Name: parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay
Uploaded: 2020-03-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR hibe #MOP142219) tarafından desteklenmiştir.

1. Birincil tarama: hücre kültürü ve plaka tohumlama
<ol><li>Poli-L-lizin (PLL) kaplamalı plakalar hazırlamak için, elektronik çok kanallı pipet veya reaktif dispenser kullanarak beyaz veya siyah 384 kuyulu optik alt plakalarda 25 μG/mL pll pll stok çözeltisi dağıtın. Plakaları oda sıcaklığında 0,5-2 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Siyah 384-kuyu plakaları kullanıyorsanız, arka plan sinyalinin beyaz plakalara göre daha düşük olmasını bekleyin. Siyah plakalar bitişik kuyular arasında pa...

<ol>
	<li>Liapakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+coupled+receptor+family:+actors+with+many+faces.">The G-protein coupled receptor family: actors with many faces.</a> Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).</li><li>Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+at+a+glance.">G-protein-coupled receptors at a glance.</a> Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).</li><li>Rask-Andersen, M., Alm&#233;n, M. S., Schi&#246;th, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Ngo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+ligands+at+orphan+GPCRs:+current+status+using+structure-based+approaches.">Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches.</a> British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).</li><li>Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G-Protein+Signaling+and+Their+G+Substrates:+Promises+and+Challenges+in+Their+Use+as+Drug+Discovery+Targets.">Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets.</a> Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).</li><li>Wettschureck, N., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+G+Proteins+and+Their+Cell+Type+Specific+Functions.">Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).</li><li>Denis, C., Sauli&#232;re, A., Galandrin, S., S&#233;nard, J. -. M., Gal&#233;s, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+heterotrimeric+G+protein+activation:+applications+to+biased+ligands.">Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands.</a> Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+G+protein-coupled+receptor+ligand+identification+using+beta-arrestin+PathHunter+assay.">Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+Reporter+Assay+System+for+Deciphering+GPCR+Pathways.">Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways.</a> Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).</li><li>Roth, B. L., Kroeze, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Approaches+for+Genome-wide+Interrogation+of+the+Druggable+Non-olfactory+G+Protein-coupled+Receptor+Superfamily.">Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).</li><li>Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+Through+&#946;-Arrestin-Dependent+Mechanisms.">G Protein-Coupled Receptor Signaling Through &#946;-Arrestin-Dependent Mechanisms.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).</li><li>Smith, J. S., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#946;-Arrestins:+Multifunctional+Regulators+of+G+Protein-coupled+Receptors.">The &#946;-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).</li><li>B&#246;hme, I., Beck-Sickinger, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+life+of+GPCRs.">Illuminating the life of GPCRs.</a> Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).</li><li>Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Receptor+Assays.">Label-Free Receptor Assays.</a> Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+&#946;-Arrestin+Recruitment+for+GPCR+Targets.+Assay+Guidance+Manual.">Measurement of &#946;-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual.</a> Eli Lilly &amp; Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).</li><li>Barnea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+design+of+signaling+cascades+to+record+receptor+activation.">The genetic design of signaling cascades to record receptor activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).</li><li>Kroeze, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRESTO-Tango+as+an+open-source+resource+for+interrogation+of+the+druggable+human+GPCRome.">PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+Mammalian+Cells:+Optimization+of+Critical+Parameters+Affecting+Calcium-Phosphate+Precipitate+Formation.">Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation.</a> Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).</li><li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay.">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).</li><li>Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors+mediate+14-3-3+signal+transduction.">G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).</li><li>Walther, C., Ferguson, S. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Role+of+intracellular+scaffolding+proteins+in+the+regulation+of+endocrine+G+protein-coupled+receptor+signaling.">Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling.</a> Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).</li><li>Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin2+expression+selectively+increases+during+neural+differentiation.">Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).</li><li>Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+Tet-On+system+for+inducible+expression+of+RAGE.">Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE.</a> Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).</li><li>Blau, H. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+B+or+not+tet+B:+advances+in+tetracycline-inducible+gene+expression.">Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).</li><li>Roche, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Virtual+Screening+Method+for+Identification+of+"Frequent+Hitters"+in+Compound+Libraries.">Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).</li></ol>

