Name: mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products
Uploaded: 2020-03-12T13:00:00
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El apoyo financiero para este estudio fue proporcionado por la Fundación de Investigación de Sao Paulo - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 y 2014/50249-8 a L.G.O; 2013/12598-8 y 2015/01013-4 a R.S.; y 2019/08853-9 a C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A. y L.G.O. recibieron becas del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 y 313492/2017-4). L.G.O. también agradece el apoyo de la subvención proporcionado por el programa Para mujeres en la ciencia (2008, Edición Brasileña). Todos los autores reconocen capeS (Coordinación para la mejora del personal de educación superior) por apoyar los programas de post-graduación en Brasil.

1. Minería del genoma para grupos genéticos biosintéticos
<ol><li>Realizar la secuenciación del genoma completo (WGS) como el primer paso para elegir un cúmulo de genes biosintéticos (BCG) para la minería del genoma guiado por EM. Todo el borrador del genoma de la cepa de interés (bacterias) se puede obtener mediante la tecnología Illumina MiSeq utilizando lo siguiente con ADN genómico de alta calidad: escopeta TruSeq PCR-Free library prep y Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33....

La mayor ventaja de este protocolo es su capacidad para desreplicar rápidamente los perfiles metabólicos y salvar la información genómica con datos de MS con el fin de dilucidar las estructuras de las nuevas moléculas, especialmente los análogos estructurales2. Sobre la base de información genómica, se pueden investigar diferentes productos naturales quimiotipos, tales como poliketidas (PK), péptidos nonribosomales (NRP) y productos naturales glucosilados (GNP), así como BGCcrígos críp...

