Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
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本研究は中央公共福祉研究機関ZXKT17002の基礎研究基金によって支援されました。

この研究で使用される結核は、山西農業科学アカデミーの小雑穀物研究センターが栽培した「JinQiao No.2」の品種に由来するBT18と名付けられました。このプロトコルの主要な手順を図 1に示します。
注:外植に関連する操作を迅速に操作し、可能であれば、ペトリ皿を閉じてしまい、しおれや汚染を避けてください。特に明記しない限り、全ての外植?...

結核は、遺伝的および代謝レベル,,1、2、5、27、282,5で二1次代謝産物に関連するいくつかの研究で使用されている。2728毛深い根培養は、代謝産物産生のユニークな供給源として、代謝工学29において極めて重要な役割を果たし、関連遺伝子を挿入するこ?...

酒類そば(TB)(ファゴピルム・タタリカム(L.)ゲールトン)は、ファゴピルム属及びファミリー・ポリゴンア科1に属するジコチルドンの一種である。中国医学の相同食品の一種として、結核は、その独特の化学組成と疾患に対する多様な生物活動のためにかなりの関心を受けています。TBは主に炭水化物、タンパク質、ビタミン、カロテノイド、フェノール酸およびフラボノイドなどのポリフェノール類に富んでいます1.抗酸化、抗高血圧2、および抗炎症ならびに抗癌および抗糖尿病特性を含むフラボノイドの様々な生物学的および薬理活性が実証されている3。
アグロバクテリウム・リゾゲネスは、創傷部位44,55に感染することにより、いくつかの高等植物、特にジコチルドンにおける毛深い根疾患の発症に寄与する土壌細菌である。このプロセスは、根誘起(Ri)プラスミド55、66におけるT-DNAの転写によって開始され、一般的には、Riプラスミドからの外因性遺伝子の統合および発現と毛深い根表現型7を生成するステップを伴う。A. 根茎遺伝子-媒介トランスジェニック毛根は、植物バイオテクノロジーの分野における強力なツールとして、短期間での安定した高い生産性と容易な入手のために最も広く使用されてきた。さらに、A.根茎遺伝子によって誘導される毛深い根は、その形成的な根の発達とホルモンフリー培地8における高度に分岐する成長によって効率的に区別される。それらは、人工種子生産、根結節研究、および菌根菌菌、線虫、および根病原体77、99などの他の生物との相互作用を研究する研究を含むいくつかの研究分野で使用することができる。また、毛深い根形転換培養は、生化学的経路や化学シグナル伝達を調査し、医薬品、化粧品、食品添加物88,1010として使用される植物二次代謝産物を製造するための実験システムとして広く使用されている。野生型の毛状根で合成されたインドールアルカロイド、アコナイト、トロパネアルカロイド、フラボノイドなどの貴重な二次代謝産物は、数十年にわたり、パナックス人参11のギンセノシド、アムミマジャス12、およびフェノリック化合物で数十年にわたって調査2,されてきた。
毛深い根は、27家族から79種の植物種でA.根茎遺伝子を用いて製造されている14.例えば、A.根茎-媒介毛根形変換は、大豆15、16、サルビア17、プラムバゴインディカ18、ロータスジャポニクス19、チコリ(チコリウムインティバスL.)で報告されています。,1620.TB毛深い根形変換も調査済み 2.バイナリベクターを運ぶかどうかにかかわらず、A.根遺伝子によって媒介される毛深い根の発達に関して利用可能な詳細なプロトコルはほとんどありません。例えば、Sandra et al.21は野生型の芽に持続するトランスジェニックポテト毛状根を作製する方法を導入した。完全に発達した毛深い根は、ジャガイモ植物の茎間節にガスレポーター遺伝子を運ぶA.根茎遺伝子の注入後5〜6週間後に視覚化することができた。別の研究はまた、ジュートでgusAレポーター遺伝子を収容するA.根茎遺伝子によって誘発されるトランスジェニック毛状根系を報告していた(コーコーラスカプクラリスL.22さらに、Supaartら23は、Δ1-テトラヒドロカンナビノール酸(THCA)合成酵素の遺伝子を担持する発現ベクター pBI121で形質転換したA.根生遺伝子を用いてトランスジェニックタバコ毛状根を得てTHCAを産生する。
しかし、特に結核において、毛深い根形変換の効果的な生成のためのステップバイステップのプロセスは比較的実証されていない。本研究では、レポーター遺伝子(GFP)、選択的マーカー(Kan)、および対象遺伝子(b4)を用いた詳細なプロトコル(我々の群から同定されたが、基本的ならせんループらせん(bHLH)ファミリー)を用いて、結核における毛深い根遺伝子変換を生成する詳細なプロトコルについて説明した。実験は、外植の準備、感染、コキュレーション、培養、その後の伝播を含む、種子の接種から毛深い根の生成まで、5〜6週間続いた。さらに、骨髄芽細胞症転写因子116の結核トランスジーンを運ぶバイナリプラスミドを含むA.リゾゲレンスは、FtMYB116がTB毛根形変換を介して遺伝子および代謝レベルにおけるフラボノイド、特にルチンの蓄積を促進できるかどうかを決定するために使用された。FtMYB116は、光誘発転写因子であり、異なる光条件5の下でルチンの合成を調節する。カルボンシンターゼ(CHS)、フラバノン-3-ヒドロキシラーゼ(F3H)、フラボノイド-3'ヒドロキシラーゼ(F3'H)およびフラボノールシンターゼ(FLS)24は、ルチン生合成の代謝経路に関与する主要な酵素である。H24そこで、この研究は、結核性毛深い根におけるFtMYB116の過剰発現と主要な酵素遺伝子の発現、ならびにルチンおよびケルセチンなどの他のフラボノイドの含有量を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

