Name: mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products
Uploaded: 2020-03-12T13:00:00
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Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dalla Fondazione ricerca di San Paolo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 e 2014/50249-8 a L.G.O; 2013/12598-8 e 2015/01013-4 a R.S.; e 2019/08853-9 a C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A. e L.G.O. hanno ricevuto borse di studio dal Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 e 313492/2017-4). L.G.O. è anche grato per il sostegno alla borsa di studio fornito dal programma For Women in Science (2008, edizione brasiliana). Tutti gli autori riconoscono CAPES (Coordinamento per il Miglioramento del Personale per l'Istruzione Superiore) per aver sostenuto i programmi post-laurea in Brasile.

1. Estrazione del genoma per cluster genici biosintetici
<ol><li>Eseguire il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) come primo passo per eleggere un cluster genico biosintetico (BCG) per l'estrazione del genoma guidata dalla MS. L'intero genoma del ceppo di interesse (batteri) può essere ottenuto dalla tecnologia Illumina MiSeq utilizzando quanto segue con DNA genomico di alta qualità: fucile TruSeq PCR-Free library prep e Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33. NOTA: dopo la sequenza...

Il vantaggio più forte di questo protocollo è la sua capacità di dereplicare rapidamente i profili metabolici e le informazioni genomiche del ponte con i dati MS al fine di chiarire le strutture di nuove molecole, in particolare analoghi strutturali2. Sulla base di informazioni genomiche, è possibile studiare chemiotipi di prodotti naturali diversi, come i polionidi (PK), i peptidi non ribonsuici (NRP) e i prodotti naturali glicosillati (GNP), nonché gli screening metabolomici criptici. Così...