Konformasyonel dinamik GPCR sinyal iletiminin güç merkezleridir. Bu heptahelical reseptörlerin bağlayıcı ceplerinin fizyokimyasal özellikleri ve fizyolojik önemi GPCR ligand tarama araçlarına duyulan ihtiyacın altını çizer. Yukarıda sunulduğu gibi, PRESTO-Tango testi hızlı, hassas ve kullanıcı dostudur ve kendini uyuşturucu gelişimine ödünç vetir. Sadece bu taht agonist kaynaklı aktivasyon ölçmek yok, ama aynı zamanda antagonistlerve allosteric modülatörlerin etkinliğini ölçmek için kul...

G-protein-coupled reseptörleri (GpPCR) transmembran proteinlerin en büyük ve en çeşitli aile oluşturmaktadır, bir hücre ve çevresi arasında iletişim arabirimleri olarak faaliyet1. GPCR çok yönlülük ligands çeşitli bir dizi tespit yeteneği ile vurgulanır-nörotransmitterlerden nükleotitler için, peptidler fotonlara, ve daha birçok-yanı sıra çok sayıda aşağı sinyal çağlayanlar hücresel büyüme, göç, farklılaşma, apoptosis, hücre ateş, vb2,3. Fizyolojik süreçlerin çok sayıda onların her yerde ve katılımı göz önüne alındığında, bu reseptör ailesi son derece terapötik öneme sahiptir, şu anda mevcut reçete li ilaçların üçte birinden fazla hedef GPCRs4gerçeği ile vitrine . Ancak, bu mevcut terapötikler sadece süper ailenin küçük bir alt kümesini hedeflemektedir (%10) ve birçok GPCR'nin farmakolojisi henüz aydınlatılmamıştır. Ayrıca, 100'den fazla PcPCR yetim reseptörleri olarak var, onlar endojen ligand5ile eşleşen olmamıştır gibi. Bu nedenle, GPCR ligand taraması deorphanization ve ilaç gelişiminde kritik, kurşun bulma ve optimizasyon yolunda yol açar gibi, ve muhtemelen klinik deneme aşamasına.
GPCR ligand tarama yöntemleri geleneksel olarak g-protein bağımlı veya G-protein bağımsız fonksiyonel tahliller6olmak üzere iki kategoriden birine düşmüştür. GPCR sinyalizasyonu heterotrimerik G proteinleri (Gαβγ) tarafından düzenlenir ve Gα alt birimi7'yebağlı GSYİh için GTP değişimi ile aktive edilir. Aktif reseptörden gelen sinyaller, cAMP, Kalsiyum, DAG ve IP3 gibi ikincil haberciler aracılığıyla G-proteinleri tarafından transeyoluyla downstream efektörleri8'deaşağı sinyalizasyona aracılık eder. G-protein sinyalinin fonksiyonel sonuçlarının doğası, reseptör aktivasyonunu yansıtan hücre bazlı tahliller oluşturmak için kullanılmıştır. G-protein sinyalizasyonunda proksimal (doğrudan) veya distal (dolaylı) olayları ölçen bu yöntemler en sık GPCR ligand taraması nda kullanılırve esas olarak deorphanization çalışmalarında 6. GPCR aracılı G-protein aktivasyonunu doğrudan ölçen tahlil örnekleri arasında [35S]GTPγS bağlayıcı tahlil, gα alt ünitesine radyoetiketli ve hidrolize edilemeyen GTP analogunun ve Förster/biyolüminesans rezonans enerji transferinin (FRET/BRET, sırasıyla) gpcr-Gα ve Gα/Gγ etkileşimlerini izlemek için 9,10yıliçinde daha fazla çekiş elde eden probların bağlanmasını ölçen. Distal olayları izlemek GPCR profilleme için en yaygın olarak kullanılan araçlar olduğunu tahliller; örneğin, cAMP ve IP1/3 tahlilleri G-proteinbağımlı ikincil habercilerin hücre içi birikimini ölçerken, [Ca2+] akı ve G-protein aktivasyonuna karışan spesifik yanıt öğelerini içeren muhabir tahlilleri (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) sinyalleri veren basamak11'indaha aşağısındaki olayları inceler. Söz konusu tahlillerin çoğu yüksek iş seviyesi düzeyinde gerçekleştirilebilse de, oldukça hassas, ve bazı tasmaya özgü avantajları övünme (örneğin, gtpγs bağlama durumunda tam / kısmi agonistler, nötr antagonistler ve ters agonistler arasında ayrımcılık, ya da [Ca2 +] ve IP1/3 gibi canlı hücrelerde gut işlevselliği)6, ne yazık ki tüm ilaç GPCR-ome sorgulama uygun mevcut G-protein bağımlı yöntemler vardır. Bu büyük ölçüde birden fazla G-protein alt ailelerin In GPCR yerli kaplin kaynaklanmaktadır, birkaç basamaklı ve yetim G-protein kaplin de bilinmeyen G-protein kaplin sinyal sonuçlanan. Bu sorunu azaltmak için, tahliller promiscuous G-protein kaplin cAMP gibi tek bir ortak sinyal okuma yoluyla zorlamak için geliştirilmiştir, ve Ca2 +, çoğu düşük iş gücü12olsa .
