Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (subvención de la CIHR #MOP142219).

1. Examen primario: cultivo celular y sembrado de placas
<ol><li>Para preparar placas recubiertas de poli-L-lisina (PLL), dispensar 20 l/bien de una solución de material de 25 g/ml de PLL en placas inferiores ópticas de 384 pocillos blancos o negros utilizando una pipeta electrónica multicanal o un dispensador de reactivos. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 0,5–2 h. NOTA: Si utiliza las placas negras de 384 pocillos, espere que la señal de fondo sea inferior en comparación con las placas blanc...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. 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S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

Los GPCR dinámicos de conformación son potencias de transducción de señales. Las propiedades fisioquímicas de los bolsillos de unión de estos receptores hephelicales, así como su relevancia fisiológica subrayan la necesidad de herramientas de detección de ligando GPCR. Como se presentó anteriormente, el ensayo PRESTO-Tango es rápido, sensible y fácil de usar, prestándose al desarrollo de drogas. Este ensayo no sólo mide la activación inducida por agonistas, sino que también se puede utilizar para cuantifi...

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande y diversa de proteínas transmembranas, que funcionan como interfaces de comunicación entre una célula y su entorno1. La versatilidad de los GPCR se destaca por su capacidad para detectar una amplia gama de ligandos, desde neurotransmisores hasta nucleótidos, péptidos a fotones, y muchos más, así como su capacidad para regular numerosas cascadas de señalización aguas abajo implicadas en el crecimiento celular, migración, diferenciación, apoptosis, disparo celular, etc.2,3. Teniendo en cuenta su ubicuidad e implicación en una multitud de procesos fisiológicos, esta familia de receptores es de suma importancia terapéutica, que se muestra por el hecho de que más de un tercio de los medicamentos prescritos actualmente disponibles se dirigen a los GPCRs4. Sin embargo, estas terapias existentes sólo se dirigen a un pequeño subconjunto de la superfamilia (se estima que el 10%), y la farmacología de muchos GPCR sigue sin aclararse. Además, más de 100 GPCRs existen como receptores huérfanos, ya que no han sido emparejados con un ligando endógeno5. Por lo tanto, el cribado de ligando GPCR es fundamental en la desorfanización y el desarrollo de fármacos, ya que allana el camino hacia el descubrimiento y optimización de plomo, y posiblemente a la fase de ensayo clínico.
Los métodos para el cribado de ligando GPCR han caído tradicionalmente en una de dos categorías, ensayos funcionales independientes de la proteína G o independientes de la proteína G6. La señalización GPCR está regulada por las proteínas G heterotriméricas , que se activan mediante el intercambio de GTP por el PIB consolidado en la subunidad7de la G. Las señales del receptor activado son transducidas por las proteínas G a través de mensajeros secundarios, tales como campo, calcio, DAG e IP3, para mediar la señalización aguas abajo en los efectores aguas abajo8. La naturaleza de las consecuencias funcionales de la señalización de proteína G se ha explotado para crear ensayos a base de células que reflejan la activación del receptor. Estos métodos, que miden eventos proximales (directos) o distales (indirectos) en la señalización de proteínas G, se utilizan con mayor frecuencia para el cribado de ligando GPCR y se han empleado principalmente en estudios de desorfanización6. Entre los ejemplos de ensayos que miden directamente la activación de proteínaG mediada por GPCR se incluyen el ensayo de unión [35S]GTP-S, que mide la unión de un análogo GTP radiomarcado y no hidrolizable a la subunidad De G, y de la transferencia de energía de resonancia de la bioluminiscencia (FRET/BRET, respectivamente) para monitorear las interacciones GPCR-G y G-G, que han ido ganando más tracción a lo largo de los años9,10. Los ensayos que supervisan los eventos distales son las herramientas más utilizadas para la generación de perfiles GPCR; por ejemplo, los ensayos de campo e IP1/3 miden la acumulación intracelular de mensajeros secundarios dependientes de la proteína G, mientras que los ensayos de flujo y reporteros [Ca2+]que implican elementos de respuesta específicos implicados en la activación de la proteína G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) examinan los acontecimientos posteriores a la cascada de señalización11. Si bien la mayoría de los ensayos antes mencionados se pueden realizar a un nivel de alto rendimiento, son bastante sensibles, y cuentan con ciertas ventajas específicas del ensayo (por ejemplo, discriminación entre agonistas completos/parciales, antagonistas neutrales y agonistas inversos en el caso de la unión GTP-S, o la funcionalidad de ensayo en células vivas como [Ca2+] e IP1/3)6, lamentablemente no hay métodos existentes dependientes de la proteína G que se ajusten al interrogatorio de todo el GPCR-ome farmacoliente. Esto se debe en gran medida al acoplamiento nativo de múltiples subfamilias de proteína G a los GPCR, lo que resulta en la señalización en varias cascadas y el acoplamiento desconocido de la proteína G en los GPCR huérfanos. Para mitigar este problema, se han desarrollado ensayos para forzar el acoplamiento promiscuo de proteína G a través de una única lectura de señalización común, como el campo, y Ca2+,aunque la mayoría de ellos son de bajo rendimiento12.