Le indagini sul metabolismo secondario spesso consistono nello screening di estratti grezzi per specifiche attività biologiche seguite da purificazione, identificazione e caratterizzazione dei costituenti appartenenti a frazioni attive. Questo processo si è dimostrato efficiente, promuovendo l'isolamento di diverse entità chimiche. Tuttavia, al giorno d'oggi questo è visto come irrealizzabile, principalmente a causa degli alti tassi di riscoperta. Come l'industria farmaceutica rivoluzionato senza conoscenza dei ruoli e le funzioni di metaboliti specializzati, la loro identificazione è stata effettuata in condizioni di laboratorio che non rappresentavano con precisione la natura1. Oggi, c'è una migliore comprensione delle influenze di segnalazione naturale, secrezione, e la presenza della maggior parte degli obiettivi a concentrazioni non rilevabili basse. Inoltre, la regolamentazione del processo aiuterà la comunità accademica e l'industria farmaceutica a trarre vantaggio da queste conoscenze. Ne beneficeranno anche la ricerca che coinvolgerà l'isolamento diretto dei metaboliti legati ai cluster genici biosintetici silenziosi (BCC)2.
In questo contesto, i progressi nel sequenziamento genomico hanno rinnovato l'interesse per i metaboliti dei microrganismi di screening. Questo perché l'analisi delle informazioni genomiche degli ammassi biosintetici scoperti può rivelare geni che codificano nuovi composti non osservati o prodotti in condizioni di laboratorio. Molti progetti o correnti d'aria microbici dell'intero genoma sono oggi disponibili, e il numero è in crescita ogni anno, fornendo enormi prospettive per scoprire nuove molecole bioattive attraverso l'estrazione del genoma3,4.
L'Atlante dei cluster di geni biosintetici è la più grande collezione di cluster genici estratti automaticamente come componente della piattaforma integrata dei genomi microbici del Joint Genome Institute (JGI IMG-ABC)2. Più recentemente, la Minimum Information for Biosynthetic Gene Clusters (MIBiG) Standardization Initiative ha promosso la riannotazione manuale dei BMC, fornendo un set di dati di riferimento altamente curato5. Al giorno d'oggi, sono disponibili molti strumenti per consentire l'estrazione computazionale dei dati genetici e la loro connessione ai metaboliti secondari noti. Sono state inoltre sviluppate diverse strategie per accedere a nuovi prodotti naturali bioattivi (ad esempio, espressione etetologa, cancellazione genica mirata, ricostituzione in vitro, sequenza genomica, screening guidato da isotopi [approccio genomitopico], manipolazione delle autorità di regolamentazione locali e globali, estrazione basata su target di resistenza, estrazione indipendente dalla cultura e, più recentemente, approccio al codiceMS 2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).
L'estrazione del genoma come strategia singolare richiede sforzi per annotare un singolo o un piccolo gruppo di molecole; pertanto, permangono lacune nel processo in cui i nuovi composti sono prioritari per l'isolamento e la chiarificazione della struttura. In linea di principio, questi approcci si rivolgono a un solo percorso biosintetico per esperimento, con conseguente rallentamento del tasso di scoperta. In questo senso, l'utilizzo di GM insieme a un approccio di rete molecolare rappresenta un importante progresso per la ricerca sui prodotti naturali14,15.
La versatilità, la precisione e l'elevata sensibilità della spettrometria cromatografica-massa liquida (LC-MS) lo rendono un buon metodo per l'identificazione composta. Attualmente, diverse piattaforme hanno investito algoritmi e suite software per metabolomica non mirata16,17,18,19,20.20 Il nucleo di questi programmi include il rilevamento delle funzionalità (picco di raccolta)21 e l'allineamento di picco, che consente la corrispondenza di funzionalità identiche in un batch di campioni e la ricerca di modelli. Gli algoritmi basati su modelli MS22,,23 confrontano i modelli di frammentazione caratteristici e corrispondono alle somiglianze ms2 generando famiglie molecolari che condividono caratteristiche strutturali. Queste caratteristiche possono quindi essere evidenziate e raggruppate, conferendo la capacità di scoprire rapidamente molecole note e sconosciute da un complesso estratto biologico in tandem MS2,24,25. Pertanto, la SM in tandem è un metodo versatile per ottenere informazioni strutturali su diversi chemiotipi contenuti contemporaneamente in una grande quantità di dati.