GPCR yaşam döngüsünün önemli bir yönü G-proteinbağımlı sinyalizasyon sona erdirilmesi, büyük ölçüde G-protein ayrıştırma neden β-arrestins işe yoluyla oluşur, ve sonuçta reseptör duyarsızlaştırma, hangi clathrin kaplı internalization için hedeflenen13. Β-arrestinin en yaygın olarak ifade edilen isoformları görsel olmayan β-arrestin1 ve β-arrestin2'dir, ayrıca sırasıyla arrestin-2 ve arrestin-3 olarak da belirtilir,sırasıyla 14. GPCR ligand taramasına yeni bir boyut katan G-protein bağımsız hücre bazlı tahliller girin; reseptör ticareti, etiketsiz tüm hücre ve β-arrestin işe alım tahlilleri dikkate değer örneklerdir. GPCR kaçakçılık tahlilleri reseptör15hedefleyen florofor etiketli ligands veya ko-internalize antikorlar istihdam ederken, etiketsiz tüm hücre tahlilleri ligand tarafından indüklenen hücresel değişiklikleri çevirmek biyosensörler kullanın ölçülebilir çıkışlar, elektrik veya optik sinyaller gibi16. Özellikle, quintessential GPCR- β-arrestin etkileşimleri, fonksiyonel tahlillerin repertoiresinde çekici bir araç olarak β-arrestin işe alım tahlillerini moda eder17. İlk olarak Barnea ve ark. tarafından sadece on yıl önce geliştirilen Tango sistemi, üç eksojen genetik elementin tanıtılmasını içerir: β-arrestin2'den oluşan bir protein füzyonu tütün etch virüs proteazı (TEVp), bir tetrasiklin transaktivator (tTA) tütün etch ile GPCR'ye bağlanır. virüs proteaz dekolte sitesi (TEVcs) ve V2 vazopressin reseptörünün C-terminus bir dizi öncesinde (V2 kuyruk) işe tutuklama teşvik etmek, ve transkripsiyon tarafından tetiklenen bir muhabir luciferase gen β-arrestin2 işe alımını takiben membran demirlemeden serbest bırakılan çekirdeğe tTA transkripsiyon faktörü translokasyonu (Şekil 1)18. GPCR aktivasyonu ve β-arrestin2 işe kantitatif okumalar daha sonra lüminesans için okuma ile belirlenebilir. Önemli bir ayrım reseptör ticareti ve etiketsiz tüm hücre yöntemleri nispeten düşük iş akışı iken, Tango çeşitli avantajları vardır, hedef reseptör ve sinyal entegrasyonu nedeniyle duyarlılık özgü seçici okuma dahil olmak üzere, hangi daha büyük bir ölçekte ligand tarama için uygun bir aday yapmak18.
Kroeze ve ark. bu stratejik özellikler göz önüne alındığında, PRESTO-Tango (Transkripsiyonel Çıktı-Tango ile Paralel Reseptör-ome İfade ve Tarama), paralel ve eşzamanlı bir şekilde ilaçlanabilir GPCR-ome profili tango yaklaşımını kullanan bir yüksek verim açık kaynak platformu19geliştirdi. Neredeyse tüm GPCR'lere β-arrestin2'nin "promiscuous" işe alımını kullanan PRESTO-Tango, hücre bazlı fonksiyonel tahliller açısından türünün ilk türünün ilk günüdür ve yetimler de dahil olmak üzere, G-protein alt familya bağlantısından bağımsız olarak küçük molekül bileşiklerinin hemen hemen tüm koku dışı KPCR'larda hızlı "ilk tur" taranmasını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>12-566-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-565-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>LUCNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15&#8211;300 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5&#8211;100 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Platemate 2x3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>801-10001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroBeta 1450 Wallac</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>450-201-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Kit #1000000068</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

