Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
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这项工作得到了中央公益性研究机构ZXKT17002基础研究基金的支持。

本研究中使用的结核病被命名为BT18，它起源于山西省农科院小杂粮研究中心培育的"金乔二号"品种。该协议的主要步骤如图1所示。
注：快速操作与植物相关的操作，并尽可能关闭培养皿，以避免枯萎和污染。除非另有说明，所有外植株孵育是在14小时光和10小时暗光期25°C下进行的。除非另有说明，否则所有与植物或细菌有关的操作都是在层压流量罩无?...

结核病已用于与遗传和代谢5,水平1，2，5，27，282,的继发代谢物有关的几项研究。,27128毛茸茸的根培养作为代谢物产生的独特来源，在代谢工程29中起着关键作用，并可用于通过插入相关基因来改变代谢途径。Kim等人2最初介绍建立结核毛根...

塔特里麦 （TB） （法戈皮鲁姆塔塔里库姆（L.） 盖尔滕） 是属于法戈皮鲁姆属和家族 Polygonaceae1的二恶二甲。结核病作为一种中药同源性食品，由于其独特的化学成分和多种生物活动，对疾病产生了浓厚的兴趣。结核病主要富含碳水化合物、蛋白质、维生素和类胡萝卜素，以及多酚，如酚酸和黄酮类化合物1。黄酮类化合物的各种生物和药理活性，包括抗氧化、抗高血压2、抗炎以及抗癌和抗糖尿病特性，已被证明有3种。
植物杆菌是一种土壤细菌，通过感染伤口部位44、5，5有助于几种高等植物，特别是二叶草病的发展。这个过程是由诱导（Ri）质粒55、66中的T-DNA转移开始的，通常伴随着来自Ri质粒的外源基因的整合和表达以及产生毛根表型7的后续步骤。A. 根茎 -介导的转基因毛根，作为植物生物技术领域的一种强大工具，由于其稳定和高生产率和容易在短时间内获得，得到了最广泛的应用。此外，由A.根茎诱导的毛根有效地区分其拉皮性根发育和高分枝生长在无激素介质8。它们可用于多个研究领域，包括人工种子生产、根结核研究，以及研究与其他生物（如霉菌、线虫和根病原体77、9）9的相互作用。此外，毛茸茸根转化培养物已被广泛用作研究生化途径和化学信号的实验系统，并生产用作药品、化妆品和食品添加剂的植物二次代谢物8,8，10。在野生型毛茸茸的根部合成的有价值的二次代谢物，包括多叶生物碱、异丙酮、龙烷生物碱、二烯醇和黄酮类化合物，在众多物种中已经研究了几十年，如Panax人参11中的人参、阿美马伊1212中的科马林和TB2中的酚类化合物。
毛根已经产生使用A.根基因在79种植物从27个家族14。例如，在大豆15，16，16萨尔维亚17，普伦巴戈印度18，莲花雅波尼库斯19，和菊花（Cichorium intybus L.）中报道了A.rhizo基因介导的毛根转化。1520.结核病毛根转化也已调查2.关于由A.根基因介导的毛状根的开发，很少详细的协议，要么携带二进制向量。例如，Sandra等人21日介绍了一种在野生型芽中维持的转基因马铃薯毛根生产方法。完全发育的毛根可以在将A.rhizo基因注射到马铃薯植物的茎间5-6周后可视化。另一项研究也报道了由A.根茎诱导的转基因毛根系统，该基因含有黄麻中的gusA报告基因（科丘齐斯帽状体L.）。22.此外，Supaart等人23利用表达载体pBI121转化的转基因烟草毛根获得，该基因携带β1-四氢大麻素酸（THCA）合成酶的基因，以产生THCA。
然而，有效生成毛茸茸的根部转化的分步过程，特别是在结核病中，其表现相对较少。在这项研究中，我们描述了一个详细的协议，使用携带报告基因（GFP），选择性标记（Kan）和感兴趣的基因（b4，从我们组识别，但未发表的基因从基本螺旋环螺旋（bHLH）家族）产生毛茸茸的根基因转化在结核病。实验持续了5-6周，从种子的接种到毛茸茸的根的生成，涉及外植制剂、感染、凝育、亚培养和随后的传播。此外，A. 根茎基因包含携带骨髓性细胞变核转录因子116（FtMYB116）的二FtMYB116元质粒，用于确定FtMYB116能否促进在结核病基因和代谢水平上通过TB毛根转化积累类黄酮，尤其是鲁氏素。FtMYB116是一种光诱导转录因子，调节不同光照条件下鲁因的合成。黄酮合成酶（CHS），黄酮-3-羟基酶 （F3H），黄酮-3'-羟基酶 （F3'H）和黄酮醇合成酶 （FLS）24是参与鲁金生物合成代谢途径的关键酶.因此，本研究证明了FtMYB116在TB毛根的过度表达，关键酶基因的表达，以及鲁汀和其他黄酮类化合物（如奎西汀）的含量。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