Las investigaciones del metabolismo secundario a menudo consisten en el cribado de extractos crudos para actividades biológicas específicas seguidos de purificación, identificación y caracterización de los componentes pertenecientes a fracciones activas. Este proceso ha demostrado ser eficiente, promoviendo el aislamiento de varias entidades químicas. Sin embargo, hoy en día esto es visto como inviable, principalmente debido a las altas tasas de redescubrimiento. A medida que la industria farmacéutica revolucionó sin conocer las funciones y funciones de los metabolitos especializados, su identificación se llevó a cabo en condiciones de laboratorio que no representaban con precisión la naturaleza1. Hoy en día, hay una mejor comprensión de las influencias de señalización natural, secreción, y la presencia de la mayoría de los objetivos en concentraciones indetectablemente bajas. Además, la regulación del proceso ayudará a la comunidad académica y a la industria farmacéutica a aprovechar este conocimiento. También beneficiará la investigación que implica el aislamiento directo de metabolitos relacionados con los grupos de genes biosintéticos silenciosos (BGC)2.
En este contexto, los avances en la secuenciación genómica han renovado el interés por el cribado de metabolitos de microorganismos. Esto se debe a que el análisis de la información genómica de los cúmulos biosintéticos descubiertos puede revelar genes que codifican nuevos compuestos no observados o producidos en condiciones de laboratorio. Muchos proyectos o borradores de genoma completo microbiano están disponibles hoy en día, y el número está creciendo cada año, proporcionando perspectivas masivas para descubrir nuevas moléculas bioactivas a través de la minería del genoma3,4.
El Atlas of Biosynthetic Gene Clusters es la mayor colección actual de cúmulos de genes extraídos automáticamente como componente de la Plataforma Integrada de Genomas Microbianos del Instituto Conjunto del Genoma (JGI IMG-ABC)2. Más recientemente, la Iniciativa de Normalización de la Información Mínima para Clústeres de Gen Biosintéticos (MIBiG) ha promovido la reanotación manual de los BGC, proporcionando un conjunto de datos de referencia altamente seleccionado5. Hoy en día, hay muchas herramientas disponibles para permitir la minería computacional de datos genéticos y su conexión con metabolitos secundarios conocidos. También se han desarrollado diferentes estrategias para acceder a nuevos productos naturales bioactivos (es decir, expresión heteróloga, eliminación de genes diana, reconstitución in vitro, secuencia genómica, cribado guiado por isótopos [enfoque genomisotópico], manipulación de reguladores locales y globales, minería basada en objetivos de resistencia, minería independiente del cultivo y, más recientemente, enfoques guiados por MS/código2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).
La minería del genoma como estrategia singular requiere esfuerzos para anotar un grupo único o pequeño de moléculas; por lo tanto, siguen existiendo lagunas en el proceso en el que se priorizan nuevos compuestos para el aislamiento y el esclarecimiento de la estructura. En principio, estos enfoques se dirigen a una sola vía biosintética por experimento, lo que resulta en una tasa de descubrimiento lenta. En este sentido, el uso de GM junto con un enfoque de redes moleculares representa un avance importante para la investigación de productos naturales14,,15.
La versatilidad, precisión y alta sensibilidad de la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) lo convierten en un buen método para la identificación de compuestos. Actualmente, varias plataformas han invertido algoritmos y conjuntos de software para metabolómicas no dirigidas16,,17,18,19,20. El núcleo de estos programas incluye la detección de características (selección de picos)21 y la alineación de picos, lo que permite la coincidencia de entidades idénticas en un lote de muestras y la búsqueda de patrones. Los algoritmos basados en patrones de MS22,23 comparan patrones de fragmentación característicos y coinciden con las similitudes de MS2 que generan familias moleculares que comparten características estructurales. Estas características pueden ser resaltadas y agrupadas, confiriendo la capacidad de descubrir rápidamente moléculas conocidas y desconocidas de un extracto biológico complejo por tándem MS2,24,25. Por lo tanto, la MUS en tándem es un método versátil para obtener información estructural de varios quimiotipos contenidos en una gran cantidad de datos simultáneamente.
El algoritmo Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 utiliza la intensidad de los iones de fragmentos normalizados para construir vectores multidimensionales, en los que las similitudes se comparan utilizando una función de coseno. La relación entre los diferentes iones primarios se traza en una representación de diagrama, en la que cada fragmentación se visualiza como un nodo (círculos) y la relación de cada nodo se define mediante una arista (líneas). La visualización global de moléculas de una sola fuente se define como una red molecular. Las moléculas estructuralmente divergentes que se fragmentan de forma única formarán su propio cúmulo o constelación específico, mientras que las moléculas relacionadas se agrupan. La agrupación de quimiotipos permite la conexión hipotética de características estructurales similares a sus orígenes biosintéticos.