Un aspecto importante del ciclo de vida del GPCR es la terminación de la señalización dependiente de la proteína G, que se produce en gran parte a través del reclutamiento de arrestinas que induce la disociación de la proteína G, y en última instancia desensibilizar el receptor, que está dirigido a la internalización recubierta de clathrin13. Las isoformas más ubicuamente expresadas de la-arrestin son las no visuales de la palabra -arrestin1 y la de la detin2, también denotadas como arrestin-2 y arrestin-3, respectivamente14. Ingrese los ensayos basados en células independientes de la proteína G, que agregan una nueva dimensión al cribado de ligando GPCR; el tráfico de receptores, la célula entera sin etiquetas y los ensayos de reclutamiento de arrestinas son ejemplos notables. Los ensayos de tráfico de GPCR emplean ligandos etiquetados con fluoróforo o anticuerpos cointernalizados dirigidos al receptor15,mientras que los ensayos de células enteras sin etiquetas utilizan biosensores que traducen los cambios celulares inducidos por la unión de ligandos en salidas cuantificables, como señales eléctricas u ópticas16. En particular, las interacciones por excelencia de GPCR-arrestin como un ensayo de reclutamiento de arresten como una herramienta atractiva en el repertorio de ensayos funcionales17. El sistema Tango, desarrollado por primera vez por Barnea et al. hace sólo una década, implica la introducción de tres elementos genéticos exógenos: una fusión proteica consistente en é-arrestin2 con una proteasa del virus de la etch del tabaco (TEVp), un transactivador de tetraciclina (tTA) que se atan a un GPCR a través de un tabaco, etc. sitio de escovades de la proteasa del virus h (TEVcs) y está precedido por una secuencia del Término C del receptor de vasopresina V2 (cola V2) para promover el reclutamiento de arrestina, y un gen de luciferasa reportero cuya transcripción es desencadenada por el tTA factor de transcripción translocación al núcleo, que se libera del anclaje de membrana después de la contratación de la-arrestin2 (Figura 1)18. Las lecturas cuantitativas de la activación del GPCR y el reclutamiento de la lista 2 se pueden determinar posteriormente mediante la lectura de luminiscencia. Una distinción notable es que si bien el tráfico de receptores y los métodos de células enteras sin etiquetas son relativamente de bajo rendimiento, el Tango tiene varias ventajas, incluyendo la lectura selectiva que es específica del receptor objetivo y la sensibilidad debido a la integración de la señal, que lo convierten en un candidato adecuado para la detección de ligandos en una escala más grande18.
En vista de estas características estratégicas, Kroeze y otros desarrollaron PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), una plataforma de código abierto de alto rendimiento que utiliza el enfoque Tango para perfilar el GPCR-ome farmacogable de manera paralela y simultánea19. Aprovechando el reclutamiento "promiscuo" de la prueba de análisis de la palabra 2 a casi todos los GPCR, PRESTO-Tango es el primero de su tipo en términos de ensayos funcionales basados en células, lo que permite un cribado rápido de "primera ronda" de compuestos de moléculas pequeñas en casi todos los PCPR no olfativos, incluidos los huérfanos, independientes del acoplamiento de la subfamilia de proteínas G.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Como la superfamilia genética más grande y versátil y los mediadores de una gama de vías de señalización celular, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan uno de los objetivos más prometedores para la industria farmacéutica. Ergo, el diseño, la implementación y la optimización de los ensayos de detección de ligandos GPCR es crucial, ya que representan herramientas de control remoto para el descubrimiento de fármacos y para manipular la farmacología y los resultados de GPCR. En el pasado, los ensayos dependientes de la proteína G tipificaran esta área de investigación, detectando eventos inducidos por ligandos y cuantificando la generación de mensajeros secundarios. Sin embargo, desde el advenimiento de la selectividad funcional, así como una mayor conciencia de varias otras vías independientes de la proteína G y las limitaciones asociadas con los ensayos dependientes de la proteína G, hay un mayor impulso hacia la creación de Ensayos de detección de ligando GPCR. Hacia este esfuerzo, describimos la aplicación de uno de esos recursos, la plataforma PRESTO-Tango, un sistema basado en reporteros de luciferasa que permite el interrogatorio paralelo y simultáneo del GPCR-ome humano, una hazaña que anteriormente se consideraba técnica y económicamente inviable. Sobre la base de un ensayo de reclutamiento independiente de proteínaS G, la universalidad del tráfico mediado por la toma de la empresa y la señalización en los GPCR hace de PRESTO-TANGO una herramienta adecuada para estudiar aproximadamente 300 receptores huérfanos. La sensibilidad y robustez de PRESTO-Tango lo hacen adecuado para pantallas primarias de alto rendimiento que utilizan bibliotecas compuestas, empleadas para descubrir nuevos objetivos GPCR para medicamentos conocidos o para descubrir nuevos ligandos para receptores huérfanos.