塔塔麦 （TB） -Fagopyrum 榻地（L.） Gaertn] 拥有各种生物和药理活性，因为它含有丰富的二次代谢物，如黄酮类化合物，特别是鲁氏素。全球逐渐利用植物原体诱导药用植物中的毛根，以研究基因功能，提高继发代谢物的产量。在这项研究中，我们描述了一种在结核病中产生由根介导的毛根的详细方法。在7-10天时选择科蒂莱顿和低血节轴作为外植体，并感染携带二进制载体的A.根茎，这诱发了1周后出现的令人毛骨悚然的毛根。根据形态、抗性选择（卡那霉素）和记者基因表达（绿色荧光蛋白）确定产生的毛根转化。随后，转换后的毛根根据需要自我传播。同时，骨髓性细胞病（MYB）转录因子FtMYB116，利用A.根细胞介导的毛根转化为结核病基因组，以验证FtMYB116在合成黄酮类化合物中的作用。结果表明，FtMYB116显著推广了黄酮类相关基因的表达和黄酮类化合物（鲁汀和奎西汀）的产生率（p < 0.01），表明A.rhizo基因介导的毛根可以作为研究基因功能和次生代谢物产生的有效替代工具。本研究中描述的生成毛根的详细分步协议可在调整后用于任何基因转化或其他药用植物。

农业细菌根- 介导的结核毛根转化 这项研究描述了为利用A.根茎获得基因转化的毛根而建立的分步协议。从结核病种子的接种到已鉴定的毛根的收获，大约需要5-6周的时间，图1（A-H）描述了一些关键步骤。A-H简单地说，消毒的壳种子接种（图1B），以实现更快的无菌发芽。A. 根茎（<strong class=...

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Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

我们描述了一种通过农业细菌根诱导毛茸茸的根的方法 - 在塔特里麦（法戈皮鲁姆塔塔里库姆）中介导的转化。这可用于研究塔塔麦中继发代谢物的基因功能和产生，用于任何基因转化，或用于改良后的其他药用植物。