La combinación de enfoques quimiotipo a genotipo y genotipo a quimiotipo es poderosa cuando se crean vínculos bioinformáticos entre los BGC y sus pequeños productos de moléculas27. Por lo tanto, la minería del genoma guiada por MS es un método rápido y una estrategia de bajo consumo de materiales, y ayuda a salvar los iones padres y las vías biosintéticas reveladas por WGS de una o más cepas bajo diversas condiciones metabólicas y ambientales.
El flujo de trabajo de este protocolo(Figura 1) consiste en alimentar los datos wgS en una plataforma de anotación de clúster de genes biosintéticos como antiSMASH28,,29,30. Ayuda a estimar la variedad de compuestos y la clase de compuestos codificados por el genoma. Se debe adoptar una estrategia para atacar un grupo genético biosintético que codifica una entidad química de interés, y se pueden analizar extractos de cultivo de una cepa de tipo silvestre y/o cepa heteróloga que contenga el BGC para generar iones agrupados basados en similitudes utilizando GNPS26,,31. Por lo tanto, es posible identificar nuevas moléculas que se asocian con el BGC objetivo y no están disponibles en la base de datos (principalmente análogos desconocidos, a veces producidos en títulos bajos). Es relevante tener en cuenta que los usuarios pueden contribuir a estas plataformas y que la disponibilidad de datos bioinformáticos y MS/MS está aumentando rápidamente, impulsando a un desarrollo constante y actualización de herramientas y algoritmos computacionales eficaces para guiar conexiones eficientes de extractos complejos con moléculas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60825/60825fig1b.jpg"> Figura 1: Información general de todo el flujo de trabajo. Se muestra una ilustración de los pasos bioinformáticos, de clonación y redes moleculares implicados en el enfoque de minería del genoma guiado por la EM para identificar nuevos metabolitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60825/60825fig1blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Este protocolo describe un flujo de trabajo rápido y eficiente para combinar la minería del genoma y las redes moleculares como punto de partida para la canalización de descubrimiento de productos naturales. Aunque muchas aplicaciones son capaces de visualizar la composición y relación de moléculas detectables por MS en una red, aquí se adoptan varias para visualizar moléculas agrupadas estructuralmente similares. Usando esta estrategia, nuevos productos de ciclodepsipéptidos observados en extractos metabólicos de Streptomyces sp. CBMAI 2042 se identifican con éxito. Guiado por la minería del genoma, todo el cúmulo de genes biosintéticos que codifican valinomicinas es reconocido y clonado en la cepa productora Streptomyces coelicolor M1146. Por último, tras una red molecular basada en patrones de EP, las moléculas detectadas por la EM están correlacionadas con los BGC responsables de su biogénesis32.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Tedia</td>
			<td>AA1120-048</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0011</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apramycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2024</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9231</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3175</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column C18</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>ZORBAX RRHD Extend-C18, 80&#197;, 2.1 x 50 mm, 1.8 &#181;m, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manitol P.A.- A.C.S.</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>5418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalidixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4382</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F548S</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF mass spectrometer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>6550 iFunnel Q-TOF LC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose P.A.- A.C.S.</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker/Incubator</td>
			<td>Marconi</td>
			<td>MA420</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>P. A. - ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy extract</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Synth</td>
			<td>NA</td>
			<td>P. A. - ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycles</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>NA</td>
			<td>Mastercycler Nexus Gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8902</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone Soy Broth</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>1290 Infinity LC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry-guided genome mining as a tool to uncover novel natural products

