Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Эта работа была поддержана Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR грант #MOP142219).

1. Первичный скрининг: культура клеток и посев пластин
<ol><li>Для приготовления поли-L-лизин (PLL) покрытием пластин, обойтись 20 л /хорошо 25 мкг/мл бульона раствор PLL в белом или черном 384-пуговый оптический нижний пластины с помощью электронного многоканального пипетка или реагента дозатор. ?...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

Конформно динамические GPCRs являются электростанциями трансдукции сигналов. Физиохимические свойства связывающих карманов этих гептахелевых рецепторов, а также их физиологическая актуальность подчеркивают необходимость инструментов скрининга лиганда GPCR. Как указано выше, престо-Та...

G-белковые рецепторы (GPCRs) представляют собой самое большое и разнообразное семейство трансмембранных белков, работающих в качестве связующих интерфейсов между клеткой и ее окружающей средой1. Универсальность GPCRs подчеркивается их способность обнаруживать разнообразный спектр лигандов от нейротрансмиттеров до нуклеотидов, пептидов до фотонов, и многое другое, а также их способность регулировать многочисленные вниз по течению сигнальных каскадов, участвующих в клеточном росте, миграции, дифференциации, апоптоза, стрельбы клеток и т.д.2,3. Учитывая их повсеместность и участие во множестве физиологических процессов, это семейство рецепторов имеет первостепенное терапевтическое значение, продемонстрированное тем фактом, что более трети имеющихся в настоящее время предписанных лекарств нацелены на GPCRs4. Тем не менее, эти существующие терапевтические только целевой небольшой подмножество суперсемьи (по оценкам, 10%), и фармакология многих GPCRs остается необезвеченной. Кроме того, более 100 GPCRs существуют как сиротские рецепторы, так как они не были сопоставлены с эндогеннымлигандом 5. Таким образом, скрининг GPCR ligand имеет решающее значение в дефанфанизации и разработке лекарств, поскольку он прокладывает путь к открытию и оптимизации свинца, и, возможно, к стадии клинических испытаний.
Методы скрининга GPCR ligand традиционно упали в одной из двух категорий, G-белковая зависимость или G-белок независимых функциональных анализов6. Сигнализация GPCR регулируется гетеротримыми G-белками (ГЗЗ), которые активируются в виде обмена GTP на ВВП, связанных на субъединице7. Сигналы от активированного рецептора передаются G-белками через вторичные посланники, такие как cAMP, Кальций, DAG и IP3, чтобы посредничать вниз по течению сигнализации на вниз по течению эффекторов8. Характер функциональных последствий G-белковой сигнализации был использован для создания клеточных анализов, которые отражают активацию рецепторов. Эти методы, которые измеряют проксимальные (прямые) или дистальные (косвенные) события в G-белковой сигнализации, наиболее часто используются для скрининга лиганд GPCR и в основном используются в исследованиях десиротенизации6. Примеры анализов, которые непосредственно измеряют активацию G-белка при посредничестве GPCR, включают в себя связывающую асссид «35S»GTP-S, которая измеряет связывание радиомаркированных и негидроизируемых аналогов GTP с субъединицей ГЗ, и Фюрстер/биолюминесценционный резонансный рецензионный перенос энергии (FRET/BRET, соответственно) зонды для мониторинга GPCR-G и ГЗ /ГЗ взаимодействий, которые набирают больше тяги на протяжении9лет,10. Анализы, которые отслеживают дистальные события, являются наиболее часто используемыми инструментами для профилирования GPCR; например, анализы cAMP и IP1/3 измеряют внутриклеточное накопление G-белковых зависимых вторичных посланников, в то время как «Ca2»- поток и репортирующие анализы, связанные с конкретными элементами реакции, вовлеченными в активацию G-белка (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), изучают события, далее вниз по течению сигнального каскада11. В то время как большинство вышеупомянутых анализов могут быть выполнены на высоком уровне пропускной записи, являются довольно чувствительными, и похвастаться определенными ассаем-специфических преимуществ (например, дискриминация между полными / частичными агонистов, нейтральных антагонистов и обратных агонистов в случае связывания GTP, или анализ функциональности на живых клетках, таких как "Ca2"и IP1/3)6, Есть, к сожалению, нет существующих G белково-зависимых методов быть подходящим допроса всего druggable GPCR.ru. Это в значительной степени связано с родной связи нескольких G-белковых подсемейств с GPCRs, в результате чего сигнализации на нескольких каскадах и неизвестных G-белков ойс на сиротах GPCRs. Чтобы смягчить эту проблему, анализы были разработаны, чтобы заставить беспорядочную G-белок связи через один общий сигнализации считывания, такие как cAMP, и Ca2 ",хотя большинство из них имеют низкую пропускную силу12.
