Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dai Fondi fondamentali di ricerca per gli istituti centrali di ricerca sul welfare pubblico, XKT17002.

La TB utilizzata in questo studio è stata chiamata BT18, che ha avuto origine dalla razza di "JinQiao No.2" coltivata dal Centro di ricerca di piccolo grano varie della Shanxi Academy of Agricultural Science. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1.
NOTA: Utilizzare rapidamente la manipolazione relativa agli espianti e, quando possibile, tenere i piatti Petri chiusi per evitare appassimento e contaminazione. Se non diversamente s...

La TB è stata utilizzata in diversi studi relativi ai metaboliti secondari a livelli genetici e metabolici1,2,5,27,28. La coltura delle radici hairy, come fonte unica per la produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell'ingegneria metabolica29 e può essere utilizzata per alterare le vie metaboliche inserendo i geni corre...

Il grano saraceno tartario (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) è un tipo di dicoledone appartenente al genere Fagopyrum e alla famiglia Polygonaceae1. Come tipo di cibo omologato medicina levato, la TB ha ricevuto un notevole interesse a causa della sua composizione chimica distintiva e delle diverse bioattività contro le malattie. La tubercolosi è principalmente ricca di carboidrati, proteine, vitamine e carotenoidi, nonché in polifenoli come fenolici e flavonoidi1. Varie attività biologiche e farmacologiche dei flavonoidi, tra cui antiossidanti, antiipertensive2e anti-infiammatori e proprietà antitumorali e antidiabetici, sono state dimostrate3.
Agrobacterium rhizogenes è un batterio del suolo che contribuisce allo sviluppo di malattie delle radici pelose in diverse piante superiori, in particolare dicotiledoni, infettando i siti delle ferite4,5. Questo processo è iniziato dal trasferimento del DNA T nel plasmide che induce la radice (Ri)5,6 ed è comunemente accompagnato dall'integrazione e dall'espressione di un gene esogeno dal Ri plasmide e dalle successive fasi di generazione del fenotipo della radice pelosa7. A. le radici pelose transgeniche mediate da rizogeni,come potente strumento nel campo della biotecnologia vegetale, sono state ampiamente utilizzate a causa della loro produttività stabile e elevata e del facile ottenimento in un breve periodo. Inoltre, le radici pelose indotte da A. rhizogenes si distinguono in modo efficiente per il loro sviluppo di radici plagiotropiche e la crescita altamente ramificata in un mezzo privo di ormoni8. Possono essere utilizzati in diversi campi di ricerca, tra cui la produzione di semi artificiali, la ricerca sul nodulo delle radici, e nello studio delle interazioni con altri organismi come i funghi micorrizaci, i nematodi e i patogeni delle radici7,9. Inoltre, le colture di trasformazione delle radici pelose sono state ampiamente utilizzate come sistema sperimentale per studiare i percorsi biochimici e la segnalazione chimica e per produrre metaboliti secondari vegetali che vengono utilizzati come prodotti farmaceutici, cosmetici e additivi alimentari8,10. I preziosi metaboliti secondari, tra cui alcaloidi indole, aconiti, alcaloidi del tropane, terpenoidi e flavonoidi, sintetizzati in radici pelose di tipo selvatico sono stati studiati per diversi decenni in numerose specie, come il ginsenoside,in Panax ginseng11, coumarine in Ammi majus12, e i composti fenolici in23.13
Le radici pelose sono state prodotte utilizzando A. rhizogenes in 79 specie vegetali di 27 famiglie14. Per esempio, A. rizogenes-mediato trasformazione della radice pelosa mediata è stato segnalato nella soia15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e cicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb trasformazione della radice pelosa è stato studiato anche2. Sono disponibili pochi protocolli dettagliati per quanto riguarda lo sviluppo di radici pelose mediate da A. rhizogenes che trasportano o meno un vettore binario. Per esempio, Sandra et al.21 ha introdotto un metodo per produrre radici pelose di patate transgeniche sostenute nei germogli di tipo selvatico. Le radici pelose completamente sviluppate potrebbero essere visualizzate 5-6 settimane dopo l'iniezione di A. rizogeni che trasportavano il gene del gus reporter negli internodi delle piante di patate. Un altro studio aveva anche riportato un sistema di radici pelose transgeniche indotto da A. rhizogenes che ospita il gene di reporter gusA in iuta (Corchorus capsularis L.) 22. Inoltre, Supaart et al.23 ha ottenuto radici pelose di tabacco transgenico utilizzando A. rhizogenes trasformati con il vettore di espressione pBI121 portando il gene di sintetizzatori di acido1-tetraidrocancandeinolicosco (THCA) per produrre THCA.
Tuttavia, un processo passo-passo per una generazione efficace di trasformazione della radice pelosa, soprattutto nella TB, è stato relativamente meno dimostrato. In questo studio, abbiamo descritto un protocollo dettagliato utilizzando A. rhizogenes che trasporta il gene reporter (GFP), un marcatore selettivo (Kan) e un gene di interesse (b4, un gene identificato dal nostro gruppo ma inedito dalla famiglia di base elicoidale-loop-elica(bHLH) per generare la trasformazione genetica della radice pelosa nella TB. L'esperimento durò 5-6 settimane, dall'inoculazione dei semi alla generazione di radici pelose, coinvolgendo la preparazione dell'espianto, l'infezione, la cocultura, la subcultura e la successiva propagazione. Inoltre, A. rhizogenes contenente un plasmid binario che trasporta la transgene TB del fattore di trascrizione della mieloblastosi 116 (FtMYB116) è stato utilizzato per determinare se il FtMYB116 può promuovere l'accumulo di flavonoidi, in particolare rutina, nella TB a livello genico e metabolico attraverso la trasformazione della radice pelosa della TB. FtMYB116, che è un fattore trascrizionale indotta dalla luce, regola la sintesi della rutina in diverse condizioni di luce5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-idxylase (F3H), flavonoide-3'-hydroxylase (F3'H), e flavonol synthase (FLS)24 sono enzimi chiave coinvolti nel percorso metabolico della biosintesi della rutina. Pertanto, questo studio dimostra la sovraespressione di FtMYB116 nelle radici pelose della TB e l'espressione dei geni enzimatici chiave, nonché il contenuto di rutina e altri flavonoidi come la quercetina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

