Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).

1. Primär screening: cellkultur och plåtsådning
<ol><li>För att förbereda poly-L-lysin (PLL)-belagda plattor, fördela 20 μL/brunn av en 25 μg/ml lagerlösning av PLL i vita eller svarta 384-brunns optiska bottenplattor med hjälp av en elektronisk flerkanalig pipett eller en reagensdispenser. Inkubera plattorna i rumstemperatur i 0,5–2 h. OBS: Om du använder de svarta 384-brunnsplattorna, förvänta dig att bakgrundssignalen är lägre jämfört med de vita plattorna. Svarta plattor rekommenderas för att...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

Konformationally dynamiska GPCRs är kraftpaket av signaltransduktion. De fysiokemiska egenskaperna hos de bindande fickorna på dessa heptaheliska receptorer, liksom deras fysiologiska relevans understryker behovet av GPCR ligand screeningverktyg. Som presenteras ovan, presto-Tango analysen är snabb, känslig och användarvänlig, utlåning sig till läkemedelsutveckling. Inte bara denna analys åtgärd agonist-inducerad aktivering, men det kan också användas för att kvantifiera aktiviteten hos antagonister och allo...

G-protein-kopplade receptorer (GPCRs) utgör den största och mest varierande familjen av transmembrane proteiner, fungerar som kommunikationsgränssnitt mellan en cell och dess miljö1. Mångsidigheten hos GPCRs framhävs av deras förmåga att upptäcka ett varierat utbud av ligander-från signalsubstanser till nukleotider, peptider till fotoner, och många fler, samt deras förmåga att reglera många nedströms signalering kaskader inblandade i cellulära tillväxt, migration, differentiering, apoptos, cell bränning, etc.2,3. Med tanke på deras allestädes närvarande och engagemang i en mängd fysiologiska processer, denna receptorfamilj är av yttersta terapeutisk betydelse, framgår av det faktum att mer än en tredjedel av för närvarande tillgängliga föreskrivna läkemedel mål GPCRs4. Dessa befintliga terapier riktar dock endast in sig på en liten delmängd av superfamiljen (uppskattningsvis 10 %), och farmakologiför många GPCRs förblir oklarat. Dessutom finns mer än 100 GPCRs som föräldralösa receptorer, eftersom de inte har matchats med en endogen ligand5. Därför är GPCR ligand screening avgörande i avbarnbildning och läkemedelsutveckling, eftersom det banar väg mot bly upptäckt och optimering, och eventuellt till den kliniska prövningen fasen.
Metoder för GPCR ligand screening har traditionellt fallit i en av två kategorier, G-protein beroende eller G-protein oberoende funktionella analyser6. GPCR-signalering regleras av heterotrimeric G-proteiner (Gαβγ), som aktiveras genom utbyte av GTP för BNP på bundet på Gα-underenheten7. Signaler från den aktiverade receptorn transduceds av G-proteiner via sekundära budbärare, såsom cAMP, kalcium, DAG och IP3, att medla nedströms signalering vid nedströms effektorer8. Arten av de funktionella konsekvenserna av G-protein signalering har utnyttjats för att skapa cellbaserade analyser som återspeglar receptoraktivering. Dessa metoder, som mäter proximala (direkta) eller distala (indirekta) händelser i G-protein signalering, används oftast för GPCR ligand screening och har huvudsakligen använts i deorphanization studier6. Exempel på analyser som direkt mäter GPCR-medierad G-proteinaktivering är [35S]GTPγS bindningsanalys, som mäter bindning av en radiomärkt och icke-hydrolyzable GTP-analog till Gα-underenheten, och Förster/bioluminescensresonansenergiöverföring (FRET/BRET) sonder för att övervaka GPCR-Gα- och Gα/Gγ-interaktioner, som har fått mer dragkraft under åren9,10. Analyser som övervakar distala händelser är de vanligaste verktygen för GPCR-profilering; Till exempel cAMP och IP1/3 analyser mäta intracellulär ackumulering av G-protein beroende sekundära budbärare, medan [Ca2 +] flux och reporter analyser med specifika svarelement inblandade i G-protein aktivering (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) undersöka händelser längre nedströms signalering kaskad11. Medan de flesta av de ovannämnda analyser kan utföras på en hög genomströmningsnivå, är ganska känsliga, och skryta med vissa analysspecifika fördelar (t.ex. diskriminering mellan fullständiga / partiella agonister, neutrala antagonister och omvända agonister när det gäller GTPγS bindning, eller analys funktionalitet på levande celler som [Ca2 +] och IP1 /3)6, det finns tyvärr inga befintliga G-protein beroende metoder som anstår förhör et hela druggable GPCR-ome. Detta beror till stor del på den inhemska kopplingen av flera G-protein underfamiljer till GPCRs, vilket resulterar i signalering vid flera kaskader och den okända G-protein koppling på föräldralösa GPCRs. För att mildra denna fråga, analyser har utvecklats för att tvinga promiskuösa G-protein koppling genom en enda gemensam signalering avläsning, såsom cAMP, och Ca2 +, om än de flesta av dem är låg genomströmning12.