parallel interrogation of &#946;-arrestin2 recruitment for ligand screening on a gpcr-wide scale using presto-tango assay

Hücresel sinyal yollarının en büyük ve en çok yönlü gen superfamily ve arabulucuları olarak, G-protein-coupled reseptörleri (GPCR) ilaç endüstrisi için en umut verici hedeflerinden birini temsil eder. Ergo, gpcr ligand tarama testlerinin tasarımı, uygulanması ve optimizasyonu çok önemlidir, çünkü ilaç keşfi ve GPCR farmakolojisi ve sonuçlarını manipüle etmek için uzaktan kumanda araçlarını temsil etmektedirler. Geçmişte, G-protein bağımlı tahliller, ligand kaynaklı olayları tespit ve ikincil habercilerin nesil ölçme, araştırma bu alanda tiplenmiş. Ancak, fonksiyonel seçicilik gelişiyle, yanı sıra diğer birçok G protein-bağımsız yollar ve G-protein bağımlı tahliller ile ilişkili sınırlamalar artan bir farkındalık bu yana, alternatif oluşturulması yönünde daha büyük bir itme var GPCR ligand tarama tahlilleri. Bu çabaya doğru, böyle bir kaynağın uygulanmasını, PRESTO-Tango platformunun, insan GPCR-ome'nin paralel ve eşzamanlı sorgulamasını sağlayan, daha önce düşünülen bir başarıolan, teknik ve ekonomik açıdan mümkün değildir. G-protein bağımsız β-arrestin2 işe alım testini temel alan, GPCR'lerde β-arrestin2 aracılı insan ticaretinin ve sinyalizasyonunun evrenselliği, PRESTO-TANGO'yu yaklaşık 100'ü dahil olmak üzere yaklaşık 300 omalımsız insan KPCR'ı incelemek için uygun bir araç haline getirir. yetim reseptörleri. PRESTO-Tango'nun duyarlılığı ve sağlamlığı, bilinen ilaçlar için yeni GPCR hedeflerini ortaya çıkarmak veya yetim reseptörleri için yeni ligandlar keşfetmek için kullanılan bileşik kütüphaneleri kullanarak birincil yüksek iş yapma ekranları için uygun hale getirir.

Burada sunulan PRESTO-Tango protokolü kullanılarak, bir kromofin granül (CG) ekstresi 168 koku vermeyen GPCR hedeflerine karşı tarandı ve çoğunluğu yetim reseptörleri. Barnea ve ark.18 tarafından tasarlanan ilkeye göre seçilen reseptörlerde β-arrestin2 mobilizasyonu incelenerek bu özün profillenmesi gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). İlgi çekici GPCR'lerin plazmid cDNA'sı PRESTO-Tango GPCR Kiti'nden alınmış ve istenilen düzende iki adet 96 iyi...

Watch this Scientific Journal Video about Parallel Interrogation of ÃŽÂ²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay at JoVE.com

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

GPCR'lerin cazip ilaçlanabilir hedefler olduğu göz önüne alındığında, GPCR ligand taraması böylece kurşun bileşiklerinin belirlenmesi ve yetimleşme çalışmaları için vazgeçilmezdir. Bu çalışmalara yönelik olarak, TEV tabanlı bir muhabir tsay'ı kullanarak yaklaşık 300 KPCR'de geçici β-arrestin2 alımının eşzamanlı olarak profilini çıkarmak için kullanılan açık kaynak kaynak platformu PRESTO-Tango'u tanımlıyoruz.

Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Presto-Tango platformu, insan genomundaki tüm koku almayan GPCR'lerin paralel ve eşzamanlı sorgulamasını yürütmek için geliştirilmiştir. Presto-Tango platformu paralel bir yaklaşımla tüm GPCR genom profilleme için tek açık kaynak kaynak, bir G protein bağımsız beta-arrestin işe alım testi kullanarak. İşlemcinin gösterdiği şey laboratuvarımda Araştırma Görevlisi Genevieve Laroche ve laboratuvarımda doktora adayı olan Manel Zighal olacak.İşleme başlamadan önce 384 optik alt plakanın her kuyusuna mililitre poli-L-l-lizin çözeltisi başına 20 mikrolitre 20 mikrolitre ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında 30 dakika ile iki saat arasında kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, fazla poli-L-lizin kaldırmak ve her kuyuya antibiyotik antimikotik çözelti 40 mikrolitre eklemek için lavabo üzerinde plakaları flick. Daha sonra hücre tohumlama için gerekli olan plakaları 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve plakaların geri kalanını uzun süreli depolama için dört santigrat dereceye yerleştirin.Birincil tarama için HTLA hücrelerini tohumlamak için, 150 milimetre hücre kültürlerini 10 mililitre PBS ile hafifçe durulayın ve kültürleri çanak başına %0,05 tripsin EDTA'nın altı mililitresi ile tedavi edin. Hücreler havuz ayırdığında hücre, eşit miktarda DMEM içeren 50 mililitrelik konik bir tüpte süspansiyonlar oluşturur. Ve santrifüj ile hücreleri toplamak.DMEM konsantrasyonu mililitre başına beşinci hücrelere 2,2 kez 10 pelet yeniden askıya ve antibiyotik antimykotik çözelti kaldırmak için lavabo üzerinde plakaları flick. Kuru ve her kuyuiçine hücrelerin 45 mikrolitre tohum için plakaları dokunun. Sonra 37 derece santigrat ve% 45 karbondioksit bir gecede plakaları yerleştirin.Transfeksiyon için 384 iyi DNA kaynak plaka hazırlamak için her plazmid ücretsiz DNA mililitre başına 50 nanogram dağıtmak gprc Tango ilgi 0.1X Tris-EDTA ilgi yapısı 96 iyi plaka her kuyu içine. 96 kuyu plakasının her kuyudan 10 mikrolitre DNA çözeltisini, gösterildiği gibi her durum için dört katına çıkarak 384 kuyulu DNA kaynak plakasının tek tek kuyularına elle aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra, DNA kaynak plakasının her kuyuya 0,313 molar kalsiyum klorür çözeltisinin 40 mikrolitresini aktarın ve her kuyunun içeriğini nazikçe karıştırın.Nazik karıştırma ile 384 iyi DNA kaynak plakaher kuyuya 2x HEPES tampon 50 mikrolitre ekleyin. Bir dakika sonra 384 iyi DNA kaynak plakasından 10 mikrolitre DNA transfeksiyon karışımını tohumlu HTLA hücrelerinin her bir kuyusuna aktarın ve hücre kültürü ndeki hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün transfected hücre orta decant ve yavaş yavaş her iyi doğrudan hücrelere dokunmamaya dikkat ederek açlıktan orta 40 mikrolitre ekleyin.Daha sonra hücre kültürü kuluçka plaka dönmeden önce, alternatif satıriçine üç kez konsantrasyon ilgi bileşik 20 mikrolitre bileşik olmadan alternatif satırlar için araç tampon 20 mikrolitre ekleyin. 16 ila 24 saat transfected hücre orta decant ve ışıktan korunan oda sıcaklığında beş ila 20 dakikalık kuluçka için her kuyuya taze hazırlanmış kızdırma reaktif 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra kuyu başına bir saniyelik bir entegrasyon süresi ile bir mikro plaka lüminesans sayacı üzerinde plakaları okuyun.