Il grano saraceno tartario (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possiede varie attività biologiche e farmacologiche perché contiene abbondanti metaboliti secondari come i flavonoidi, in particolare la rutina. Agrobacterium rhizogenes sono stati gradualmente utilizzati in tutto il mondo per indurre le radici pelose nelle piante medicinali per studiare le funzioni geniche e aumentare la resa dei metaboliti secondari. In questo studio, abbiamo descritto un metodo dettagliato per generare A. rhizogenes-mediato radici pelose nella TB. I cotiledonti e l'asse ipocotiledonario a 7-10 giorni furono selezionati come espianti e infettati da A. rhizogenes con un vettore binario, che indusse radici pelose avventurose che apparivano dopo 1 settimana. La trasformazione della radice pelosa generata è stata identificata sulla base della morfologia, della selezione della resistenza (kanamycin) e dell'espressione genica del reporter (proteina fluorescente verde). Successivamente, le radici pelose trasformate si sono propagate come richiesto. Nel frattempo, un fattore di trascrizione della mieloblastosi (MYB), FtMYB116, è stato trasformato nel genoma della TB utilizzando le radici pelose mediate da A. rhizogenesper verificare il ruolo del FtMYB116 nel sintetizzare i flavonoidi. I risultati hanno mostrato che l'espressione dei geni correlati ai flavonoidi e la resa di composti pelosi (rutina e quercetina) sono stati significativamente (p < 0,01) promossi da FtMYB116, indicando che le radici pelose mediate da A. rhizogenespossono essere utilizzate come strumento alternativo efficace per studiare le funzioni genetiche e la produzione di metaboliti secondari. Il protocollo dettagliato passo-passo descritto in questo studio per la generazione di radici pelose può essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica o altre piante medicinali dopo l'adattamento.

