Name: mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products
Uploaded: 2020-03-12T13:00:00
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这项研究的财政支助由圣保罗研究基金会-FAPESP（2019/10564-5， 2014/12727-5 和 2014/50249-8 到 L.G.O; 2013/12598-8 和 2015/01013-4 到 R.S.; 和 2019/08853-9 到 C.F.F.A. 。B.S.P.、C.F.F.A.和L.G.O.获得国家科学和技术发展委员会（CNPq）研究金（205729/2018-5、162191/2015-4和313492/2017-4）。L.G.O.还感谢《妇女参与科学》方案（2008年，巴西版）提供的赠款支持。所有作者都承认CAPES（高等教育人员改进协调）支持巴西的毕业后课程。

1. 生物合成基因簇的基因组挖掘
<ol><li>执行全基因组测序 （WGS） 作为选择用于 MS 引导基因组挖掘的生物合成基因簇 （BCG） 的第一步。感兴趣的菌株（细菌）的全基因组草案可以通过光明会MiSeq技术获得，使用以下高质量基因组DNA：猎枪TruSeqPCR免费库准备和NexteraMate配对库准备工具包33。 注：测序后，可以使用纽布勒 v3.0（罗切， 454） 汇编程序（在 <https：//ngs.csr.uky.edu/Newble...

该协议的最大优点是能够快速去复制代谢特征，并将基因组信息与MS数据桥接，以阐明新分子的结构，特别是结构模拟2。根据基因组信息，可以研究不同的天然产物化学型，如多基肽（PK）、非核糖类肽（NRP）和糖基化天然产物（GNP），以及神秘的BFC。 Metabolomic筛选可产生实验室条件下特定菌株产生的活性BGC轮廓和化学多样性的证据。因此，BGC 可以克隆，以直接生产与已知 BGC ?...

二次代谢的研究通常包括筛选特定生物活动的粗提取物，然后对属于活性馏分的成分进行纯化、识别和表征。事实证明，这一过程是有效的，促进了若干化学实体的隔离。然而，现在这被认为是不可行的，主要是因为高的重新发现率。由于制药业在不了解特殊代谢物的作用和功能的情况下进行了革命，其鉴定是在实验室条件下进行的，没有准确代表自然1。今天，人们更好地了解了自然信号的影响、分泌，以及大多数目标在检测出的低浓度下的存在。此外，对这一过程的监管将有助于学术界和制药业利用这一知识。它还将有利于与沉默生物合成基因簇（BGCs）2相关的代谢物的直接分离研究。2
在此背景下，基因组测序的进步重新产生了对筛选微生物代谢物的兴趣。这是因为分析未发现的生物合成簇的基因组信息可以揭示基因编码在实验室条件下未观察到或生产的新化合物。许多微生物全基因组项目或草案今天可用，而且数量每年都在增长，这为通过基因组挖掘33、44发现新的生物活性分子提供了巨大的前景。
生物合成基因簇图集是目前最大的自动挖掘基因簇集合，作为联合基因组研究所（JGI IMG-ABC）2集成微生物基因组平台的组成部分。2最近，生物合成基因簇（MIBiG）标准化倡议的最低信息促进了BPC的手动再注释，提供了高度精心策划的参考数据集5。如今，大量的工具可用于计算挖掘遗传数据及其与已知次生代谢物的连接。还制定了不同的策略，以获取新的生物活性天然产品（即异构表达、靶基因删除、体外重组、基因组序列、同位素引导筛选[基因同位素方法]、操纵本地和全球监管机构、基于抗药性的采矿、培养独立采矿，以及最近MS引导/编码方法2,2、6、7、8、9。6,7,8,9,1010、11、12、13、14、15。,11,12,13,14,15
基因组挖掘作为一种单一策略，需要努力对单个或一小群分子进行批批;因此，在将新化合物列为隔离和结构阐明的优先位置的过程中仍然存在差距。原则上，这些方法每次实验只针对一种生物合成途径，从而导致缓慢发现速度。从这个意义上说，使用转基因和分子网络方法是天然产品研究的一个重要进步14，15。14,
液相色谱-质谱（LC-MS）的多功能性、准确性和高灵敏度使其成为复合鉴定的好方法。目前，几个平台已经投资算法和软件套件的无目标代谢组16，17，18，19，20。16,17,18,19,20这些程序的核心包括特征检测（峰值选取）21和峰值对齐，这允许在一批样本中匹配相同的特征并搜索模式。基于MS模式的算法22，23,23比较特征破碎模式，匹配MS2的相似性，生成共享结构特征的分子族。这些特征可以突出和聚类，赋予快速发现已知和未知的分子从复杂的生物提取物通过串联MS2，24，252,24,25的能力。因此，串联MS是一种多功能方法，用于同时获取大量数据中包含的几种化学型的结构信息。
全球天然产物社会分子网络（GNPS）26算法使用规范化片段离子强度来构造多维向量，其中相似性使用原成函数进行比较。不同父离子之间的关系在关系图表示形式中绘制，其中每个碎片都可视化为节点（圆），每个节点的相关性由边缘（线）定义。单一来源分子的全球可视化被定义为分子网络。结构上分裂分子，独特的碎片将形成自己的特定簇或星座，而相关分子聚集在一起。聚类化学型允许假设其生物合成起源类似的结构特征连接。
在建立BGC及其小分子产品之间的生物信息学联系时，将化学型到基因型和基因型到化学型的方法结合起来是强大的。因此，MS引导基因组挖掘是一种快速方法和低耗材料策略，它有助于在不同代谢和环境条件下，WGS揭示的一个或多个菌株的母离子和生物合成途径。
该协议的工作流程（图1）包括将WGS数据输入生物合成基因簇注释平台，如反SMASH28、29、30。28,29,30它有助于估计由基因组编码的化合物和化合物的种类。必须采用一种以生物合成基因簇为目标的策略，编码感兴趣的化学实体，并分析含有BGC的野生型菌株和/或异质菌株的培养提取物，以利用GNPS26、31,31的相似性生成聚类离子。因此，可以识别与目标 BGC 关联的新分子，并且数据库中不可用（主要是未知的类似物，有时以低脚点生成）。考虑用户可以为这些平台做出贡献，并且生物信息学和 MS/MS 数据的可用性正在迅速增加，从而推动有效计算工具和算法的不断发展和升级，从而指导复杂提取物与分子的有效连接， 这是相关的。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60825/60825fig1b.jpg"> 图 1：整个工作流的概述。如图所示，说明了在所述 MS 引导基因组挖掘方法中涉及的生物信息学、克隆和分子网络步骤，以识别新的代谢物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60825/60825fig1blarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
该协议描述了一个快速而高效的工作流程，将基因组挖掘和分子网络结合为天然产品发现管道的起点。尽管许多应用能够可视化一个网络中MS可检测分子的组成和关联性，但此处采用了几种来可视化结构相似的聚类分子。利用这一策略，成功鉴定了在链球菌孢菌剂2042代谢提取物中观察到的新型环丙肽产物。在基因组挖掘的指导下，对华利霉素进行全生物合成基因簇编码被识别和克隆成生产者菌株链球菌素M1146。最后，在MS模式分子网络之后，MS检测到的分子与负责其生物成形的BPC相关。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td>AA1120-048</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apramycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2024</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9231</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3175</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column C18</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>ZORBAX RRHD Extend-C18, 80&#197;, 2.1 x 50 mm, 1.8 &#181;m, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manitol P.A.- A.C.S.</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>5418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F548S</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>6550 iFunnel Q-TOF LC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose P.A.- A.C.S.</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker/Incubator</td>
			<td>Marconi</td>
			<td>MA420</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>P. A. - ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy extract</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>P. A. - ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycles</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Mastercycler Nexus Gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8902</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Soy Broth</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>1290 Infinity LC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products