L'algoritmo Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 utilizza l'intensità degli ioni di frammento normalizzati per costruire vettori multidimensionali, in cui le somiglianze vengono confrontate utilizzando una funzione coseno. La relazione tra i diversi ioni padre viene tracciata in una rappresentazione del diagramma, in cui ogni frammentazione viene visualizzata come nodo (cerchi) e la correlazione di ogni nodo è definita da uno spigolo (linee). La visualizzazione globale delle molecole provenienti da un'unica fonte è definita come una rete molecolare. Molecole strutturalmente divergenti che si frammentano in modo univoco formeranno il proprio ammasso o costellazione specifica, mentre le molecole correlate si raggruppano. I chemiotipi di clustering consentono l'ipotetica connessione di caratteristiche strutturali simili alle loro origini biosintetiche.
La combinazione di approcci chemiotipo-genotipo e genotipo è potente quando si creano collegamenti bioinformatici tra BCC e i loro piccoli prodotti molecolari27. Pertanto, l'estrazione del genoma guidata dalla MS è un metodo rapido e una strategia a basso consumo di materiali e aiuta a colmare gli ioni dei genitori e le vie biosintetiche rivelate dal WGS di uno o più ceppi in diverse condizioni metaboliche e ambientali.
Il flusso di lavoro di questo protocollo (Figura 1) consiste nell'inserire i dati WGS in una piattaforma di annotazione del cluster di geni biosintetici come antiSMASH28,29,30. Aiuta a stimare la varietà di composti e la classe di composti codificati dal genoma. Deve essere adottata una strategia per colpire un cluster di geni biosintetici che codifica un'entità chimica di interesse, e gli estratti di coltura da un ceppo di tipo selvaggio e/o ceppo eteboloso contenente il BGC possono essere analizzati per generare ioni raggruppati in base alle somiglianze utilizzando GNPS26,31. Di conseguenza, è possibile identificare nuove molecole che si associano al BGC mirato e non sono disponibili nel database (principalmente analoghi sconosciuti, a volte prodotti in elementi bassi). È importante considerare che gli utenti possono contribuire a queste piattaforme e che la disponibilità di bioinformatica e dati MS/MS sta aumentando rapidamente, spingendo a uno sviluppo costante e l'aggiornamento di strumenti e algoritmi computazionali efficaci per guidare connessioni efficienti di estratti complessi con molecole.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60825/60825fig1b.jpg"> Figura 1: Panoramica dell'intero flusso di lavoro. È mostrato un'illustrazione delle fasi bioinformatiche, clonazione e networking molecolare coinvolte nell'approccio descritto nell'estrazione del genoma guidato dalla Ms per identificare nuovi metaboliti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60825/60825fig1blarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro rapido ed efficiente per combinare l'estrazione del genoma e la rete molecolare come punto di partenza per la pipeline di scoperta naturale dei prodotti. Anche se molte applicazioni sono in grado di visualizzare la composizione e la relatedness delle molecole rilevabili dalla MS in una rete, diverse sono adottate qui per visualizzare molecole raggruppate strutturalmente simili. Utilizzando questa strategia, vengono identificati con successo nuovi prodotti ciclodepsipeptide osservati negli estratti metabolici di Streptomyces sp. CBMAI 2042. Guidato dall'estrazione del genoma, l'intera codifica del cluster genico biosintetico per le valiomiciche è riconosciuta e clonata nel ceppo produttore Streptomices coelicolor M1146. Infine, a seguito di una rete molecolare basata su modelli di SM, le molecole rilevate dalla SM sono correlate con i BMC responsabili della loro biogenesi32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td>AA1120-048</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apramycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2024</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9231</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3175</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column C18</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>ZORBAX RRHD Extend-C18, 80&#197;, 2.1 x 50 mm, 1.8 &#181;m, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manitol P.A.- A.C.S.</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>5418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F548S</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>6550 iFunnel Q-TOF LC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose P.A.- A.C.S.</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker/Incubator</td>
			<td>Marconi</td>
			<td>MA420</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>P. A. - ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy extract</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>P. A. - ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycles</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Mastercycler Nexus Gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8902</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Soy Broth</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>1290 Infinity LC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products

