Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par les Fonds de recherche fondamentale pour les instituts centraux de recherche sur le bien-être public ZXKT17002.

La tuberculose utilisée dans cette étude a été nommée BT18, qui provenait de la race de "JinQiao No.2" cultivée par le Centre de recherche de petits grains divers de l’Académie Shanxi des sciences agricoles. Les principales étapes de ce protocole sont illustrées dans la figure 1.
REMARQUE : Utilisez rapidement la manipulation liée aux explantations et, si possible, gardez les plats Petri fermés pour éviter le flétrissement et la contamination. Sauf ...

La tuberculose a été utilisée dans plusieurs études liées aux métabolites secondaires aux niveaux génétique et métabolique1,2,5,27,28. La culture des racines poilues, comme source unique pour la production de métabolites, joue un rôle central dans l’ingénierie métabolique29 et peut être utilisée pour modifier les voies ...

Le sarrasin tartari (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) est un type de dicotyledon appartenant au genre Fagopyrum et à la famille Polygonaceae1. Comme un type de médecine chinoise aliments homologues, la tuberculose a reçu un intérêt considérable en raison de sa composition chimique distinctive et diverses bioactivités contre les maladies. La tuberculose est principalement riche en glucides, protéines, vitamines et caroténoïdes ainsi que dans les polyphénols tels que les acides phénoliques et les flavonoïdes1. Diverses activités biologiques et pharmacologiques de flavonoïdes, y compris antioxydatif, antihypertenseur2, et anti-inflammatoire ainsi que les propriétés anticancéreuses et antidiabétiques, ont été démontrées3.
Agrobacterium rhizogenes est une bactérie du sol qui contribue au développement de la maladie des racines poilues dans plusieurs plantes supérieures, en particulier les dicotyledons, en infectant les sites de blessures4,5. Ce processus est initié par le transfert de l’ADN T dans le plasmide5,6 et est généralement accompagné par l’intégration et l’expression d’un gène exogène du plasmide Ri et les étapes suivantes de la génération du phénotype racinepoilue 7. A. rhizogenes- racines poilues transgéniques négociées, comme un outil puissant dans le domaine de la biotechnologie végétale, ont été les plus largement utilisés en raison de leur productivité stable et élevée et l’obtention facile dans une courte période. En outre, les racines poilues induites par A. rhizogenes se distinguent efficacement par leur développement de racine plagiotropic et la croissance très ramifiée dans un milieu sans hormones8. Ils peuvent être utilisés dans plusieurs domaines de recherche, y compris la production de semences artificielles, la recherche sur les nodules racines, et dans l’étude des interactions avec d’autres organismes tels que les champignons mycorrhiziens, les nématodes et les agents pathogènes racinaires7,9. En outre, les cultures de transformation des racines poilues ont été largement utilisées comme un système expérimental pour étudier les voies biochimiques et la signalisation chimique et pour produire des métabolites secondaires végétaux qui sont utilisés comme produits pharmaceutiques, cosmétiques et additifs alimentaires8,10. Les précieux métabolites secondaires, y compris les alcaloïdes indole, les aconites, les alcaloïdes tropanes, les terpenoïdes et les flavonoïdes, synthétisés dans des racines poilues de type sauvage ont été étudiés pendant plusieurs décennies chez de nombreuses espèces, telles que le ginsenoside dans Panax ginseng11, coumarine à Ammi majus12, et les composés phénoliques TBs en2,13.
Des racines poilues ont été produites à l’aide de rhizogenes A. chez 79 espèces végétales de 27 familles14. Par exemple, A. rhizogenes-médiaté transformation des racines poilues a été signalé dans le soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, et chicorée (Cichorium intybus L.) 20. La transformation des racines poilues de la tuberculose a également fait l’objet d’une enquête2. Peu de protocoles détaillés sont disponibles concernant le développement de racines poilues médiées par A. rhizogenes portant un vecteur binaire ou non. Par exemple, Sandra et coll.21 ont introduit une méthode de production de racines poilues transgéniques de pommes de terre soutenues dans les pousses de type sauvage. Les racines poilues entièrement développées pourraient être visualisées 5-6 semaines après l’injection de A. rhizogenes portant le gène de journaliste de gus dans les internodes de tige des usines de pomme de terre. Une autre étude avait également rapporté un système transgénique racine poilue induit par A. rhizogenes hébergeant le gène gusA journaliste en jute (Corchorus capsularis L.) 22. En outre, Supaart et coll.23 ont obtenu des racines poilues transgéniques de tabac utilisant1 A. rhizogenes transformés avec le vecteur d’expression pBI121 portant le gène de la synthase d’acide tétrahydrocannabinolic (THCA) pour produire THCA.
Cependant, un processus étape par étape pour une génération efficace de transformation des racines poilues, en particulier dans la tuberculose, a été relativement moins démontré. Dans cette étude, nous avons décrit un protocole détaillé utilisant A. rhizogenes portant le gène reporter (GFP), un marqueur sélectif (Kan), et un gène d’intérêt (b4, un gène identifié de notre groupe mais un gène non publié de base helix-boucle-helix (bHLH) famille) pour générer la transformation génétique de racine poilue dans la tuberculose. L’expérience a duré 5-6 semaines, de l’inoculation des graines à la génération de racines poilues, impliquant la préparation expling, l’infection, la coculturation, la sous-culture, et la propagation subséquente. En outre, A. rhizogenes contenant un plasmide binaire portant le transgénique de la tuberculose du facteur de transcription de myéloblastose 116 (FtMYB116) a été employé pour déterminer si FtMYB116 peut favoriser l’accumulation de flavonoïdes, particulièrement la rutine, dans la tuberculose au niveau génétique et métabolique par la transformation de racine poilue de la tuberculose. FtMYB116, qui est un facteur transcriptionnel induit par la lumière, régule la synthèse de la rutine dans différentes conditions de lumière5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoid-3'-hydroxylase (F3'H), et flavonol synthase (FLS)24 sont des enzymes clés impliquées dans la voie métabolique de la biosynthèse de rutine. Par conséquent, cette étude démontre la surexpression de FtMYB116 dans les racines poilues de la tuberculose et l’expression de gènes enzymatiques clés ainsi que le contenu de la rutine et d’autres flavonoïdes tels que la quercétine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