En viktig aspekt av GPCR livscykel är uppsägning av G-protein-beroende signalering, som uppstår till stor del genom rekrytering av β-arrestiner som inducerar dissociation av G-proteinet, och slutligen desensibilisera receptorn, som är avsedd för clathrin-belagda internalisering13. De mest allmänt uttryckta isoformerav β-arrestin är icke-visuella β-arrestin1 och β-arrestin2, också betecknas som arresti-2 och arrestin-3, respektive14. Ange G-protein oberoende cellbaserade analyser, som lägger till en ny dimension till GPCR ligand screening; receptorhandel, etikettfri helcell och β-arresteringi rekrytering analyser är alla anmärkningsvärda exempel. GPCR människohandel analyser anställa fluorfores-märkta ligands eller co-internalized antikroppar riktade mot receptorn15, medan etikett-fri hela cellanalyser använder biosensorer som översätter cellulära förändringar som orsakas av ligand bindning till kvantifierbara utgångar, såsom elektriska eller optiska signaler16. Noterbart är att kvintessensen GPCR- β-arrestin interaktioner mode β-arrestin rekrytering analys som ett attraktivt verktyg i repertoaren av funktionella analyser17. Tango-systemet, som först utvecklades av Barnea et al. för bara ett decennium sedan, innebär införande av tre exogena genetiska element: en proteinfusion bestående av β-arrestin2 med ett växtskydd för tobaksetetetsvirus (TEVp), en tetracyklintransactivator (tTA) som är bunden till en GPCR via ett tobaksetsningsvirus proteas klyvning webbplats (TEVcs) och föregås av en sekvens från C-ändstationen av V2 vasopressin receptorn (V2 svans) för att främja arrestering i rekrytering, och en reporter luciferase gen vars transkription utlöses av tTA transkriptionsfaktor flyttning till kärnan, som befrias från membranet förankring efter β-arrestin2 rekrytering (figur 1)18. Kvantitativa avläsningar av GPCR-aktivering och β-arrestin2-rekrytering kan senare bestämmas genom läsning för luminiscens. En anmärkningsvärd skillnad är att medan receptorhandel och etikettfria hela cellmetoder är relativt låggenomströmning, har Tango flera fördelar, inklusive selektiv avläsning som är specifik för målreceptorn och känslighet på grund av signalintegration, vilket gör det till en lämplig kandidat för ligand screening i större skala18.
Med tanke på dessa strategiska funktioner utvecklade Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallellreceptor-ome Expression and Screening via Transkriptionsproduktion-Tango), en öppen källkodsplattform med hög genomströmning som använder Tango-metoden för att profilera den drogbara GPCR-ome på ett parallellt och samtidigt sätt19. Utnyttja "promiskuösa" rekrytering av β-arrestin2 till nästan alla GPCRs, presto-Tango är den första i sitt slag när det gäller cellbaserade funktionella analyser, vilket möjliggör snabb "första omgången" screening av små molekyler föreningar på nästan alla icke-lukt GPCRs, inklusive föräldralösa barn, oberoende av G-protein underfamilj koppling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Som den största och mest mångsidiga gensuperfamiljen och medlare av ett spektrat av cellulära signalvägar, g-protein-kopplade receptorer (GPCRs) representerar en av de mest lovande målen för läkemedelsindustrin. Ergo, design, genomförande och optimering av GPCR ligand screening analyser är avgörande, eftersom de representerar fjärrstyrning verktyg för läkemedelsupptäckt och för att manipulera GPCR farmakologi och resultat. Tidigare, G-protein beroende analyser kännetecknas detta område av forskning, upptäcka ligand-inducerad händelser och kvantifiera generering av sekundära budbärare. Men sedan tillkomsten av funktionell selektivitet, samt en ökad medvetenhet om flera andra G protein-oberoende vägar och begränsningar i samband med G-protein beroende analyser, det finns en större push mot skapandet av alternativa GPCR ligand screening analyser. Mot denna strävan beskriver vi tillämpningen av en sådan resurs, PRESTO-Tango-plattformen, ett luciferase reporterbaserat system som möjliggör parallella och samtidiga förhör av den mänskliga GPCR-ome, en bedrift som tidigare ansågs tekniskt och ekonomiskt omöjligt. Baserat på en G-protein oberoende β-arrestin2 rekrytering analys, universalitet β-arrestin2-medierad människohandel och signalering på GPCRs gör PRESTO-TANGO ett passande verktyg för att studera cirka 300 icke-lukt mänskliga GPCRs, inklusive cirka 100 särläkemedel. PRESTO-Tangos känslighet och robusthet gör den lämplig för primära höggenomströmningsskärmar med hjälp av sammansatta bibliotek, används för att avslöja nya GPCR-mål för kända läkemedel eller för att upptäcka nya ligander för föräldralösa receptorer.

