Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von den Grundlagenforschungsfonds der zentralen öffentlichen Wohlfahrtsforschungsinstitute ZXKT17002 unterstützt.

Die in dieser Studie verwendete TB wurde bt18 genannt, die aus der Rasse "JinQiao No.2" stammt, die vom Research Center of Small Miscellaneous Grain of Shanxi Academy of Agricultural Science angebaut wurde. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.
HINWEIS: Betreiben Sie Explanten-bezogene Manipulationen schnell, und halten Sie die Petrischalen nach Möglichkeit geschlossen, um Welken und Kontaminationen zu vermeiden. Sofern nicht ...

TB wurde in mehreren Studien im Zusammenhang mit sekundären Metaboliten auf genetischen und metabolischen Ebenen1,2,5,27,28verwendet. Haarige Wurzelkultur, als eine einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion, spielt eine zentrale Rolle in metabolischen Engineering29 und kann verwendet werden, um Stoffwechselwege durch Einfügen...

Tartary Buchweizen (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) ist eine Art von Dikotyledon aus der Gattung Fagopyrum und der Familie Polygonaceae1. Als eine Art von homologen Lebensmitteln in der chinesischen Medizin hat TB aufgrund ihrer ausgeprägten chemischen Zusammensetzung und ihrer vielfältigen Bioaktivitäten gegen Krankheiten großes Interesse erhalten. TB ist in erster Linie reich an Kohlenhydraten, Proteinen, Vitaminen und Carotinoiden sowie an Polyphenolen wie Phenolsäuren und Flavonoiden1. Verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten von Flavonoiden, einschließlich antioxidative, antihypertensive2, und entzündungshemmende sowie Anti-Krebs und antidiabetische Eigenschaften wurden gezeigt3.
Agrobacterium rhizogenes ist ein Bodenbakterium, das zur Entwicklung von haarigen Wurzelerkrankungen in mehreren höheren Pflanzen, insbesondere Dikotyledonen, beiträgt, indem es Wundstellen4,5infiziert. Dieser Prozess wird durch die Übertragung der T-DNA in das wurzelinduzierende (Ri) Plasmid5,6 eingeleitet und wird häufig von der Integration und Expression eines exogenen Gens aus dem Ri-Plasmid und den nachfolgenden Schritten zur Erzeugung des haarigen Wurzelphäpusten7begleitet. A. rhizogenes-vermittelte transgene Haarwurzeln, als ein leistungsfähiges Werkzeug auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie, wurden aufgrund ihrer stabilen und hohen Produktivität und der einfachen Beschaffung in kurzer Zeit am häufigsten eingesetzt. Darüber hinaus zeichnen sich behaarte Wurzeln, die von A. rhizogenes induziert werden, effizient durch ihre plagiotrope Wurzelentwicklung und ein stark verzweigtes Wachstum in einem hormonfreien Medium8aus. Sie können in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, einschließlich der künstlichen Samenproduktion, der Wurzelknötchenforschung und bei der Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Organismen wie Mykorrhizapilzen, Nematoden und Wurzelregern7,9. Darüber hinaus wurden haarige Wurzeltransformationskulturen ausgiebig als experimentelles System verwendet, um die biochemischen Wege und chemische Signalisierung zu untersuchen und pflanzliche sekundäre Metaboliten zu produzieren, die als Pharmazeutika, Kosmetika und Lebensmittelzusatzstoffe8,10verwendet werden. Die wertvollen sekundären Metaboliten, einschließlich Indole-Alkaloide, Aconite, Tropanalkaloide, Terpenoide und Flavonoide, synthetisiert in wildartigen haarigen Wurzeln wurden seit mehreren Jahrzehnten in zahlreichen Arten untersucht, wie Ginsenosid in Panax Ginseng11, Coumarine in Ammi majus12, und Phenolverbindungen in TB2,13.
Haarige Wurzeln wurden mit A. rhizogenes in 79 Pflanzenarten aus 27 Familien14hergestellt. Zum Beispiel, A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeltransformation wurde in Sojabohnen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, und Chicorée (Cichorium intybus L.) berichtet 20. TB haarige Wurzeltransformation wurde auch untersucht2. Es gibt nur wenige detaillierte Protokolle zur Entwicklung haariger Wurzeln, die von A. rhizogenes vermittelt werden, die entweder einen binären Vektor tragen oder nicht. Zum Beispiel führten Sandra et al.21 eine Methode zur Herstellung transgener Kartoffelhaarwurzeln ein, die in Wildtrieben getragen werden. Die voll entwickelten haarigen Wurzeln konnten 5-6 Wochen nach der Injektion von A. rhizogenes visualisiert werden, die das gus-Reporter-Gen in die Stamminternoden von Kartoffelpflanzen tragen. Eine andere Studie hatte auch berichtet, dass ein transgenes haariges Wurzelsystem, das von A. rhizogenes induziert wurde, das gusA-Reportergen in Jute(Corchorus capsularis L.) beherbergte. 22. Darüber hinaus erhielten Supaart et al.23 transgene Tabakhaarwurzeln mit A. rhizogenes, die mit dem Expressionsvektor pBI121 transformiert wurden, der das Gen von1-Tetrahydrocannabinolic acid (THCA) Synthase trug, um THCA zu produzieren.
Ein Schrittweise-Prozess für eine effektive Generierung haariger Wurzeltransformation, insbesondere bei TB, wurde jedoch relativ weniger demonstriert. In dieser Studie haben wir ein detailliertes Protokoll mit A. rhizogenes beschrieben, das das Reportergen (GFP), einen selektiven Marker (Kan) und ein Gen von Interesse (b4, ein aus unserer Gruppe identifiziertes, aber unveröffentlichtes Gen aus der grundlegenden Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie verwendet, um eine haarige Wurzelgenetische Transformation bei TB zu erzeugen. Das Experiment dauerte 5-6 Wochen, von der Inokulation von Samen bis zur Erzeugung von haarigen Wurzeln, die die Explantation, Infektion, Kokultivierung, Subkulierung und anschließende Vermehrung beinhalteten. Darüber hinaus wurde A. rhizogenes, das ein binäres Plasmid mit dem TB-Transgen des Myeloblastose-Transkriptionsfaktors 116 (FtMYB116) enthält, verwendet, um festzustellen, ob FtMYB116 die Ansammlung von Flavonoiden, insbesondere Rutin, bei TB auf Gen- und Metabolzenebene durch die haarige TB-Wurzeltransformation fördern kann. FtMYB116, ein lichtinduzierter Transkriptionsfaktor, reguliert die Synthese von Rutin unter verschiedenen Lichtbedingungen5. Chalcone-Synthase (CHS), Flavanon-3-Hydroxylase (F3H), Flavonoid-3'-Hydroxylase (F3'H), und Flavonol-Synthase (FLS)24 sind Schlüsselenzyme, die am Stoffwechselweg der Rutin-Biosynthese beteiligt sind. Daher zeigt diese Studie die Überexpression von FtMYB116 bei TB haarigen Wurzeln und die Expression von wichtigen Enzymgenen sowie den Gehalt an Rutin und anderen Flavonoiden wie Quercetin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