诱导毛茸茸的根由农业细菌根- 在塔特里巴克麦的中介转化 （法戈皮鲁姆塔塔里库姆）

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

使用此协议，我们将演示首次诱导毛根在酸麦中的过程。这种技术对于开始基因组学和微生物学的酸麦和其他植物来说是一种简单而廉价的技术。虽然这种详细的方法为酸麦设置了，但它可以应用于其他二科植物，并作一些修改。虽然此方法易于执行，但它有许多详细的步骤。视觉演示可以帮助研究人员实现更高效的毛根诱导。演示程序将是钱光涛，一个硕士学生从我实验室。首先选择丰满和未损坏的酸麦种子，并在28摄氏度的水中浸泡种子约20分钟。当种子涂层易于去除时，将100至200颗去皮种子放入含有75%乙醇的100毫升锥形烧瓶中，30秒。在灭菌结束时，用5%次氯酸钠代替乙醇。15分钟后，将次氯酸钠除掉，用无菌去离子水洗涤种子五次。然后用一块无菌的胆小纸把种子擦干。要获得酸麦苗，每瓶加入10个种子到单个300毫升植物组织培养瓶中，含有50毫升的MSSA培养剂。然后，在25度，正负1摄氏度的光条件下，在文化室发芽的种子。7到10天后，选择有两块展开的幼苗，从根部切出幼苗。将幼苗放入无菌培养皿中，将低小血度切成0.8至1厘米的段。将科蒂龙切成约0.5厘米的碎片，并在光条件下将产生的外植培养成24小时。第二天，将外植转移到消毒的100毫升圆锥烧瓶中。要激活 A.rhizogenes，先在冰上解冻培养，然后用抗生素将细菌均匀地电镀到 YEB 固体介质上，在 28 摄氏度下孵育 12 至 16 小时。第二天早上，在一个新的培养皿中挑选一个单克隆殖民地进行养殖，正如刚刚证明的。再孵育12至16小时后，在含有20毫升YEB固体介质的灭菌100毫升圆锥形烧瓶中接种由此产生的单克隆菌群，并用抗生素在28摄氏度和每分钟200转16至18小时，直到600的光学密度达到2.0。然后将2-4%的细菌细胞培养转移到一个新的100毫升锥形烧瓶中，含有20毫升的新鲜YEB固体介质，用抗生素在28摄氏度和200转每分钟4至5小时，直到600纳米的光学密度达到约0.5。为了诱导毛根转化，将 A.rhizogenes 培养基转移到无菌的 50 毫升锥形管中，通过离心收集细菌。将MSSAS介质中的颗粒重新悬浮到大约0.2的光学密度，并注入悬浮物到外植的烧瓶中。10分钟后，从烧瓶中取出植物，用一块无菌的围兜纸进行斑点。然后将一块直径为9厘米的无菌滤纸放在一盘MSSAAS介质上，将滤纸覆盖在滤纸上，在黑暗中25摄氏度下进行为期三天的孵化。在孵育结束时，将大约20个受感染的外植移植到MSSACK介质上，并在25摄氏度的光条件下垂直孵育这些植物。经过10至14天的培养，选择毛质根，表现出白色的外观和快速生长，并切成两到三厘米的根。清楚地编号在干净的长凳上的根。将根片在含有MSSK介质的100毫升圆锥形烧瓶中亚化，其温度为25摄氏度，在黑暗中每分钟80转，直到其溅到烧瓶底部。要识别毛茸茸的根，去除任何黄褐色和受污染的毛根，并选择那些与白色的外观。如果使用记者基因，请在蓝色或浅紫色双紫光透光器下检查根部是否荧光，并选择具有强烈荧光信号的毛根。然后用吸水纸擦干根部，用标记的铝箔包裹，立即进行分析。对于长期储存，将根在液氮中冻干，并在零下80摄氏度处放置根部，直到其调查。在基因转化和培养之后，如所证明的，毛质的根部将在外植的伤口位点中表现出蓬松的白色和质的光，并形成高度分枝和互锁的基质。记者基因可用于促进在蓝色或光的双紫外线透射下分化转基因毛发根，或识别感兴趣的靶基因。在这里，显示了在塔里麦毛根的转基因线中光诱导转录因子的相对表达。值得注意的是，由于诱发转录因子过度表达，在代谢水平上也促进了鲁汀和奎塞汀的生物合成。此外，所有三条转基因线中黄酮类合成通路基因的相对基因表达明显高于对照组测量的基因，表明在酸麦外植中成功进行了毛根转化。即种子的感染、外植的挑选，以及细菌的浓度直接影响毛根诱导的成功。我们可以评估基因表达、DNA蛋白或蛋白质反应或二次代谢物的大规模生产，以研究转录调控的二次代谢物。工程细菌对人类及其环境有害。小心正确处理、操作和处置细菌。

Research

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