Важным аспектом жизненного цикла GPCR является прекращение G-белково-зависимой сигнализации, которая происходит в значительной степени за счет набора q-arrestins, который вызывает диссоциацию G-белка, и в конечном итоге десенсибилизации рецептора, который предназначен для клатрин покрытием интернализации13. Наиболее повсеместно выраженными изоформами з-арестина являются невизуальные q-arrestin1 и q-arrestin2, также обозначенные как arrestin-2 и arrestin-3, соответственно14. Введите G-протеиновые независимые анализы на основе клеток, которые добавляют новое измерение скринингу лиганда GPCR; торговля рецепторами, без этикетки целые ячейки, и к-арестин вербовки анализы все примечательные примеры. GPCR торговли анализы использовать флюорофор помечены лиганды или совместно интернализированных антител, направленных на рецептор15, в то время как этикетка свободных целых клеток анализы использовать биосенсоры, которые переводят клеточные изменения, вызванные лиганд связывания в количественных выходов, таких как электрические или оптические сигналы16. Примечательно, что квинтэссенцией GPCR-- - арестин взаимодействий моды на набор анализ q-arrestin как привлекательный инструмент в репертуаре функциональных анализов17. Система танго, впервые разработанная Барнеа и др. всего десять лет назад, включает в себя введение трех экзогенных генетических элементов: синтез белка, состоящий из q-arrestin2 с протеазой вируса табачного etch (TEVp), тетрациклинового трансактиватора (tTA), который привязан к GPCR через табак etch вирус протеаза расщепления сайта (TEVcs) и предшествует последовательность из C-терминус V2 вазопрессин рецептор (V2 хвост) для содействия арестин вербовки, и репортер luciferase гена, транскрипция которого вызвана tTA транскрипции фактор транскрипции транскрипции транслокации в ядро, которое освобождается от мембраны якорь после q-arrestin2 вербовки (Рисунок 1)18. Количественные показания активации GPCR и набора q-arrestin2 могут быть впоследствии определены путем чтения для люминесценции. Заметным отличием является то, что в то время как торговля рецепторами и этикетки свободных целых клеточных методов являются относительно низкой пропускной способом, танго имеет ряд преимуществ, в том числе селективного чтения, что характерно для целевого рецептора и чувствительность из-за интеграции сигнала, которые делают его подходящим кандидатом для лиганда скрининга в большей шкале18.
В связи с этими стратегическими особенностями, Kroeze et al. разработаны PRESTO-Tango (Параллельное выражение и скрининг рецепторов и скрининг атлетизм через транскрипционный выход-Танго), высокопроизводительная платформа с открытым исходным кодом, которая использует подход Tango для профиля наркотического GPCR-ome в параллельной и одновременной манере19. Используя «неразборчивый» набор q-arrestin2 почти для всех GPCRs, PRESTO-Tango является первым в своем роде с точки зрения функциональных анализов на основе клеток, что позволяет быстро "первый раунд" скрининга малых молекулных соединений почти на всех необонятельных GPCRs, в том числе сирот, независимо от G-белка подсемейства.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Как крупнейшая и наиболее универсальная генная суперсемейство и посредники гаммы клеточных сигнальных путей, G-белковые рецепторы (GPCRs) представляют собой одну из наиболее перспективных целей для фармацевтической промышленности. Ergo, дизайн, реализация и оптимизация GPCR лиганд скрининга анализы имеет решающее значение, так как они представляют собой дистанционного управления инструментами для обнаружения наркотиков и для манипулирования GPCR фармакологии и результатов. В прошлом, G-белковых ипотеческих анализов типифицировали эту область исследований, обнаружения лиганд-индуцированных событий и количественного поколения вторичных посланников. Однако, с появлением функциональной избирательности, а также повышение осведомленности о нескольких других G белка независимых путей и ограничения, связанные с G-белок зависимых анализов, есть больший толчок к созданию альтернативных GpCR лиганд скрининга анализы. Для этого мы описываем применение одного такого ресурса, платформы PRESTO-Tango, системы на основе репортеров, которая позволяет параллельно и одновременно проводить допрос человека GPCR-ome, подвиг, который ранее считался технически и экономически неосуществимым. Основываясь на независимом исследовании вербовки G-protein, при посредничестве группы по борьбе с торговлей людьми и сигнализации в GPCRs делает PRESTO-TANGO подходящим инструментом для изучения примерно 300 необоняемых ГПКР, в том числе около 100 сиротских рецепторов. Чувствительность и надежность PRESTO-Tango делают его пригодным для первичных высокопроизводительных экранов с использованием сложных библиотек, используемых для выявления новых целей GPCR для известных препаратов или для открытия новых лиганд для рецепторов сирот.