Utilizando el protocolo PRESTO-Tango presentado en este documento, un extracto de gráulo de cromafina (CG) se basó en 168 objetivos GPCR no olfativos, siendo la mayoría receptores huérfanos. La elaboración de perfiles de dicho extracto se llevó a cabo examinando la movilización de la lista 2 en los receptores elegidos, sobre la base del principio diseñado por Barnea et al.18 (Figura 1). El ADN plasmico de los GPCR de interés fue tomado del kit GPCR PRESTO-Tan...

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Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.

Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

La plataforma Presto-Tango fue ideada para ejecutar el interrogatorio paralelo y simultáneo de todos los GPCR no olfativos en el genoma humano, incluyendo a los objetivos huérfanos para perfilar la beta-arresto inducida por ligandos en el reclutamiento 2. La plataforma Presto-Tango es el único recurso de código abierto para perfilar todo el genoma GPCR en un enfoque paralelo, utilizando un ensayo de reclutamiento de beta-arresto independiente de proteína G. Demostrando el procesador sería Genevieve Laroche un investigador asociado en mi laboratorio, y Manel Zighal, un candidato de doctorado en mi laboratorio.Antes de comenzar el procedimiento añadir 20 microlitros de una solución de poli-L-lisina de 25 microgramos por mililitro a cada pocillo del número experimental adecuado de 384 placas inferiores ópticas e incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos a dos horas. Al final de la incubación, mover las placas sobre el fregadero para eliminar el exceso de poli-L-lisina y añadir 40 microlitros de solución antimicótica antibiótico a cada pocillo. Luego incubar las placas necesarias para la siembra celular a 37 grados Celsius y colocar el resto de las placas a cuatro grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo.Para sembrar células HTLA para el cribado primario, enjuague suavemente cultivos celulares confluentes de 150 milímetros con 10 mililitros de PBS antes de tratar los cultivos con seis mililitros de 0.05%trypsin EDTA por plato. Cuando las células se han separado agrupan las suspensiones celulares en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene un volumen igual de DMEM. Y recoger las células por centrifugación.Vuelva a suspender el pellet a una 2,2 veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración de DMEM y deslice las placas sobre el fregadero para eliminar la solución antimicótica antibiótica. Toque las placas para secar y sembrar 45 microlitros de células en cada pozo. A continuación, coloque las placas a 37 grados centígrados y un 45% de dióxido de carbono durante la noche.Para preparar la placa de origen de ADN de 384 pozos para la transfección, distribuya 50 nanogramos por mililitro de cada plasmami adn complementario que codifica la construcción GPRC Tango de interés en 0.1X Tris-EDTA por pozo en cada pocero de una placa de 96 pozos. Utilice una pipeta multicanal para transferir manualmente 10 microlitros de solución de ADN de cada pozo de la placa de 96 pozos a pozos individuales de una placa de fuente de ADN de 384 pozos en cuadrúplica para cada condición como se ilustra. A continuación, transfiera 40 microlitros de una solución de cloruro de calcio molar 0,313 a cada pozo de la placa de origen del ADN y mezcle suavemente el contenido de cada pozo.Agregue 50 microlitros de 2x tampón HEPES a cada pozo de la placa de fuente de ADN de 384 pozos con una mezcla suave. Después de un minuto transferir 10 microlitros de la mezcla de transfección de ADN de la placa de fuente de ADN de 384 pozos a cada pozo de células HTLA sembradas e incubar las células en la incubadora de cultivo celular durante la noche. Al día siguiente decantar el medio celular trans infectado y añadir lentamente 40 microlitros de medio hambriento a cada pozo teniendo cuidado de no tocar las células directamente.A continuación, añada 20 microlitros del tampón del vehículo para las filas alternas sin compuesto en 20 microlitros del compuesto de interés a tres veces la concentración en las filas alternas, antes de devolver la placa a la incubadora de cultivo celular. 