İkincil bir tarama için, altkültür 100 milimetrelik yemeklerde HTLA hücreleri beş kez 10 altı hücre toplam hücre yoğunluğu 11 milimetre tam orta çanak başına 24 saat boyunca 37 santigrat derece. Ertesi gün, 10 mikrogram GPCR ücretsiz DNA ile 500 mikrolitre Tris-EDTA kalsiyum klorür çözeltisi ile girdap ve ardından 500 mikrolitre HEPES tampon ilavesi ilave edildi. Güçlü sallayarak sonra, oda sıcaklığında bir dakika için çözüm kuluçka ve hemen hücrelerin üzerine akıllıca çözelti damla bir mililitre ekleyin.Yavaşça eşit çökelti dağıtmak ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece plaka yerleştirin kaya. Ertesi gün, floresan hücre görüntüleyicialtında transfeksiyon verimliliğini kontrol edin. %50'den büyük işlemler idealdir.Hücreleri %0.05 tripsin EDTA'nın üç mililitresi ile ayırmadan önce transfeced hücreleri versene solüsyonu ile hafifçe durulayın. Santrifüj ile ayrışmış hücreleri toplamak ve dört kez 10 açlıktan orta konsantrasyon mililitre başına beşinci hücrelere pelet yeniden askıya. Daha sonra poli-L-lizin kodlu 384 iyi plaka her kuyuiçine hücrelerin 45 mikrolitre tohum ve en az dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin.Yarım günlük doz eğrisi yanıt plakası hazırlamak için 270 mikrolitre HBSS hepes ve antibiyotik antimikotik ile tüm ama 96 iyi plaka son satırı na eklenmiş ve her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi eklemek her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi eklemek her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi eklemek her yüksek ve düşük ilaç çözeltisi ekleyin sıra H.Transfer her kuyudan satır H her kuyudan karıştırma ile satır G karşılık gelen kuyuiçine çözüm ve seri karıştırma ile ilaç bileşikleri seyreltmeye devam ulaşılır. Şemayı referans olarak kullanarak, A ile G satırlarından 96 kuyu plakasının 20 mikrolitrelik düşük sütun seyreltmelerini ve yüksek sütun seyreltmelerinin 20 mikrolitresini, daha önce oturmuş 384 kuyu plakasının H'si ile B kuyularına karıştırın. Sonra en az 16 saat boyunca 37 santigrat derecede plaka kuluçka.16 ila 24 saat transfected hücre orta decant ve iyi başına bir entegrasyon süresi ile bir mikro plaka lüminesans sayacı üzerinde plakaları okumadan önce beş ila 20 dakikalık kuluçka için her kuyuya kızdırma reaktif 20 mikrolitre ekleyin. Bu temsili deneyde, birincil taramada sorgulanan 168 GPCR'den sadece dopamin reseptörü D3 ve opsin 5 potansiyel aktif hedef olarak rakipti. Dopamin reseptörü D3 4.7'nin 2.7'lik önemli bir log2 kat değişimini, opsin 5'in ise 2.39'luk biraz daha düşük bir yanıt üretti.Karşılaştırma, dopamin reseptörü D2, birincil ekran için pozitif kontrol 4.58 bir log2 kat değişim üretti. Sekonder taramadan alınan bu tepki eğrileri, kromatin granül ekstresinin, dopamin reseptörü D3'te aktif bir vuruş olarak geçerliliğini doğrulayan, yarı maksimal etkili konsantrasyon değerlerinde benzer sinyal pencereleri ürettiğini göstermiştir. Negatif kontrol benzer düz bir doz eğrisi opsin için üretildi 5 Ancak kromatin granül ekstresi için olası bir hedef olarak bu reseptör ümidin. Presto-Tango hücre dağılımında variabilities olarak özel bakım gerektirir, transfection verimliliği ve seri ilaç seyreltme bileşik hata neden olabilir, hangi verilerin doğruluğunu etkileyebilir.Radyoligand-bağlayıcı yaklaşımlar, Bioluminesans Rezonans Enerji Transferi ve Döngüsel AMP kalsiyum ve içselleştirme fonksiyonel tahlilleri gibi ortogonal yöntemler ligand reseptör etkileşimlerini daha fazla doğrulamak ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...