El espacio químico cubierto por productos naturales es inmenso y ampliamente no reconocido. Por lo tanto, se desean metodologías convenientes para realizar una evaluación amplia de sus funciones en la naturaleza y beneficios humanos potenciales (por ejemplo, para aplicaciones de descubrimiento de fármacos). Este protocolo describe la combinación de la minería del genoma (GM) y la red molecular (MN), dos enfoques contemporáneos que coinciden con las anotaciones codificadas por grupos genéticos en la secuenciación del genoma completo con las firmas de la estructura química de extractos metabólicos crudos. Este es el primer paso hacia el descubrimiento de nuevas entidades naturales. Estos conceptos, cuando se aplican juntos, se definen aquí como minería del genoma guiada por MS. En este método, los componentes principales se designan previamente (utilizando MN), y los nuevos candidatos relacionados estructuralmente se asocian con anotaciones de secuencia del genoma (mediante GM). La combinación de GM y MN es una estrategia rentable para apuntar a nuevas redes troncales de moléculas o cosechar perfiles metabólicos con el fin de identificar análogos de compuestos ya conocidos.

El protocolo se ejemplificó con éxito utilizando una combinación de minería del genoma, expresión hetróloga y enfoques guiados por MS/código para acceder a nuevas moléculas análogas especializadas en valinomicina. El flujo de trabajo genoma-molécula para el objetivo, valinomicina (VLM), se representa en la Figura 8. El genoma del borrador CBMAI 2042 se analizó en silico, y el grupo genético VLM fue identificado y transferido a un huésped hetrólogo. Las cepas de tipo he...

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Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

Aquí se establece y se describe un protocolo de minería del genoma guiado por espectrometría de masas. Se basa en la información de la secuencia del genoma y el análisis LC-MS/MS y tiene como objetivo facilitar la identificación de moléculas a partir de extractos microbianos y vegetales complejos.