Med hjälp av PRESTO-Tango protokollet presenteras häri, en chromaffin granulat (CG) extrakt kontrollerades mot 168 icke-lukt GPCR mål, med majoriteten är föräldralösa receptorer. Profilering av nämnda extrakt utfördes genom att undersöka β-arrestin2 mobilisering vid de valda receptorerna, baserat på den princip som utformats av Barnea et al.18 (figur 1). Plasmid cDNA av GPCRs av intresse togs från PRESTO-Tango GPCR Kit och monteras i två 96 brunnsplattor...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Med tanke på att GPCRs är attraktiva druggable mål, GPCR ligand screening är därför oumbärlig för identifiering av blyföreningar och för deorphanization studier. Mot dessa insatser beskriver vi PRESTO-Tango, en resursplattform med öppen källkod som används för samtidig profilering av övergående β-arrestin2-rekrytering på cirka 300 GPCRs med hjälp av en TEV-baserad reporteranalys.

Parallell förhör av β-Arrestin2 Rekrytering till Ligand Screening på en GPCR-wide scale med PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Den Presto-Tango plattform utformades för att utföra parallella och samtidiga förhör av alla icke-luktGPCRs i det mänskliga genomet, inklusive att föräldralösa mål att profilera ligand-inducerad beta-arrestin 2 rekrytering. Presto-Tango-plattformen är den enda open source-resursen för profilering av hela GPCR-genomet i ett parallellt tillvägagångssätt, med hjälp av en G-proteinoberoende beta-arrestin-rekryteringsanalys. Demonstrerar processorn skulle vara Genevieve Laroche en Research Associate i mitt labb, och Manel Zighal, en doktorand i mitt labb.Innan du påbörjar förfarandet lägga 20 mikroliter av en 25 mikrogram per milliliter poly-L-lysinlösning till varje brunn av lämpligt experimentellt antal 384 optiska bottenplattor och inkubera plattorna vid rumstemperatur i 30 minuter till två timmar. I slutet av inkubationen, snärta plattorna över diskbänken för att ta bort överskottet poly-L-lysin och tillsätt 40 mikroliter av antibiotikum antimycotisk lösning till varje brunn. Sedan inkubera de plattor som behövs för cell sådd vid 37 grader Celsius och placera resten av plattorna på fyra grader Celsius för långsiktig lagring.För att så HTLA-celler för primär screening, skölj försiktigt konfluenta 150 millimeter cellkulturer med 10 milliliter PBS innan du behandlar kulturerna med sex milliliter på 0,05%trypsin EDTA per fat. När cellerna har lossnat pool cellen suspensioner i en 50 milliliter koniska rör som innehåller en lika stor volym av DMEM. Och samla in cellerna genom centrifugeringen.Åter upphäva pelleten på en 2,2 gånger 10 till den femte celler per milliliter av DMEM koncentration och snärta plattorna över diskbänken för att avlägsna antibiotikum antimykotisk lösning. Knacka plattorna för att torka och utsäde 45 mikroliter celler i varje brunn. Placera sedan plattorna på 37 grader Celsius och 45% koldioxid över natten.För att förbereda 384 väl DNA-källplatta för transfection distribuera 50 nanogram per milliliter av varje plasmid gratis DNA-kodning GPRC Tango konstruera intresse för 0.1X Tris-EDTA per brunn in i varje brunn av en 96 väl platta. Använd en flerkanalspipett för att manuellt överföra 10 mikroliter DNA-lösning från varje brunn av 96 brunnsplattan till enskilda brunnar av en 384 väl DNA-källplatta i fyrdubbla för varje villkor enligt illustration. Därefter överför 40 mikroliter av en 0,313 molar kalciumkloridlösning till varje brunn av DNA-källplattan och blanda försiktigt innehållet i varje brunn.Tillsätt 50 mikroliter av 2x HEPES-buffert till varje brunn av 384 väl DNA-källplattan med skonsam blandning. Efter en minut överföring 10 mikroliter av DNA-transfektion blandningen från 384 väl DNA källplattan till varje brunn av seedade HTLA celler och inkubera cellerna i cellkultur inkubatorn över natten. Nästa dag dekantera transfected cell medium och långsamt lägga till 40 mikroliter av svältande medium till varje väl noga med att inte röra cellerna direkt.Tillsätt sedan 20 mikroliter av fordonsbufferten för de alternerande raderna utan förening i 20 mikroliter av föreningen av intresse vid en tre gånger koncentration i de alternerande raderna, innan du returnerar plattan till cellkulturinkubatorn. 