16 a 24 horas después de la decantación de la estimulación del medio celular trans infectado y añadir 20 microlitros de reactivo de brillo recién preparado a cada pozo durante una incubación de cinco a 20 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. A continuación, lea las placas en un contador de luminiscencia de microplacas con un tiempo de integración de un segundo por pozo.Para un cribado secundario, la subcultura de las células HTLA en platos de 100 milímetros a cinco veces 10 a las seis células de densidad celular total en 11 milímetros de medio completo por plato durante 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, se mezclaron 10 microgramos de ADN complementario GPCR con 500 microlitros de solución de cloruro de calcio Tris-EDTA con vórtice seguido de la adición de 500 microlitros de tampón HEPES. Después de un agitado vigoroso, incubar la solución durante un minuto a temperatura ambiente e inmediatamente añadir un mililitro de la solución caer sabiamente sobre las células.Mece suavemente para distribuir uniformemente el precipitado y coloque la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, compruebe la eficiencia de la transfección bajo un imager de celda fluorescente. Las transacciones superiores al 50% de cobertura son ideales.Enjuague suavemente las células trans infectadas con solución de verso antes de separar las células con tres mililitros de 0,05%trypsin EDTA. Recoger las células disociadas por centrifugación y volver a suspender el pellet en un cuatro veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración media hambrienta. A continuación, sembrar 45 microlitros de células en cada pozo de una placa de poli-L-lisina codificada 384 pozo y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante al menos cuatro horas.Para preparar una placa de respuesta de media bola de dosis-curva de registro añadir 270 microlitros de HBSS complementados con HEPES y antibiótico antimicótico a todos excepto la última fila de una placa de 96 pozos y añadir 30 microlitros de cada solución de fármaco alto y bajo a los pozos de la fila H.Transferir la solución de cada pozo de fila H en la correspondiente fila de pozo G con la mezcla y continuar diluyendo en serie los medicamentos compuestos hasta la última fila de la placa de la placa se alcanza. Usando el esquema como referencia, mezcle 20 microlitros de las diluciones de columna baja de las filas A a G de la placa de 96 pozos y 20 microlitros de las diluciones de columna alta a los pozos B a H de la placa de 96 pozos a la placa de 384 pozos previamente asentada. Luego incubar la placa a 37 grados centígrados durante un mínimo de 16 horas.16 a 24 horas después de la decantación de la estimulación del medio celular trans infectado y añadir 20 microlitros de reactivo de resplandor a cada pocillo durante una incubación de cinco a 20 minutos antes de leer las placas en un contador de luminiscencia de microplaca con un tiempo de integración de un segundo por pozo. En este experimento representativo, de los 168 GPCR que fueron interrogados en el cribado primario, sólo el receptor de dopamina D3 y opsin 5 eran contendientes como objetivos activos potenciales. Receptor de dopamina D3 produjo un cambio significativo de 4.7 mientras que opsin 5 produjo una respuesta ligeramente menor de 2.39.En comparación, receptor de dopamina D2, el control positivo para la pantalla primaria produjo un cambio de plegado log2 de 4.58. Esas curvas de respuesta del cribado secundario demostraron que el extracto de gránulo de cromatina produce ventanas de señal similares en valores de concentración efectivos medio máximos a quinpirole confirmando su validez como un golpe activo en el receptor de dopamina D3. Una curva de dosis plana similar al control negativo fue producida para opsin 5 sin embargo descartar este receptor como un posible objetivo para el extracto de gránulo de cromatina. Presto-Tango requiere un cuidado especial, ya que las variabilidades en la distribución celular, la eficiencia de la transfección y las diluciones de fármacos en serie pueden dar lugar a errores compuestos, lo que puede afectar la precisión de los datos.Los métodos ortogonales, como los enfoques de unión a Radioligand, la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia y los ensayos funcionales de calcio y internalización de AMP cíclico, se pueden utilizar para confirmar y caracterizar aún más las interacciones del receptor de ligando.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Investigación

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Valoración de ELISA como método para determinar la constante de disociación de la interacción del ligando del Receptor

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Detección de fitoestrógenos usando un ensayo de receptores de estrógeno a base de células β Reporter

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...