Tartary Buchweizen (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] besitzt verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten, weil es reichlich sekundäre Metaboliten wie Flavonoide enthält, insbesondere Rutin. Agrobacterium rhizogenes wurden nach und nach weltweit verwendet, um haarige Wurzeln in Heilpflanzen zu induzieren, um Genfunktionen zu untersuchen und die Ausbeute von sekundären Metaboliten zu erhöhen. In dieser Studie haben wir eine detaillierte Methode beschrieben, um A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln bei TB zu erzeugen. Cotyledons und hypokotyledonäre Achse bei 7-10 Tagen wurden als Explanten ausgewählt und mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, die zufällige haarige Wurzeln induzierten, die nach 1 Woche erschienen. Die erzeugte haarige Wurzeltransformation wurde anhand von Morphologie, Resistenzselektion (Kanamycin) und Reportergenexpression (grünes fluoreszierendes Protein) identifiziert. Anschließend wurden die transformierten haarigen Wurzeln nach Bedarf selbst propagiert. In der Zwischenzeit wurde ein Myeloblastose (MYB) Transkriptionsfaktor, FtMYB116, mit den A. rhizogenes-vermittelten haarigen Wurzeln in das TB-Genom umgewandelt, um die Rolle von FtMYB116 bei der Synthese von Flavonoiden zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Flavonoid-bezogenen Genen und die Ausbeute von Flavonoid-Verbindungen (Rutin und Quercetin) signifikant (p < 0.01) von FtMYB116gefördert wurden, was darauf hindeutet, dass A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln als wirksames alternatives Werkzeug zur Untersuchung von Genfunktionen und der Produktion von sekundären Metaboliten verwendet werden können. Das in dieser Studie beschriebene detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung haariger Wurzeln kann nach der Anpassung für jede genetische Transformation oder andere Heilpflanzen übernommen werden.