16 till 24 timmar efter stimulering dekant det transfekterade cellmediet och tillsätt 20 mikroliter av nyberedda glödreagens till varje brunn under en fem till 20 minuters inkubation vid rumstemperatur skyddad från ljus. Läs sedan plattorna på en mikro-platta luminemonsensräknare med en integrationstid på en sekund per brunn.För en sekundär screening, subkultur HTLA-cellerna i 100 millimeter rätter på en fem gånger 10 till de sex cellerna total celltäthet i 11 millimeter komplett medium per maträtt i 24 timmar vid 37 grader Celsius. Nästa dag, blandade 10 mikrogram GPCR gratis DNA med 500 mikroliter av Tris-EDTA kalciumklorid lösning med virvelning följt av tillägg av 500 mikroliter av HEPES buffert. Efter kraftig skakning, inkubera lösningen i en minut vid rumstemperatur och omedelbart lägga till en milliliter av lösningen droppe klokt på cellerna.Försiktigt rock för att jämnt fördela fällningen och placera plattan på 37 grader Celsius i 24 timmar. Nästa dag, kontrollera transfektionen effektivitet under en fluorescerande cell imager. Transaktioner som är större än 50 % täckning är idealiska.Skölj försiktigt de transfekterade cellerna med versenelösning innan cellerna lossas med tre milliliter på 0,05%trypsin EDTA. Samla de dissocierade cellerna genom centrifugering och dra upp pelleten på fyra gånger 10 till de femte cellerna per milliliter svältande medelkoncentration. Sedan utsäde 45 mikroliter celler i varje brunn av en poly-L-lysin kodad 384 väl platta och placera plattan i cellkulturen inkubatorn i minst fyra timmar.För att förbereda en halv log dos-kurv respons platta lägga till 270 mikroliter av HBSS kompletteras med HEPES och antimykotiska antibiotika till alla utom den sista raden i en 96 brunnsplatta och tillsätt 30 mikroliter av varje hög och låg läkemedelslösning till brunnarna i rad H.Överför lösningen från varje brunn av rad H i motsvarande brunn av rad G med blandning och fortsätta att seriebespä ut läkemedelsföreningarna tills den sista raden av plattan är nådd. Med hjälp av den schematiska som referens, blanda 20 mikroliter av de låga kolonnutspädningarna från raderna A genom G i 96 brunnsplattan och 20 mikroliter av högkolumnspädningarna till brunnar B genom H av 96 brunnsplattan till den tidigare sittande 384 brunnsplattan. Sedan inkubera plattan vid 37 grader Celsius i minst 16 timmar.16 till 24 timmar efter stimulering dekant det transfekterade cellmediet och tillsätt 20 mikroliter av glödreagens till varje brunn under en fem till 20 minuters inkubation innan du läser plattorna på en mikroplatta luministansräknare med en integrationstid på en sekund per brunn. I detta representativa experiment, av de 168 GPCRs som förhördes i den primära screening, endast dopaminreceptorn D3 och opsin 5 var utmanare som potentiella aktiva mål. Dopaminreceptorn D3 gav en signifikant log2-faldig förändring på 4,7 medan opsin 5 gav ett något lägre svar på 2,39.Som jämförelse, dopaminreceptorn D2, den positiva kontrollen för den primära skärmen produceras en log2 gånger förändring av 4,58. Dessa svar kurvor från den sekundära screening visat att kromatin granule extrakt producerar liknande signal fönster i halv maximal effektiv koncentration värden till quinpirole bekräftar dess giltighet som en aktiv träff på dopamin receptorn D3. En platt dos-kurva som liknar den negativa kontrollen producerades för opsin 5 dock utesluta denna receptor som ett möjligt mål för extraktet kromatin granule. Presto-Tango kräver särskild vård eftersom variabilities i cellfördelning, transfektionseffektivitet och seriell läkemedelspärningar kan resultera i sammansatt fel, vilket kan påverka datans noggrannhet.Ortogonala metoder som Radioligand-bindande tillvägagångssätt, Bioluminescence Resonance Energy Transfer och Cykliskt AMP kalcium och internalisering funktionella analyser kan användas för att ytterligare bekräfta och karakterisera ligand receptor interaktioner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrering ELISA som en metod för att bestämma konstanten Dissociation av Receptor Ligand interaktion

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening av Nukleasaktivitet med hjälp av Nukleinsyrprober

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening för fytoöstrogener med hjälp av en cellbaserad östrogenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...