Le sarrasin tartari (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possède diverses activités biologiques et pharmacologiques parce qu’il contient d’abondantes métabolites secondaires comme les flavonoïdes, en particulier la rutine. Les rhizogenes agrobacterium ont été progressivement utilisés dans le monde entier pour induire des racines poilues dans les plantes médicinales afin d’étudier les fonctions génétiques et d’augmenter le rendement des métabolites secondaires. Dans cette étude, nous avons décrit une méthode détaillée pour générer des racines poilues A. rhizogenes-négociéesdans la tuberculose. Les cotyledons et l’axe hypocotyledonaire à 7-10 jours ont été sélectionnés comme explants et infectés par A. rhizogenes portant un vecteur binaire, qui a induit des racines poilues aventieuses qui sont apparues après 1 semaine. La transformation de racine poilue générée a été identifiée basée sur la morphologie, la sélection de résistance (kanamycine), et l’expression de gène de reporter (protéine fluorescente verte). Par la suite, les racines poilues transformées ont été auto-propagées au besoin. Pendant ce temps, un facteur de transcription de myéloblastose (MYB), FtMYB116, a été transformé en génome de la tuberculose à l’aide des racines poilues A. rhizogenespour vérifier le rôle de FtMYB116 dans la synthèse des flavonoïdes. Les résultats ont montré que l’expression des gènes liés aux flavonoïdes et le rendement des composés flavonoïdes (rutin et quercetine) étaient significativement (p-lt; 0,01) promues par FtMYB116, ce qui indique que les racines poilues À médiation de A. rhizogenespeuvent être utilisées comme un outil alternatif efficace pour étudier les fonctions génétiques et la production de métabolites secondaires. Le protocole détaillé étape par étape décrit dans cette étude pour générer des racines poilues peut être adopté pour toute transformation génétique ou d’autres plantes médicinales après ajustement.