Lo spazio chimico coperto da prodotti naturali è immenso e ampiamente non riconosciuto. Pertanto, sono desiderate metodologie convenienti per eseguire una valutazione ad ampio raggio delle loro funzioni in natura e potenziali benefici umani (ad esempio, per applicazioni di scoperta di farmaci). Questo protocollo descrive la combinazione di estrazione del genoma (GM) e networking molecolare (MN), due approcci contemporanei che corrispondono alle annotazioni con codifica a cluster genico nel sequenziamento dell'intero genoma con le firme della struttura chimica da estratti metabolici grezzi. Questo è il primo passo verso la scoperta di nuove entità naturali. Questi concetti, se applicati insieme, sono qui definiti come estrazione genomica guidata da MS. In questo metodo, i componenti principali sono designati in precedenza (utilizzando MN) e i nuovi candidati strutturalmente correlati sono associati alle annotazioni della sequenza del genoma (utilizzando GM). La combinazione di GM e MN è una strategia redditizia per colpire nuove spinadorsali molecolari o raccogliere profili metabolici al fine di identificare analoghi da composti già noti.

Il protocollo è stato esemplificato con successo utilizzando una combinazione di estrazione del genoma, espressione etetologa e approcci MS-guidato/codice per accedere a nuove molecole specializzate di analoghi di valinomicina. Il flusso di lavoro genoma-molecola per il bersaglio, la valiomicina (VLM), è rappresentato nella Figura 8. Il genoma del progetto CBMAI 2042 è stato analizzato in silico e il cluster genico VLM è stato quindi identificato e trasferito in un ospite etelog...

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Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

Un protocollo di estrazione del genoma guidato dalla spettrometria di massa è stabilito e descritto qui. Si basa sulle informazioni sulla sequenza genomica e sull'analisi LC-MS/MS e mira a facilitare l'identificazione di molecole da complessi estratti microbici e vegetali.