Используя протокол PRESTO-Tango, представленный в настоящем, экстракт гранулы хромаффина (CG) был проверен против 168 необонворных целей GPCR, при этом большинство из них являются сиротскими рецепторами. Профилирование указанного экстракта было выполнено путем изучения мобилизации на выбранны?...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

С учетом того, что GPCRs являются привлекательными целевыми показателями, пригодными для наркотиков, скрининг лиганда GPCR, таким образом, необходим для идентификации свинцовых соединений и для проведения исследований по дефанфанизации. К этим усилиям мы описываем PRESTO-Tango, ресурсную платформу с открытым исходным кодом, используемую для одновременного профилирования переходного набора на работу в формате приблизительно 300 GPCRs с использованием речевого агентства TEV.

Параллельный допрос по набору в лигунд-2 для скрининга в Лиганде по шкале GPCR с использованием PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Платформа Presto-Tango была разработана для проведения параллельного и одновременного допроса всех неоялотельных GPCRs в геноме человека, в том числе, что сироты цели профиля лиганд-индуцированной бета-арестин 2 вербовки. Платформа Presto-Tango является единственным ресурсом с открытым исходным кодом для профилирования всего генома GPCR в параллельном подходе, используя G белок независимого бета-арестина вербовки анализа. Демонстрация процессора была бы Genevieve Laroche научный сотрудник в моей лаборатории, и Манель Зигаль, кандидат наук в моей лаборатории.Перед началом процедуры добавьте 20 микролитров по 25 микрограмм на миллилитр поли-L-лизина раствора к каждой колодец соответствующего экспериментального числа из 384 оптических нижних пластин и инкубировать пластины при комнатной температуре от 30 минут до двух часов. В конце инкубации, Флик пластин над раковиной, чтобы удалить избыток поли-L-лизина и добавить 40 микролитров антибиотика антимикотического раствора для каждой хорошо. Затем инкубировать пластины, необходимые для посева клеток при 37 градусах по Цельсию и место остальных пластин на четыре градуса по Цельсию для длительного хранения.Чтобы посеять клетки HTLA для первичного скрининга, аккуратно промойте слияние 150 миллиметров клеточных культур с 10 миллилитров PBS перед лечением культур с шестью миллилитров 0,05%трипсина ЭДТА на блюдо. Когда клетки отсоединились бассейн ячейки подвески в 50 миллилитров конической трубки, содержащей равный объем DMEM. И собирать клетки путем центрифугации.Повторно приостановить гранулы в 2,2 раза 10 до пятой клетки на миллилитр концентрации DMEM и Флик пластин над раковиной, чтобы удалить антимикотический раствор антибиотика. Нажмите пластины, чтобы высохнуть и семян 45 микролитров клеток в каждой хорошо. Затем поместите пластины на 37 градусов по Цельсию и 45%углекислого газа в одночасье.Для подготовки 384 хорошо ДНК источник пластины для трансфекции распространять 50 нанограмм на миллилитр каждой плазминной бесплатной ДНК кодирования GPRC Танго построить интерес в 0,1X Tris-EDTA за колодец в каждом хорошо пластины 96. Используйте многоканарновую пипетку, чтобы вручную передать 10 микролитров раствора ДНК из каждой скважины из 96 скважин в отдельные скважины одной из 384 хорошо исходных пластин ДНК в четырехместном для каждого состояния, как показано на примере. Затем перенесите 40 микролитров раствора хлорида молярного кальция 0.313 в каждую колодец ДНК-источника пластины и аккуратно смешайте содержимое каждой хорошо.Добавьте 50 микролитров 2x буфера HEPES к каждому колодец из 384 хорошо пластины источника ДНК с нежным смешивания. После одной минуты передачи 10 микролитров смеси трансфекции ДНК из 384 хорошо ДНК источник пластины в каждый колодец семян клеток HTLA и инкубировать клетки в инкубаторе культуры клеток на ночь. На следующий день декант transfected клеточной среды и медленно добавить 40 микролитров голодающих средних к каждому хорошо заботиться, чтобы не прикасаться к клеткам напрямую.Затем добавьте 20 микролитров буфера транспортного средства для чередующихся рядов без соединения в 20 микролитров соединения интереса в три раза концентрации в чередующиеся ряды, прежде чем вернуть пластину в инкубатор культуры клеток. Через 16-24 часа после стимуляции декант transfected клеточной среды и добавить 20 микролитров свежеприготовленного реагента свечения к каждой хорошо в течение пяти до 20 минут инкубации при комнатной температуре защищены от света. Затем прочитайте пластины на счетчике люминесценции микро-пластины со временем интеграции одной секунды на колодец.