Agrobacterium rhizogenes- transformation des racines poilues de la tuberculose médiée Cette étude décrit le protocole étape par étape qui a été établi pour obtenir des racines poilues génétiquement transformées à l’aide de A. rhizogenes. Il a fallu environ 5-6 semaines de l’inoculation des graines tuberculeuses à la récolte des racines poilues identifiées, et certaines étapes clés sont représentées dans la figure 1 (A-H</s...

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Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Nous décrivons une méthode d’induire des racines poilues par Agrobacterium rhizogenes-transformation négociée dans le sarrasin tartarinaire (Fagopyrum tataricum). Ceci peut être employé pour étudier des fonctions de gène et la production des métabolites secondaires dans le sarrasin de tartari, être adopté pour n’importe quelle transformation génétique, ou employé pour d’autres usines médicinales après amélioration.

Induire Hairy Roots par Agrobacterium rhizogenes-Transformation médiatisée dans le sarrasin tartarié (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

En utilisant ce protocole, nous démontrerons le processus étape par étape pour induire des racines poilues dans le sarrasin tartary pour la première fois. Cette technique est facile et peu coûteuse pour commencer à génomique et microbiomics pour le sarrasin tartary et d’autres plantes. Bien que cette méthode détaillée soit mise en place pour le sarrasin tartary, elle peut être appliquée à d’autres plantes de dicot avec quelques modifications.Bien que cette méthode soit facile à exécuter, elle a de nombreuses étapes détaillées. La démonstration visuelle peut aider les chercheurs à obtenir une induction plus efficace des racines poilues. Guangtao Qian, étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, démontrera la procédure.Commencez par choisir des graines de sarrasin tartary dodues et intactes et trempez les graines dans de l’eau de 28 degrés Celsius pendant environ 20 minutes. Lorsque la couche de graines peut être facilement enlevée, placer 100 à 200 graines pelées dans un flacon conique stérilisé de 100 millilitres contenant 75 % d’éthanol pendant 30 secondes. À la fin de la stérilisation, remplacer l’éthanol par de l’hypochlorite à 5 % de sodium.Après 15 minutes, décanter l’hypochlorite de sodium et laver les graines avec de l’eau déionisée stérile cinq fois. Puis éponger les graines à sec avec un morceau de papier bibuleux stérile. Pour obtenir des semis tartary de sarrasin, ajouter 10 graines par bouteille aux bouteilles individuelles de culture de tissu végétal de 300 millilitres contenant 50 millilitres de milieu MSSA.Ensuite, faire germer les graines dans une salle de culture à 25, plus ou moins 1, degrés Celsius dans des conditions de lumière. Après 7 à 10 jours, choisissez des semis robustes avec deux morceaux de cotylédons dépliés et coupez les semis des racines. Placer les semis dans une boîte de Pétri stérile et couper les hypocotyls en segments de 0,8 à 1 centimètre.Sheer les cotyléons en morceaux d’environ 0,5 centimètre et la pré-culture des explantations résultantes dans des conditions légères pendant 24 heures. Le lendemain, transférez les explants dans un flacon conique stérilisé de 100 millilitres. Pour activer A.rhizogenes, décongelez la culture sur la glace avant de placage uniformément les bactéries sur le milieu solide YEB avec des antibiotiques pour une incubation de 12 à 16 heures à 28 degrés Celsius.Le lendemain matin, choisissez une colonie monoclonale pour la culture dans une nouvelle boîte de Pétri comme nous venons de le démontrer. Après une autre incubation de 12 à 16 heures, inoculer les colonies monoclonales résultantes dans une fiole conique stérilisée de 100 millilitres contenant 20 millilitres de milieu solide YEB avec antibiotiques à 28 degrés Celsius et 200 révolutions par minute pendant 16 à 18 heures jusqu’à ce que la densité optique à 600 atteint 