La minería del genoma guiada por espectrometría de masas como herramienta para descubrir nuevos productos naturales

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

La secuenciación del genoma completo, la minería del genoma y las redes moleculares constituyen la base de la guía de espectrometría de masas que el protocolo de minería del genoma que describimos aquí. Y son el enfoque más contemporáneo en el descubrimiento de productos naturales. La minería del genoma y las redes moleculares coinciden en racimos, en anotaciones codificadas en secuenciación del genoma completo con firmas de reestructuración química de extractos crudos que proporcionan perspectivas masivas para descubrir el ombligo por moléculas activas.En principio, la minería del genoma se dirige a un solo grupo o un pequeño grupo de moléculas por experimento. De este modo, se produce una tasa de detección lenta. En este sentido, el uso de la minería del genoma junto con las redes moleculares representa un avance importante para la investigación de productos naturales.La minería de la guía-genoma de espectrometría de masas es un método versátil que puede estructurar simultáneamente la información de varios quimiotipos contenidos en la gran cantidad de datos de un extracto crudo. Hoy en día es una metodología de gama alta capaz de explorar la secuencia bacteriana, fúngica o de plantas. El quimiotipo al genotipo y el genotipo a los vínculos bioinformáticos quimiotipos entre los cúmulos biosintéticos y son productos de moléculas pequeñas.Escuchar el protocolo se ha demostrado para caracterizar las profundidades del ciclo del ombligo productos de péptidos observados en extractos metabólicos de especies de estreptomyces. Pero es aplicable a la secuencia de hongos y plantas y extractos, así. Es muy importante tener un conjunto de datos del genoma bien seleccionado y hoy en día las secuencias de borrador fragmentadas se han sustituido cada vez más por datos de secuencia casi terminados.Además, se han desarrollado diferentes estrategias para acceder a nuevos productos naturales bioactivos y, sin duda, combinarlos con el enfoque de MS-Guide. Llevaremos a mejorar el aislamiento de los productos naturales y el esclarecida de la estructura. Como aquí estamos conectando el genotipo con el enfoque de quimiotipo, los vínculos bioinformáticos entre los cúmulos biosintéticos y los productos de moléculas pequeñas son cruciales.para estimar la variedad y clase de compuestos y codificar por genoma. Lo que significa la replicación. Más adelante, la agrupación en clústeres basada en similitudes iónicas se puede preformar mediante GNPS.Demostrando el procedimiento estarán la Dra. Renata Sigrist y la Profesora Angolini mis colaboradores en este estudio. Para obtener en silicio información sobre los grupos genéticos del metabolismo secundario, las anotaciones de un genoma de secuencia completa. Envíe el archivo de secuencia, el banco de genes E-M-B-L o formato más rápido, a una plataforma anti-smash.Al igual que los grupos genéticos de interés de los datos de salida basados en el clúster conocido más similar. Sobre la base de la información de la secuencia de ADN del BGC, diseñe primarias entre 20 y 25 nucleótidos que flanquean el grupo genético para las estreptotomías de ecoli. Examen de la biblioteca de cromosomas artificiales.Después de obtener el organismo heterólogo recombinante según el manuscrito, inocular una 100a de la precultiva de las cepas en medios de fermentación apropiados. Como medios ISP2 líquidos. Coloque el cultivo en una incubadora a 30 grados Centígrados y 220 RPM, durante siete días.Después de la inoculación, centrifugar las culturas a 2200 veces G durante 10 minutos. Deseche las celdas y transfiera el sobrenadante a un embudo separador. Agregue uno a un volumen de acetato de etilo y agite.Espere de uno a tres minutos para que las capas orgánicas yquiesciadas se separen. Y recoger la capa orgánica en un matraz Erlenmeyer. Adquirir datos de MS/MS.Programe métodos hpLC y espectrometría de masas adecuados utilizando el software de control. Cabe señalar que la red MS/MS es la red molecular detectable bajo las condiciones espectrométricas de masa dadas. Convierta espectros de masa a formato mzXML utilizando MS Convert desde el asistente protea.Ajuste los parámetros de entrada para la conversión. Cargue los archivos LC-MS/MS convertidos en la base de datos GNPS. Hay dos opciones disponibles.Usando un protocolo de transferencia de archivos o directamente en un navegador a través de la plataforma en línea. Después de crear una cuenta en GNPS, inicie sesión en la cuenta creada y seleccione crear una red molecular. Agregue un título de trabajo.Para realizar opciones básicas. Seleccione los archivos mzXML para realizar la red molecular. Organizarlos en hasta seis grupos.Así como las bibliotecas para la rutina de desreplicación. Seleccione la tolerancia de masa de iones precursores y el fragmento Da en tolerancia de masa de 0.02 Dalton y 0.05 Dalton respectivamente. Para realizar opciones de red avanzadas, seleccione los parámetros que influyeron directamente en el tamaño y el formulario del clúster de red.Los parámetros avanzados están en la documentación de GNPS. Elija una dirección de correo electrónico para recibir una alerta cuando termine el trabajo y envíe el trabajo. Analizar los resultados de GNPS.Inicie sesión en GNPS. Seleccione trabajos, trabajo publicado, realizados para abrir un trabajo. Se abre una página web con todos los resultados obtenidos de la red molecular mostrada.Seleccione Ver familias espectrales en el visualizador de red del navegador para ver todos los clústeres de red. Se muestra una lista con todos los clústeres de redes moleculares generados. La identificación molecular provisional se muestra en todos los documentos de identidad.Seleccione Mostrar para visualizarlos. Para analizar el clúster de red molecular, seleccione visualizar red. En el cuadro Etiquetas de nodo, seleccione masa primaria.En el cuadro Etiquetas de borde, seleccione co-firma o Delta Emz. Para observar la similitud de nodo o la diferencia de masa entre nodos respectivamente. En el caso del análisis multigrupo, haga clic en dibujar pasteles en el cuadro de color del nodo.Para observar la frecuencia con la que aparece cada nodo en cada grupo. Para ver todas las bibliotecas, seleccione view, all library, hits. Abra los espectros de fragmentación directamente en la plataforma GNPS.O en archivos originales crudos para confirmar manualmente compuestos de desreplicación y elucidación de la estructura de compuestos relacionados. El protocolo se ejemplificó con éxito mediante una combinación de minería del genoma, expresión heteróloga y enfoques de código guiado por MS. Para acceder a nuevas moléculas especializadas de Valinomicina y análoga.Aquí se presenta el flujo de trabajo del genoma a la molécula para la valinomicina objetivo. El cromatograma mostró que la valinomicina, la montanastatina y cinco análogos fueron producidos por valinomicina, expresión de grupos genéticos biosintéticos en un huésped heterólogo. Los iones de red molecular correspondientes a la valinomicina, un compuesto ya conocido con los correspondientes grupos genéticos biosintéticos anotados en especies de estreptomicos, CBM AI dos cero cuatro dos genoma.Se agrupan con iones relacionados con análogos, descritos en primer lugar para el grupo genético biosintético de valinomicina. Aquí se muestran los espectros de LA MS y las estructuras químicas para la valinomicina y los análogos relacionados. Realizar la secuenciación completa del genoma y la curación adecuada del conjunto de datos es el primer paso para elegir un clúster biosintético para la minería del genoma.Todo el procedimiento se puede realizar con los tipos de comodín de extracto crudo de cadena, pero puede optar por seleccionar el grupo genético de su interés y promover la expresión heteróloga. Se describen diferentes métodos para capturar todo el grupo genético biosintético de una muestra de ADN. La ventaja más fuerte de este protocolo es su capacidad para replicar rápidamente perfiles metabólicos y reproducir información genómica con datos de EME.Con el fin de dilucidar estos como de nuevas moléculas. Y la minería de la guía-genoma de masas fue descrita en primer lugar en el campo de la genómica de péptidos y la glucogenómica por Doris Chime y sus colegas. Y después de la introducción del enfoque de metabolómica integrada NPS y minería del genoma se han convertido en la vía más versátil para conectar las redes moleculares con capacidades biosintéticas.

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