Для вторичного скрининга, субкультуры HTLA клетки в 100 миллиметровых блюд в пять раз от 10 до шести клеток общей плотности клеток в 11 миллиметров полной среды на блюдо в течение 24 часов при 37 градусов по Цельсию. На следующий день, смешанные 10 микрограммов GPCR бесплатно ДНК с 500 микролитров Tris-EDTA раствор хлорида кальция с вихрем следуют добавление 500 микролитров буфера HEPES. После энергичной тряски, инкубировать раствор в течение одной минуты при комнатной температуре и сразу же добавить один миллилитр раствора падение мудрым на клетки.Аккуратно рок равномерно распределить осадок и место пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день проверьте эффективность трансфекции под флуоресцентным изображением клеток. Сделки, более 50% покрытия являются идеальными.Аккуратно промойте трансфицированные клетки раствором стихов, прежде чем отсоединить клетки тремя миллилитров 0,05%трипсина EDTA. Соберите разобщенные клетки путем центрифугации и повторно приостанавливайте гранулы в четыре раза от 10 до пятых клеток на миллилитр голодающей средней концентрации. Затем семя 45 микролитров клеток в каждом колодец поли-L-лизин закодированы 384 хорошо пластины и поместить пластину в инкубатор культуры клеток, по крайней мере четыре часа.Для подготовки половины журнала доза кривой ответ пластины добавить 270 микролитров HBSS дополнен HEPES и антибиотик антимикотических для всех, кроме последнего ряда 96 пластины скважины и добавить 30 микролитров каждого высокого и низкого лекарственного раствора в колодцы строки H.Transfer раствор из каждой скважины строки H в соответствующий колодец строки G с смешиванием и продолжать последовательно разбавлять соединения препарата до последнего ряда пластины пластины достигнут. Используя схему в качестве эталона, смешайте 20 микролитров разбавления низкой колонны из рядов A через G пластины 96 скважин и 20 микролитров высоких разбавлений колонны до скважин B через H 96 скважинной пластины к ранее сидящей пластине 384 скважины. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение как минимум 16 часов.От 16 до 24 часов после стимуляции декант transfected клеточной среды и добавить 20 микролитров свечения реагента к каждому хорошо в течение пяти до 20 минут инкубации перед чтением пластин на микро пластины люминесценции счетчик с интеграцией времени одной секунды на колодец. В этом репрезентативном эксперименте, из 168 GPCRs, которые были допрошены в первичном скрининге, только рецептор допамина D3 и opsin 5 были претендентами в качестве потенциальных активных целей. Допамин рецептор D3 производится значительное изменение лог2 раза 4,7 в то время как opsin 5 производится несколько ниже ответ 2,39.Для сравнения, рецептор допамина D2, положительный контроль для первичного экрана производится log2 раз изменение 4,58. Эти кривые реакции от вторичного скрининга показали, что экстракт гранул хроматина производят аналогичные окна сигнала в половине максимальных эффективных значений концентрации к хинпиролу, подтверждая его действительность как активный удар по рецептору допамина D3. Плоская доза кривой похож на отрицательный контроль был произведен для opsin 5 Однако исключая этот рецептор в качестве возможной мишени для экстракта гранул хроматина. Presto-Tango требует особого ухода, как изменчивость в распределении клеток, эффективность трансфекции и серийные разбавления наркотиков может привести к усугубленной ошибке, которая может повлиять на точность данных.Ортогональные методы, такие как радиолиганда связывания подходов, биолюминесценции резонансной передачи энергии и циклических AMP кальция и интернализации функциональных анализов могут быть использованы для дальнейшего подтверждения и характеристики взаимодействия рецепторов лиганда.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Титрование ELISA как метод, чтобы определить константу диссоциации взаимодействия лигандов рецепторов

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Крупномасштабное производство рекомбинантных молекул РНК на круговой лески с помощью вироиды производные системы в Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...