2,0. Ensuite, transférez 2-4% de la culture cellulaire bactérienne dans un nouveau flacon conique de 100 millilitres contenant 20 millilitres de milieu solide YEB frais avec des antibiotiques à 28 degrés Celsius et 200 révolutions par minute pendant 4 à 5 heures jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne environ 0,5.Pour induire la transformation des racines poilues, transférez la culture A.rhizogenes dans un tube conique stérile de 50 millilitres et recueillez les bactéries par centrifugation. Resuspendez la pastille dans le milieu MSSAS à une densité optique d’environ 0,2 et infusez la suspension dans le flacon d’explants. Après 10 minutes, retirer les explants du flacon et les éponger avec un morceau de papier bibuleux stérile.Ensuite, placez un morceau stérile de papier filtre de 9 centimètres de diamètre sur un plat de MSSAAS moyen et superposez les explants sur le papier filtre pour une incubation de trois jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, transférer environ 20 explants infectés sur mssack moyen et verticalement incuber les plantes dans des conditions légères à 25, plus ou moins 1, degrés Celsius. Après 10 à 14 jours de culture, sélectionnez les racines poilues démontrant un aspect blanc et une croissance rapide et coupez les racines en morceaux de deux à trois centimètres.Numérotez clairement les racines sur un banc propre. Sous-culture des morceaux de racine dans un flacon conique stérilisé de 100 millilitres contenant le milieu MSSK à 25 degrés Celsius et 80 révolutions par minute dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient survolés vers le fond de la fiole. Pour identifier les racines poilues, enlever les racines poilues fauve et contaminées et sélectionner celles qui ont un aspect blanc.Si un gène reporter a été utilisé, vérifiez la fluorescence des racines sous un transilluminateur bleu ou léger double ultra violet et sélectionnez les racines poilues qui présentent un signal fluorescent fort. Séchez ensuite les racines avec du papier absorbant et enveloppez-les dans du papier d’aluminium marqué pour une analyse immédiate. Pour le stockage à long terme, lyophiliser les racines dans l’azote liquide et placer les racines à moins 80 degrés Celsius jusqu’à leur enquête.Après la transformation génétique et la culture, comme démontré, les racines poilues montreront une couleur blanche pelucheuse et une manière plagiotropique dans les emplacements de blessure des explants et formeront une matrice fortement ram ramée et imbriquée. Un gène reporter peut être utilisé pour faciliter la différenciation des racines poilues transgéniques sous une double transillumination ultraviolette bleue ou légère, ou l’identification d’un gène cible d’intérêt. Ici, l’expression relative d’un facteur de transcription induit par la lumière dans les lignes transgéniques des racines poilues tartary de sarrasin est montrée.Notamment, la biosynthèse de la rutine et de la quertine est également promue au niveau métabolique en réponse à la surexpression induite du facteur de transcription. En outre, l’expression relative de gène des gènes flavenoid de voie de synthèse dans les trois lignes transgéniques, sont remarquablement plus élevées que celles mesurées dans le groupe témoin, indiquant une transformation poilue réussie de racine dans les explants tartary de sarrasin. C’est l’infection des graines, la sélection des explants, et la concentration des bactéries affectent directement le succès de l’induction poilue de racine.Nous pouvons évaluer l’expression des gènes, les protéines de l’ADN, ou les réactions protéiques protéiques ou la production de masse de métabolites secondaires pour étudier la régulation transcriptionnelle des métabolites secondaires. Les bactéries modifiées sont dangereuses pour l’homme et son environnement. Prenez soin de manipuler, d’opérer et d’éliminer les bactéries correctement.

Research

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