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining come strumento per scoprire nuovi prodotti naturali

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Il sequenziamento dell'intero genoma, l'estrazione del genoma e la messa in rete molecolare costituiscono la base per la guida alla spettrometria di massa che il protocollo di estrazione del genoma che descriviamo qui. E sono l'approccio più contemporaneo nella scoperta di prodotti naturali. L'estrazione del genoma e la messa in rete molecolare corrispondono in cluster, in annotazioni codificate nel sequenziamento dell'intero genoma con firme di ristrutturazione chimica da estratti grezzi che offrono enormi prospettive per scoprire l'ombelico da parte di molecole attive.In linea di principio, l'estrazione del genoma prende di mira un singolo o un piccolo gruppo di molecole per esperimento. Ciò si traduce in un tasso di individuazione lento. In questo senso, l'utilizzo dell'estrazione del genoma insieme alla rete molecolare rappresenta un importante progresso per la ricerca sui prodotti naturali.L'estrazione della guida-genoma della spettrometria di massa è un metodo versatile in grado di strutturare contemporaneamente le informazioni di diversi chemiotipi contenuti nella grande quantità di dati provenienti da un estratto grezzo. Oggi è una metodologia di alta gamma in grado di esplorare la sequenza batterica, fungina o delle piante fornendo. Chemiotipo a genotipo e genotipo a chemiotipo bioinformatica collegamenti tra cluster biosintetici e sono piccoli prodotti di molecole.L'udito del protocollo è dimostrato per caratterizzare le profondità del ciclo ombelico Prodotti peptidici osservati in estratti metabolici di specie di streptomizi. Ma è applicabile anche alla sequenza e agli estratti fungini e vegetali. È molto importante avere un set di dati del genoma ben curato e al giorno d'oggi sequenze di bozze frammentate sono sempre più soppiantate da dati di sequenza quasi finiti.Inoltre, sono state sviluppate diverse strategie per accedere a nuovi prodotti naturali bioattivi e certamente combinarli con l'approccio MS-Guide. Condurremo a un miglioramento dell'isolamento e della spiegazione della struttura dei prodotti naturali. Come qui stiamo collegando il genotipo all'approccio chemiotipo, i collegamenti bioinformatici tra cluster biosintetici e ci sono piccoli prodotti molecolari sono cruciali.per stimare la varietà e la classe dei composti e codificare per genoma. Il che significa la replicazione. Successivamente, il raggruppamento basato sulle somiglianze ioniche può essere preformato utilizzando il PNL.A dimostrare la procedura saranno la Dott.ssa Renata Sigrist e la Professoressa Angolini i miei collaboratori in questo studio. Ottenere in silico informazioni sulle annotazioni dei cluster genetici del metabolismo secondario da un genoma di sequenza completo. Invia il file di sequenza, la banca genica E-M-B-L o un formato più veloce, a una piattaforma anti-smash.Quindi, come i cluster genetici di interesse dai dati di output basati sull'ammasso conosciuto più simile. Sulla base delle informazioni sulla sequenza del DNA del BGC, progetta primarie tra 20 e 25 nucleotidi che fiancheggiano l'ammasso genico per gli streptomici di ecoli. Screening artificiale della libreria cromosomico.Dopo aver ottenuto l'organismo eterologo ricombinante secondo il manoscritto, inoculare un 100 ° dei ceppi precultura in adeguati mezzi di fermentazione. Come i supporti ISP2 liquidi. Posizionare la coltura su un incubatore a 30 gradi Celsius e 220 rpm, per sette giorni.Dopo l'inoculazione, centrifugare le colture a 2200 volte G per 10 minuti. Scartare le cellule e trasferire il supernatante in un imbuto separatore. Aggiungere uno a un volume di acetato di etile e agitare.Attendere da uno a tre minuti affinché gli strati organici e acconsentito si separino. E raccogliere lo strato organico in un pallone Erlenmeyer. Per acquisire dati MS/MS.Programmare metodi HPLC e spettrometria di massa adatti utilizzando il software di controllo. Si noterà che la rete MS/MS è la rete molecolare rilevabile nelle condizioni spettrometriche di massa date. Convertire gli spettri di massa in formato mzXML utilizzando la procedura guidata MS Convert from protea.Regolare i parametri di input per la conversione. Caricare i file LC-MS/MS convertiti nel database GNPS. Sono disponibili due opzioni.Utilizzando un protocollo di trasferimento file o direttamente in un browser attraverso la piattaforma online. Dopo aver creato un conto in PNL, accedere al conto creato e selezionare crea una rete molecolare. Aggiungere un titolo di lavoro.Per eseguire le opzioni di base. Selezionare i file mzXML per eseguire la rete molecolare. Organizzarli in un massimo di sei gruppi.Quindi, come le librerie per la routine di dereplicazione. Selezionate la tolleranza di massa ionia precursore e il frammento Da sulla tolleranza di massa rispettivamente di 0,02 Dalton e 0,05 Dalton. Per eseguire opzioni di rete avanzate, selezionare i parametri che hanno influenzato direttamente le dimensioni e il modulo del cluster di rete.I parametri avanzati sono nella documentazione del PNL. Scegliere un indirizzo di posta elettronica per ricevere un avviso al termine del lavoro e inviare il processo. Analizzare i risultati del PNL.Accedere al PNL. Selezionare i processi, il processo pubblicato, fatto per aprire un processo. Si apre una pagina web con tutti i risultati ottenuti dalla rete molecolare visualizzata.Selezionare Visualizza famiglie spettrali nel visualizzatore di rete del browser per visualizzare tutti i cluster di rete. Viene visualizzato un elenco con tutti i cluster di rete molecolari generati. L'identificazione molecolare provvisoria viene visualizzata in tutti gli ID.Selezionare Mostra per visualizzarli. Per analizzare il cluster di rete molecolare, selezionare visualizza rete. Nella casella etichette nodo selezionare massa padre.Nella casella etichette bordo selezionare co-firma o Delta Emz. Per osservare rispettivamente la somiglianza dei nodi o la differenza di massa tra i nodi. Nel caso dell'analisi multigruppo, fare clic su disegna torte nella casella di colorazione dei nodi.Per osservare la frequenza con cui ogni nodo appare in ogni gruppo. Per visualizzare tutte le raccolte, selezionare visualizza, tutta la raccolta, i riscontri. Aprire gli spettri di frammentazione direttamente nella piattaforma PNL.O in file grezzi originali per confermare manualmente i composti di dereplicazione e la spiegazione della struttura dei composti correlati. Il protocollo è stato esemplificato con successo utilizzando una combinazione di estrazione del genoma, espressione eterologo e approcci di codice guidati dalla SM. Per accedere a nuove molecole specializzate di Valinomicina e analogiche.Il flusso di lavoro genoma-molecola per la valinomicina bersaglio è presentato qui. Il cromatogramma ha mostrato che la valinomicina, la montanastatina e cinque analoghi sono stati prodotti dalla valinomicina, espressione degli ammassi genico biosintetici in un ospite eterologo. Ioni di rete molecolare corrispondenti alla valinomicina, un composto già noto con i corrispondenti ammassi genici biosintetici annotati nelle specie di streptomici, CBM AI due zero quattro due genoma.Sono raggruppati con ioni correlati agli analoghi, descritti in primo luogo per l'ammasso genico biosintetico della valinomicina. Gli spettri MS e le strutture chimiche per la valinomicina e gli analoghi correlati, sono mostrati qui. Eseguire il sequenziamento dell'intero genoma e una corretta cura del set di dati è il primo passo per eleggere un cluster biosintetico per ms-guide l'estrazione del genoma.L'intera procedura può essere eseguita con l'estratto grezzo di stringhe di tipi selvatici, ma puoi scegliere di selezionare il cluster genico di tuo interesse e promuovere l'espressione eterologo. Diversi metodi sono descritti per catturare l'intero ammasso genico biosintetico da un campione di DNA. Il più forte vantaggio di questo protocollo è la sua capacità di replicare rapidamente i profili metabolici e allevare informazioni genomiche con i dati MS.Al fine di chiarire questi come di nuove molecole. E l'estrazione della guida di massa-genoma è stata descritta per la prima volta nel campo della genomica peptidica e della glicogenomica da Doris Chime e colleghi. E dopo l'introduzione della metabolomica integrata NPS e dell'approccio di estrazione del genoma sono diventati la strada più versatile per collegare le reti molecolari con le capacità biosintetiche.

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