Agrobacterium rhizogenes-mediato TB trasformazione della radice pelosa Questo studio descrive il protocollo passo-passo che è stato stabilito per ottenere radici pelose geneticamente trasformate utilizzando A. rhizogenes. Ci sono volute circa 5-6 settimane dall'inoculazione dei semi di TB alla raccolta delle radici pelose identificate, e alcuni passaggi chiave sono raffigurati nella Figura 1 (A-H). In breve, i semi sgusciati sterilizzat...

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Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Descriviamo un metodo per indurre radici pelose da Agrobacterium rhizogenes- trasformazione mediata in grano saraceno tartario (Fagopyrum tataricum). Questo può essere utilizzato per studiare le funzioni geniche e la produzione di metaboliti secondari nel grano saraceno tartario, essere adottato per qualsiasi trasformazione genetica, o utilizzato per altre piante medicinali dopo il miglioramento.

Indurre radici pelose di Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Utilizzando questo protocollo, dimostreremo il processo passo dopo passo per indurre per la prima volta radici pelose nel grano saraceno di tartaria. Questa tecnica è facile ed economica per iniziare a genomica e microbiomica per il grano saraceno di tartaria e altre piante. Sebbene questo metodo dettagliato sia impostato per il grano saraceno di tartaria, può essere applicato ad altre piante di dicot con alcune modifiche.Sebbene questo metodo sia facile da eseguire, ha molti passaggi dettagliati. La dimostrazione visiva può aiutare i ricercatori a ottenere un'induzione della radice pelosa più efficiente. A dimostrare la procedura sarà Guangtao Qian, uno studente di Master del mio laboratorio.Inizia selezionando semi di grano saraceno di tartare paffuto e integro e immergendo i semi in acqua di 28 gradi Celsius per circa 20 minuti. Quando il rivestimento del seme può essere facilmente rimosso, posizionare da 100 a 200 semi pelati in un matraccio conico sterilizzato da 100 millilitri contenente 75% di etanolo per 30 secondi. Al termine della sterilizzazione, sostituire l'etanolo con il 5% di ipoclorito di sodio.Dopo 15 minuti, decantare l'ipoclorito di sodio e lavare i semi con acqua deionizzata sterile cinque volte. Quindi asciugare i semi con un pezzo di carta bibulosa sterile. Per ottenere piantine di grano saraceno alla tartaria, aggiungere 10 semi per bottiglia a singole bottiglie di coltura di tessuti vegetali da 300 millilitri contenenti 50 millilitri di mezzo MSSA.Quindi, germinare i semi in una stanza di coltura a 25, più o meno 1, gradi Celsius in condizioni di luce. Dopo 7-10 giorni, seleziona piantine robuste con due pezzi di cotyledon spiegati e taglia le piantine dalle radici. Posizionare le piantine in una piastra di petri sterile e tagliare gli ipoccotili in segmenti da 0,8 a 1 centimetro.Inchioda i cotyledon in pezzi di circa 0,5 centimetri e pre-coltura gli espianto risultanti in condizioni di luce per 24 ore. Il giorno dopo, trasferire le espianto in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri. Per attivare gli A.rhizogenes, scongelare la coltura sul ghiaccio prima di placcare uniformemente i batteri su un mezzo solido YEB con antibiotici per un'incubazione da 12 a 16 ore a 28 gradi Celsius.La mattina dopo, scegli una colonia monoclonale per la cultura in una nuova piastra di Petri come appena dimostrato. Dopo un'altra incubazione da 12 a 16 ore, inoculare le colonie monoclonali risultanti in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri contenente 20 millilitri di mezzo solido YEB con antibiotici a 28 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 16-18 ore fino a quando la densità ottica a 600 raggiunge 2,0. Quindi trasferire il 2-4% della coltura cellulare