酒類そば(TB)[ファゴピルラムタタサリカム(L.)ゲールトン]は、フラボノイド、特にルチンなどの二次代謝産物が豊富に含まれているため、様々な生物学的および薬理学的活性を有する。アグロバクテリウム・リゾゲネスは、徐々に遺伝子機能を調査し、二次代謝産物の収量を増加させるために薬用植物の毛深い根を誘導するために、世界的に使用されてきました。本研究では、結核におけるA.根茎遺伝子媒介性毛状根を生成する詳細な方法を説明した。7~10日のコチルドンと低コチルド軸を外植体として選び、バイナリベクターを持つA.根茎に感染し、1週間後に出現した出現性の毛状根を誘発した。生成された毛深い根形質転換は、形態、抵抗性選択(カナマイシン)、レポーター遺伝子発現(緑色蛍光タンパク質)に基づいて同定した。その後、変換された毛深い根は、必要に応じて自己増殖した。一方、骨髄芽細胞症(MYB)転写因子FtMYB116は、フラボノイドの合成におけるFtMYB116の役割を検証するために、A.根茎遺伝子媒介毛根を用いて結核ゲノムに変換された。その結果、フラボノイド関連遺伝子の発現とフラボノイド化合物(ルチンおよびケルセチン)の収量がFtMYB116によって有意に促進された(p<0.01)ことを示し、A.根茎介在毛根が遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するための効果的な代替ツールとして使用できることを示した。毛深い根を生成するためのこの研究で説明されている詳細なステップバイステッププロトコルは、調整後に任意の遺伝的形質転換または他の薬用植物に採用することができる。

アグロバクテリウム根虫遺伝子-媒介性結核毛状根形変換 本研究では、A.根茎遺伝子を用いて遺伝的に形質転換された毛深い根を得るために確立されたステップバイステップのプロトコルについて説明する。TB種子の接種から、同定された毛深い根の収穫まで約5〜6週間かかり、いくつかの重要なステップが図1(A-H)に示A-Hされてい?...

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Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

我々は、アグロバクテリウム・リゾゲネスによって毛深い根を誘導する方法を記述する - 酒盤の媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)これは、タータリーそばにおける遺伝子機能および二次代謝産物の産生を調査するために使用され、任意の遺伝的形質転換に採用されるか、または改善後の他の薬用植物に使用することができる。

アグロバクテリウム・リゾゲネスによる毛深い根を誘発する -タータルソバにおける媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