Agrobacterium rhizogenes-vermittelte TB haarige Wurzeltransformation Diese Studie beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll, das eingerichtet wurde, um genetisch transformierte haarige Wurzeln mit A. rhizogeneszu erhalten. Es dauerte etwa 5-6 Wochen von der Impfung von TB-Samen bis zur Ernte der identifizierten haarigen Wurzeln, und einige wichtige Schritte sind in Abbildung 1 (A-H) dargestellt. Kurz gesagt, sterilisierte Schalensame...

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Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Wir beschreiben eine Methode zur Induktion haariger Wurzeln von Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum). Dies kann verwendet werden, um Genfunktionen und die Produktion von sekundären Metaboliten in Tartary Buchweizen zu untersuchen, für jede genetische Transformation angenommen werden, oder für andere Heilpflanzen nach Verbesserung verwendet werden.

Induzieren hairy Roots von Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Mit diesem Protokoll zeigen wir zum ersten Mal den Schrittweiseprozess zur Induktion haariger Wurzeln in tartärem Buchweizen. Diese Technik ist einfach und kostengünstig für den Einstieg in die Genomik und Mikrobiomik für herbbucher und andere Pflanzen. Obwohl diese detaillierte Methode für tartary Buchweizen eingerichtet ist, kann es auf andere Dicot-Pflanzen mit einigen Modifikationen angewendet werden.Obwohl diese Methode einfach durchzuführen ist, hat sie viele detaillierte Schritte. Visuelle Demonstration kann Forschern helfen, eine effizientere haarige Wurzelinduktion zu erreichen. Demonstriert wird das Verfahren von Guangtao Qian, einem Master-Studenten aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Auswahl von prallen und unbeschädigten tartären Buchweizensamen und dem Einweichen der Samen in 28 Grad Celsius Wasser für ca. 20 Minuten. Wenn die Samenschicht leicht entfernt werden kann, legen Sie 100 bis 200 geschälte Samen 30 Sekunden lang in einen sterilisierten 100-Milliliter-Konuskolben mit 75 % Ethanol. Am Ende der Sterilisation das Ethanol durch 5% Natriumhypochlorit ersetzen.Nach 15 Minuten das Natriumhypochlorit dekantieren und die Samen fünfmal mit sterilem entionisiertem Wasser waschen. Dann die Samen mit einem Stück sterilem bibulösem Papier trocknen. Um herb Buchweizen-Sämlinge zu erhalten, fügen Sie 10 Samen pro Flasche zu einzelnen 300 Milliliter Pflanzengewebe Kulturflaschen mit 50 Milliliter MSSA Medium.Dann keimen die Samen in einem Kulturraum bei 25, plus oder minus 1 Grad Celsius bei Licht. Nach 7 bis 10 Tagen robuste Sämlinge mit zwei Stücken entfalteter Kotyledonen auswählen und die Sämlinge von den Wurzeln schneiden. Die Sämlinge in eine sterile Petrischale geben und die Hypocotyle in 0,8 bis 1 Zentimeter große Segmente schneiden.Die Kotyledonen in etwa 0,5 Zentimeter große Stücke verdecken und die resultierenden Explanten unter Lichtbedingungen 24 Stunden lang vorkultieren. Am nächsten Tag die Expflanzen in einen sterilisierten 100 Milliliter Konuskolben übertragen. Um A.rhizogenes zu aktivieren, tauen Sie die Kultur auf Eis auf, bevor Sie die Bakterien gleichmäßig auf YEB-Festmedium mit Antibiotika für eine 12- bis 16-stündige Inkubation bei 28 Grad Celsius plattieren.Am nächsten Morgen, wählen Sie eine monoklonale Kolonie für Kultur in einer neuen Petrischale, wie gerade gezeigt. Nach einer weiteren 12- bis 16-stündigen Inkubation impfen Sie die resultierenden monoklonalen Kolonien in einem sterilisierten 100 Milliliter konischen Kolben, der 20 Milliliter YEB-Festmedium mit Antibiotika bei 28 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute enthält, bis die optische Dichte bei 600 2,0 erreicht. Dann übertragen Sie 2-4% der bakteriellen Zellkultur in einen neuen 100 Milliliter konischen Kolben mit 20 Milliliter frischem YEB-Festmedium mit