batterica in un nuovo pallone conico da 100 millilitri contenente 20 millilitri di mezzo solido YEB fresco con antibiotici a 28 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 4-5 ore fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge circa 0,5.Per indurre la trasformazione della radice pelosa, trasferire la coltura di A.rhizogenes in un tubo conico sterile da 50 millilitri e raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in mezzo MSSAS a una densità ottica di circa 0,2 e infondere la sospensione nel pallone delle espianto. Dopo 10 minuti, rimuovere le espianto dal pallone e tamponarle con un pezzo di carta bibulosa sterile.Quindi posizionare un pezzo sterile di carta da filtro di 9 centimetri di diametro su un piatto di mezzo MSSAAS e sovrapporre le espianto sulla carta filtrante per un'incubazione di tre giorni a 25 gradi Celsius al buio. Alla fine dell'incubazione, trasferire circa 20 espianto infetti su mssack medio e incubare verticalmente le piante in condizioni di luce a 25, più o meno 1, gradi Celsius. Dopo 10-14 giorni di cultura, seleziona le radici pelose dimostrando un aspetto bianco e una rapida crescita e taglia le radici in pezzi da due a tre centimetri.Numera chiaramente le radici su una panchina pulita. Sottocultura i pezzi di radice in un pallone conico sterilizzato da 100 millilitri contenente mezzo MSSK a 25 gradi Celsius e 80 giri al minuto al buio fino a quando non si dispendono troppo sul fondo del pallone. Per identificare le radici pelose, rimuovere eventuali radici pelose e contaminate e selezionare quelle con un aspetto bianco.Se è stato utilizzato un gene reporter, controllare le radici per la fluorescenza sotto un transilluminatore blu o chiaro doppio ultravioletto e selezionare le radici pelose che mostrano un forte segnale fluorescente. Quindi asciugare le radici con carta assorbente e avvolgerle in un foglio di alluminio marcato per un'analisi immediata. Per la conservazione a lungo termine, lyophilize le radici in azoto liquido e posizionare le radici a meno 80 gradi Celsius fino alla loro indagine.Dopo la trasformazione genetica e la cultura, come dimostrato, le radici pelose mostreranno un colore bianco soffice e un modo plagiotropico nei siti di ferita delle espianto e formeranno una matrice altamente ramificata e interconnessa. Un gene reporter può essere usato per facilitare la differenziazione delle radici pelose transgeniche sotto una transilluminazione ultravioletta doppia blu o chiara, o l'identificazione di un gene bersaglio di interesse. Qui, viene mostrata l'espressione relativa di un fattore di trascrizione indotto dalla luce nelle linee transgeniche delle radici pelose di grano saraceno di tartaria.In particolare, la biosintesi della rutina e della quercetina sono promosse anche a livello metabolico in risposta alla sovraespressione del fattore di trascrizione indotto. Inoltre, l'espressione genica relativa dei geni della via di sintesi flavenoide in tutte e tre le linee transgeniche, è notevolmente superiore a quelle misurate nel gruppo di controllo, indicando una trasformazione positiva delle radici pelose negli espianto di grano saraceno di tartaria. Cioè l'infezione dei semi, la selezione delle espianto e la concentrazione dei batteri influenzano direttamente il successo dell'induzione della radice pelosa.Possiamo valutare l'espressione genica, le reazioni proteiche del DNA o delle proteine o la produzione di massa di metaboliti secondari per studiare i metaboliti secondari di regolazione trascrizionale. I batteri ingegnerizzati sono pericolosi per l'uomo e il suo ambiente. Fare attenzione a maneggiare, utilizzare e smaltire correttamente i batteri.

Research

JoVE Journal

Genetics

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