天然产品所覆盖的化学空间是巨大的，而且被广泛地未被识别。因此，需要方便的方法对其在性质和潜在的人类利益（例如，药物发现应用）的功能进行广泛的评估。该协议描述了基因组挖掘 （GM） 和分子网络 （MN） 的组合，这两种现代方法将全基因组测序中的基因簇编码注释与粗代谢提取物的化学结构特征相匹配。这是发现新的自然实体的第一步。这些概念，当一起应用，在这里被定义为MS引导基因组挖掘。在此方法中，主要组件以前被指定（使用 MN），并且与结构相关的新候选项与基因组序列注释（使用 GM）相关联。将GM和MN结合是一种有利可图的策略，旨在瞄准新的分子骨干或收获代谢特征，以便识别已知化合物中的类似物。

该协议成功地利用基因组挖掘、异构表达和MS引导/代码方法的组合来获取新的专用华霉素模拟分子。目标（Valinomycin ）的基因组到分子工作流在图8中表示。链球菌sp.CBMAI 2042草案基因组在silico中进行分析，然后确定VLM基因簇并将其转移到异质宿主。异质菌株和野生菌株采用适当的发酵条件，用乙酸乙酯进行分，并浓缩产生粗提取物。从该产品中，获取了MS/MS数据，以生...

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Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