このプロトコルを用いて、初めて、酒根のそばに毛深い根を誘導するステップバイステップのプロセスを紹介します。この技術は、タータリーそばや他の植物のためのゲノミクスやマイクロバイオミクスを開始するための簡単かつ安価です。この詳細な方法は、タータリーそばのために設定されていますが、それはいくつかの変更を加えた他の二分植物に適用することができます。この方法は簡単に実行できますが、多くの詳細な手順があります。視覚的なデモンストレーションは、研究者がより効率的な毛深い根誘導を達成するのに役立ちます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の学生、広田銭です。まず、ふっくらと損傷していないタルトのそばの種を選択し、約20分間摂氏28度の水に種を浸すことから始めます。種子コートを容易に除去できたら、75%エタノールを含む100ミリリットルの円錐形フラスコに100〜200種を30秒間置く。滅菌の終わりに、エタノールを5%次亜塩素酸ナトリウムに交換する。15分後、次亜塩素酸ナトリウムをデカントし、滅菌脱イオン水で種子を5回洗います。その後、無菌のバイブル紙で種子を乾かします。酒木のそば苗を得るために、MSSA培地の50ミリリットルを含む個々の300ミリリットル植物組織培養ボトルにボトルあたり10種を加える。その後、25、プラスマイナス1、光条件下で摂氏度で培養室で種子を発芽させます。7~10日後、2枚のコチルドンを持つ丈夫な苗を選び、根から苗を切ります。苗を無菌のシャーレに入れ、低コチルを0.8〜1センチメートルのセグメントに切ります。コチルドンを約0.5センチメートルに分け、得られた外植物を光条件下で24時間培養する。翌日、外植を殺菌した100ミリリットルの円錐形フラスコに移す。A.rhizogenesを活性化するために、28°Cで12〜16時間のインキュベーションのために抗生物質でYEB固体培地に細菌を均等にめっくる前に氷上の培養物を解凍する。翌朝、ちょうど実証したように、新しいシャーレで文化のためのモノクローナルコロニーを選びます。さらに12〜16時間のインキュベーションの後、600で光学密度が2.0に達するまで、20ミリリットルのYEB固体培地を含む100ミリリットルの円錐形フラスコに得られたモノクローナルコロニーを28°Cの抗生物質で、毎分200回転で接種する。その後、細菌細胞培養物の2〜4%を、28°Cの抗生物質を含む新鮮なYEB固体培地20ミリリットルを含む新しい100ミリリットルの円錐形フラスコに、600ナノメートルの光学密度が約0.5に達するまで4〜5時間、毎分200回転に移します。毛深い根転移を誘発するには、A.rhizogenes培養物を無菌50ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離によって細菌を採取する。MSSAS培地中のペレットを約0.2の光学密度に再懸濁し、懸濁液を飛草のフラスコに注入する。10分後、フラスコから外植木を取り出し、滅菌バイブル紙でブロットします。その後、MSSAAS培地の皿に無菌直径9センチメートルのフィルターペーパーを置き、暗闇の中で摂氏25度で3日間のインキュベーションのために濾紙に外植を重ねます。インキュベーションの終了時に、約20個の感染した外植物をMSSACK培地に移し、25、プラスマイナス1度、摂氏度で軽い条件下で植物を垂直にインキュベートする。10~14日間培養した後、白い外観と急速な成長を示す毛深い根を選択し、根を2〜3センチメートルに切ります。明らかにクリーンベンチに根を番号付けします。25°CでMSSK培地を含む殺菌された100ミリリットルの円錐形フラスコに根片をサブ培養し、フラスコの底に広がるまで暗闇の中で毎分80回転培養する。毛深い根を識別するには、タウニーと汚染された毛深い根を取り除き、白い外観のものを選択します。レポーター遺伝子を使用した場合は、青色または薄いデュアル紫外トランスイルミエーターの下で蛍光の根を確認し、強い蛍光シグナルを示す毛深い根を選択します。その後、吸水性紙で根を乾燥させ、すぐに分析するためにマークされたアルミニウム箔でそれらを包みます。長期保存のために、液体窒素中の根を凍結乾燥させ、調査までマイナス80度に根を置きます。遺伝的変容と培養後、示されるように、毛深い根は外植の創傷部位にふわふわした白色とプラスジオトロピックの方法を示し、高度に分岐し、連結されたマトリックスを形成する。レポーター遺伝子は、青色または光二重紫外線トランスイルミネーション下でのトランスジェニック毛根の分化、または目的の標的遺伝子の同定を容易にするために使用することができる。ここで、タータリそば毛根のトランスジェニックラインにおける光誘発転写因子の相対的な発現が示されている。特に、ルチンおよびケルセチンの生合成は、誘発転写因子過剰発現に応答して代謝レベルでも促進される。また、3つのトランスジェニックラインすべてにおけるフレーブノイド合成経路遺伝子の相対的な遺伝子発現は、対照群で測定されたものよりも著しく高く、タータリーそば外植で毛深い根形転換に成功したことを示す。すなわち種子の感染、外植の選択、及び細菌の濃度は毛深い根誘導の成功に直接影響を及ぼす。遺伝子発現、DNAタンパク質、タンパク質タンパク質反応、二次代謝産物の大量生産を評価して、転写調節二次代謝産物を研究することができます。設計された細菌は、人間と彼の環境に有害です。適切に細菌を処理し、操作し、処分するように注意してください。

Research

JoVE Journal

Genetics

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