Antibiotika bei 28 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute für 4 bis 5 Stunden, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 erreicht.Um eine haarige Wurzeltransformation zu induzieren, übertragen Sie die A.rhizogenes-Kultur in eine sterile 50 Milliliter konische Röhre und sammeln die Bakterien durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in MSSAS-Medium auf eine optische Dichte von ca. 0,2 aus und infundieren Sie die Suspension in den Kolben von Exmodulen. Nach 10 Minuten die Explants aus dem Kolben entfernen und mit einem Stück sterilem bibulösem Papier bestreichen.Dann legen Sie ein steriles Stück Filterpapier mit 9 Zentimeterdurchmesser auf eine Schüssel mit MSSAAS-Medium und überlagern Sie die Expflanzen auf dem Filterpapier für eine dreitägige Inkubation bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Am Ende der Inkubation ca. 20 infizierte Explanten auf MSSACK-Mittel übertragen und die Pflanzen unter Lichtbedingungen bei 25, plus oder minus 1 Grad Celsius vertikal bebrüten. Nach 10 bis 14 Tagen Kultur, wählen Sie die haarigen Wurzeln, die ein weißes Aussehen und schnelles Wachstum zeigen und schneiden Sie die Wurzeln in zwei bis drei Zentimeter Stücke.Zählt klar die Wurzeln auf einer sauberen Bank. Subkultur die Wurzelstücke in einem sterilisierten 100 Milliliter konischen Kolben mit MSSK Medium bei 25 Grad Celsius und 80 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln, bis sie sich bis zum Boden des Kolbens überbreiten. Um die haarigen Wurzeln zu identifizieren, entfernen Sie alle tawny und kontaminiertbehaarten Wurzeln und wählen Sie diejenigen mit einem weißen Aussehen.Wenn ein Reportergen verwendet wurde, überprüfen Sie die Wurzeln auf Fluoreszenz unter einem blauen oder leichten Dual-Ultraviolett-Transilluminator und wählen Sie die haarigen Wurzeln aus, die ein starkes fluoreszierendes Signal aufweisen. Dann trocknen Sie die Wurzeln mit saugfähigem Papier und wickeln Sie sie in markierte Aluminiumfolie für die sofortige Analyse. Für die langfristige Lagerung, lyophilisieren Sie die Wurzeln in flüssigem Stickstoff und legen Sie die Wurzeln bei minus 80 Grad Celsius bis zu ihrer Untersuchung.Nach der genetischen Transformation und Kultur, wie gezeigt, werden die haarigen Wurzeln eine flauschige weiße Farbe und eine plagiotrope Weise in den Wundstellen der Expflanzen aufweisen und eine stark verzweigte und verzahnte Matrix bilden. Ein Reportergen kann verwendet werden, um die Differenzierung der transgenen haarigen Wurzeln unter einer blauen oder leichten dualen ultravioletten Transillumination oder die Identifizierung eines Zielgens von Interesse zu erleichtern. Hierwird wird die relative Expression eines lichtinduzierten Transkriptionsfaktors in den transgenen Linien von tartären Buchweizenhaarwurzeln gezeigt.Insbesondere wird die Biosynthese von Rutin und Quercetin auch auf metabolischer Ebene als Reaktion auf den induzierten Transkriptionsfaktor Überexpression gefördert. Darüber hinaus ist die relative Genexpression von Flavenoid-Synthesesignalgenen in allen drei transgenen Linien bemerkenswert höher als die in der Kontrollgruppe gemessenen, was auf eine erfolgreiche haarige Wurzeltransformation in herbaren Buchweizenexplanten hindeutet. Das ist Infektion der Samen, Selektion der Expflanzen, und die Konzentration der Bakterien direkt beeinflussen den Erfolg der haarigen Wurzelinduktion.Wir können die Genexpression, DNA-Protein- oder Proteinproteinreaktionen oder die Massenproduktion von sekundären Metaboliten bewerten, um sekundäre Metaboliten der Transkriptionsregulation zu untersuchen. Die konstruierten Bakterien sind gefährlich für Mensch und Umwelt. Achten Sie darauf, die Bakterien richtig zu behandeln, zu bedienen und zu entsorgen.

Research

JoVE Journal

Genetics

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