这里建立了一个质谱仪指导基因组挖掘协议并对此进行描述。它基于基因组序列信息和LC-MS/MS分析，旨在促进从复杂的微生物和植物提取物的分子的识别。

质谱导览基因组挖掘作为发现新天然产品的工具

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

全基因组测序、基因组挖掘和分子网络构成了我们在此描述的基因组挖掘协议的质谱学指南的基础。也是自然产品发现中最现代的方法。基因组挖掘和分子网络在集群中匹配，在全基因组测序的编码注释中，用粗提取物的化学重组特征提供巨大的前景，通过活性分子发现肚脐。原则上，基因组挖掘每个实验都针对一组或一小群分子。从而导致发现速度缓慢。从这个意义上说，将基因组挖掘与分子网络一起使用是天然产品研究的重要进展。质谱指南基因组挖掘是一种通用的方法，它可以同时从粗提取物中同时构造大量数据中包含的几种化学类型的信息。今天，它是高范围的方法，能够探索细菌，真菌或植物序列提供。化学型到基因型和基因型到化学型生物信息学联系生物合成集群和小分子产品。听程序被证明特征肚脐周期深度肽类产品观察到的链球菌物种的代谢提取物。但它也适用于真菌和植物序列和提取物。拥有精心策划的基因组数据集非常重要，而现在，碎片化的序列草案已越来越多地被接近完成的序列数据所取代。此外，还制定了不同的战略来获取新的生物活性天然产品，并肯定将它们与MS-Guide方法相结合。我们将在天然产品隔离和结构解释方面改进。由于我们在这里连接基因型和化疗方法，生物合成集群和有小分子产品之间的生物信息学联系是至关重要的。估计化合物的种类和种类，并按基因组进行编码。这意味着复制。稍后，可以使用 GNPS 预制基于离子相似性的聚类。演示这个程序将是雷纳塔·西格里斯特博士和安戈利尼教授，我的合作者在这项研究。从完整的序列基因组获得关于二次代谢基因簇注释的硅信息。将序列文件、基因库 E-M-B-L 或更快的格式提交到防粉碎平台。因此，像基于最相似的已知集群的输出数据中感兴趣的基因集群。根据BGC的DNA序列信息，设计20至25个核苷酸之间的原位，在生态链球菌的基因簇之间进行侧翼。人工染色体库筛选。根据手稿获得重组异质生物体后，在适当的发酵介质中接种100分之一的菌株预培养。如液体 ISP2 介质。将培养物在 30 摄氏度和 220 RPM 的孵化器上放置 7 天。接种后，在2200次G下离心10分钟。丢弃细胞，将上流液转移到分离漏斗中。加入一至一卷乙酸乙酯并摇动。等待一到三分钟，让有机层和默许层分离。并收集在埃伦迈尔烧瓶中的有机层。获取 MS/MS 数据。使用控制软件编程适合 HPLC 和质谱方法。需要指出的是，MS/MS网络是给定质谱条件下的可检测分子网络。使用 MS 从 protea 向导转换将质谱转换为 mzXML 格式。调整转换的输入参数。将转换后的 LC-MS/MS 文件上载到 GNPS 数据库中。有两个选项可用。使用文件传输协议或直接在浏览器中通过在线平台。在 GNPS 中创建帐户后，登录到创建的帐户并选择创建分子网络。添加职位。执行基本选项。选择 mzXML 文件以执行分子网络。将它们组织到最多六个组中。因此，就像重复数据消除例程的库一样。选择前体离子质量公差和碎片 Da 的质量公差分别为 0.02 道尔顿和 0.05 道尔顿。要执行高级网络选项，请选择直接影响网络群集大小和形式的参数。高级参数在 GNPS 文档中。选择一个电子邮件地址，在工作完成时接收警报并提交作业。分析 GNPS 结果。登录到 GNPS。选择作业、已发布作业、已完成以打开作业。打开一个网页，显示从分子网络获得的所有结果。选择浏览器网络可视化工具中的视图频谱系列以查看所有网络群集。将显示包含所有生成的分子网络群集的列表。所有 ID 中都显示暂定分子识别。选择"显示"以可视化它们。要分析分子网络聚类，请选择可视化网络。在节点标签框中，选择父质量。在"边缘标签"框中，选择"共同签名"或"增量 Emz"。分别观察节点之间的节点相似性或质量差。在多组分析的情况下，单击节点着色框中的绘制饼图。观察每个节点在每个组中显示的频率。要查看所有库，请选择视图、所有库、命中。直接在 GNPS 平台中打开碎片光谱。或在原始原始文件中手动确认重复化合物和相关化合物的结构解释。该协议成功地结合了基因组挖掘、异质表达和MS引导代码方法。访问新的专用瓦利诺霉素和模拟分子。此处介绍了目标瓦利霉素的基因组到分子工作流程。色谱表明，瓦利诺霉素、蒙塔纳他汀和五个类似物是由异质宿主中的生物合成基因簇表达产生的。分子网络离子对应于瓦利霉素，一种已知化合物与相应的生物合成基因集群注释在链球菌物种，CBM AI两零四两基因组。聚类与类比相关的离子，首先描述为瓦利霉素生物合成基因簇。此处显示了瓦利霉素和相关类比的 MS 光谱和化学结构。执行全基因组测序和适当的数据集整理是选择生物合成集群作为MS指导基因组挖掘的第一步。整个过程可以执行与野生类型字符串粗提取物，但你可以选择你感兴趣的基因簇，并促进异质表达。介绍了从DNA样本中捕获整个生物合成基因簇的不同方法。该协议最大的优势是它能够快速复制代谢配置文件和繁殖基因组信息与MS数据。为了阐明这些如新分子。多丽丝·奇姆及其同事在肽基因组学和糖原学领域首次描述了大规模指南基因组挖掘。在引入NPS综合代谢组学和基因组挖掘方法后，已成为将分子网络与生物合成能力连接的最通用途径。

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