório, e Manel Zighal, um doutorando no meu laboratório.Antes de iniciar o procedimento adicione 20 microlitadores de uma solução de 25 microgramas por mililitro de poli-L-lysina a cada poço do número experimental apropriado de 384 placas de fundo óptico e incubar as placas em temperatura ambiente por 30 minutos a duas horas. No final da incubação, passe as placas sobre a pia para remover o excesso de poli-L-lysine e adicione 40 microliters de solução antimíctica antimíctica antibiótico para cada poço. Em seguida, incubar as placas necessárias para semeadura celular a 37 graus Celsius e colocar o resto das placas a quatro graus Celsius para armazenamento a longo prazo.Para as células HTLA sementes para triagem primária, enxágue suavemente culturas celulares confluentes de 150 milímetros com 10 mililitros de PBS antes de tratar as culturas com seis mililitros de 0,05% de trippsina EDTA por prato. Quando as células possuem piscina separada as suspensões celulares em um tubo cônico de 50 mililitros contendo um volume igual de DMEM. E coletar as células por centrifugação.Suspenda a pelota em 2,2 vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração de DMEM e pise as placas sobre a pia para remover a solução antimíctica antimíctica antimíctica antibiótico. Toque nas placas para secar e semear 45 microliters de células em cada poço. Em seguida, coloque as placas a 37 graus Celsius e 45% de dióxido de carbono durante a noite.Para preparar a placa de origem de DNA 384 para transfecção distribua 50 nanogramas por mililitro de cada DNA plasmídeo de cortesia codificando a construção gprc tango de interesse em 0,1X Tris-EDTA por poço em cada poço de uma placa de poço 96. Use uma pipeta multicanal para transferir manualmente 10 microliters de solução de DNA de cada poço da placa de poço 96 para poços individuais de uma placa de 384 bem de DNA em quadruplicar para cada condição como ilustrado. Em seguida, transfira 40 microlitadores de uma solução de cloreto de cálcio molar de 0,313 para cada poço da placa de origem do DNA e misture suavemente o conteúdo de cada poço.Adicione 50 microliters de 2x tampão HEPES a cada poço da placa de origem de DNA 384 bem com mistura suave. Após um minuto, transfira 10 microlitadores da mistura de transfecção de DNA da placa de 384 bem-fonte de DNA para cada poço de células HTLA semeadas e incubar as células da incubadora de cultura celular durante a noite. No dia seguinte, decantar o meio celular transfectado e lentamente adicionar 40 microliters de meio faminto a cada poço, tomando cuidado para não tocar diretamente nas células.Em seguida, adicione 20 microliters do tampão do veículo para as linhas alternadas sem composto em 20 microliters do composto de juros em uma concentração de três vezes nas linhas alternadas, antes de devolver a placa à incubadora de cultura celular. 16 a 24 horas após a estimulação decantar o meio celular transfectado e adicionar 20 microliters de reagente de brilho recém-preparado a cada poço para uma incubação de cinco a 20 minutos à temperatura ambiente protegido da luz. Em seguida, leia as placas em um balcão de luminescência de microplaca com um tempo de integração de um segundo por poço.Para uma triagem secundária, subcultura as células HTLA em pratos de 100 milímetros a cinco vezes 10 para as seis células densidade total celular em 11 milímetros de meio completo por prato por 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, misturou 10 microgramas de DNA gratuito GPCR com 500 microliters de solução de cloreto de cálcio Tris-EDTA com vórtice seguido pela adição de 500 microliters de tampão HEPES. Após um tremor vigoroso, incubar a solução por um minuto à temperatura ambiente e adicionar imediatamente um mililitro da solução cair sábio nas células.Balance suavemente para distribuir uniformemente o precipitado e coloque a placa a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, verifique a eficiência da transfecção sob um imager celular fluorescente. Transações superiores a 50% de cobertura são ideais.Enxágue suavemente as células transfeinadas com solução de verseno antes de desprender as células com três mililitros de 0,05% de trippsina EDTA. Colete as células dissociadas por centrifugação e suspenda a pelota em quatro vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média faminta. Em seguida, semente 45 microliters de células em cada poço de uma placa de poço codificada 384 poli-L e colocar a placa na incubadora de cultura celular por pelo menos quatro horas.Para preparar uma placa de resposta de meia dose de log- curva adicionar 270 microliters de HBSS complementados com HEPES e antibiótico antimíctico para todos, exceto a última linha de uma placa de 96 poços e adicionar 30 microliters de cada solução de drogas alta e baixa para os poços da linha H.Transfira a solução de cada poço de linha H para o poço correspondente da linha G com mistura e continue a diluir serialmente os compostos compostos até a última linha da placa é alcançado. Utilizando o esquema como referência, misture 20 microlitadores das diluições da coluna baixa das linhas A a G da placa de 96 poços e 20 microliters das diluições da coluna alta aos poços B a H da placa de 96 poços até a placa de poço 384 anteriormente sentada. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por um mínimo de 16 horas.16 a 24 horas após a estimulação decantar o meio celular transfectado e adicionar 20 microliters de reagente de brilho a cada poço para uma incubação de cinco a 20 minutos antes de ler as placas em um balcão de luminescência de micro placa com um tempo de integração de um segundo por poço. Neste experimento representativo, dos 168 GPCRs que foram interrogados na triagem primária, apenas o receptor de dopamina D3 e o opsin 5 eram candidatos como alvos ativos potenciais. O receptor de dopamina D3 produziu uma alteração significativa de 4,7 vezes, enquanto a opsina 5 produziu uma resposta ligeiramente menor de 2,39.Em comparação, o receptor de dopamina D2, o controle positivo para a tela primária produziu uma alteração de 4,58 de 2008. Essas curvas de resposta da triagem secundária demonstraram que o extrato de grânulo de cromatina produz janelas de sinal semelhantes em valores de concentração efetivas semi-máximas para quinpirole confirmando sua validade como um golpe ativo no receptor de dopamina D3. Uma curva de dose plana semelhante ao controle negativo foi produzida para opsina 5, porém descartando este receptor como um possível alvo para o extrato do grânulo de cromatina. Presto-Tango requer cuidados especiais, pois variabilidades na distribuição celular, eficiência de transfecção e diluições de drogas seriais podem resultar em erro composto, o que pode afetar a precisão dos dados.Métodos ortogonais como abordagens de radioligand vinculante, Transferência de Energia de Ressonância de Bioluminescência e ensaios funcionais de cálcio e internalização Cíclico AMP podem ser usados para confirmar e caracterizar ainda mais as interações entre ligas e receptores.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titulação ELISA como um método para determinar a constante de dissociação de interação do ligante do Receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...