Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Pesquisa Fundamentais para os institutos centrais de pesquisa de bem-estar público ZXKT17002.

A TB utilizada neste estudo foi nomeada como BT18, que se originou da raça "JinQiao No.2" cultivada pelo Centro de Pesquisa de Pequenos Grãos Diversos da Academia shanxi de Ciências Agrícolas. Os passos primários deste protocolo são ilustrados na Figura 1.
NOTA: Opere rapidamente a manipulação relacionada às plantas e, quando possível, mantenha as placas de Petri fechadas para evitar murchas e contaminação. Salvo disposição em contrário, todas as in...

A TB tem sido utilizada em diversos estudos relacionados a metabólitos secundários em níveis genéticos e metabólicos1,2,5,27,28. A cultura raiz peluda, como fonte única de produção metabólica, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica29 e pode ser usada para alterar vias metabólicas inserindo os genes relaciona...

O trigo-sarraceno tartary (TB)(L.) Gaertn é um tipo de dicotyledon pertencente ao gênero Fagopyrum e à família Polygonaceae1. Como um tipo de alimento homólogo da medicina chinesa, a TB vem recebendo considerável interesse devido à sua composição química distinta e às diversas bioatividades contra doenças. A TB é principalmente rica em carboidratos, proteínas, vitaminas e carotenóides, bem como em polifenóis como ácidos fenólicos e flavonoides1. Várias atividades biológicas e farmacológicas de flavonoides, incluindo antioxidativo, anti-hipertensivo2, e anti-inflamatório, bem como propriedades anticancerígenas e antidiabéticas, foram demonstradas3.
Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria do solo que contribui para o desenvolvimento de doenças radiculares peludas em várias plantas superiores, especialmente dicotyledons, infectando locais de feridas4,5. Este processo é iniciado pela transferência do T-DNA no plasmídeo 55,6 e é comumente acompanhado pela integração e expressão de um gene exógeno do plasmídeo Ri e os passos subsequentes de geração do fenótipo da raiz peluda7. A. rhizogenes-mediadas raízes transgênicas peludas, como uma poderosa ferramenta no campo da biotecnologia vegetal, têm sido mais amplamente utilizadas devido à sua estabilidade e alta produtividade e fácil obtenção em um curto período de tempo. Além disso, as raízes peludas induzidas por A. rizógenes são eficientemente distinguidas pelo seu desenvolvimento de raiz plagiota e crescimento altamente ramificado em um meio livre dehormônios 8. Eles podem ser usados em diversos campos de pesquisa, incluindo produção de sementes artificiais, pesquisa de nódulos radiculares e no estudo das interações com outros organismos, como fungos micorrízicos, nematóides e patógenos radiculares7,9. Além disso, culturas de transformação de raízes peludas têm sido amplamente utilizadas como um sistema experimental para investigar as vias bioquímicas e a sinalização química e produzir metabólitos secundários vegetais que são usados como fármacos, cosméticos e aditivos alimentares8,10. Os valiosos metabólitos secundários, incluindo alcalóides indobes, aconitos, alcalóides tropanos, terpenóides e flavonoides, sintetizados em raízes peludas do tipo selvagem têm sido investigados por várias décadas em inúmeras espécies, como ginsenoside em Panax ginseng11, coumarine em Ammi majus12, e compostos fenólicos na TB2,13.
Raízes peludas foram produzidas usando A. rizogenes em 79 espécies de plantas de 27 famílias14. Por exemplo, a transformação da raiz peluda mediada por A. rhizogenesfoi relatada na soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e chicória(Cichorium intybus L.) 20. A transformação das raízes peludas da TB também foi investigada2. Poucos protocolos detalhados estão disponíveis em relação ao desenvolvimento de raízes peludas mediadas por A. rhizogenes ou carregando um vetor binário ou não. Por exemplo, Sandra et al.21 introduziram um método de produção de raízes transgênicas de batata peluda sustentadas em brotos do tipo selvagem. As raízes peludas totalmente desenvolvidas poderiam ser visualizadas 5-6 semanas após a injeção de A. rhizogenes carregando o gene gus reporter para o caule internode plantas de batata. Outro estudo também havia relatado um sistema de raiz peluda transgênica induzido por A. rhizogenes que abrigava o gene do repórter gusA na juta(Corchorus capsularis L.) 22. Além disso, Supaart et al.23 obtiveram raízes transgênicas de tabaco peludo usando A. rhizogenes transformados com a expressão vetorial pBI121 carregando o gene de Δ1-tetrahidrocanabinolic acid (THCA) para produzir THCA.
No entanto, um processo passo a passo para uma geração eficaz de transformação de raízes peludas, especialmente na TB, tem sido relativamente menos demonstrado. Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado usando A. rhizogenes carregando o gene do repórter(GFP),um marcador seletivo(Kan),e um gene de interesse(b4,um gene identificado do nosso grupo, mas um gene inédito da família hélice-loop-hélice básica (bHLH)para gerar transformação genética de raiz peluda na TB. O experimento durou de 5 a 6 semanas, desde a inoculação das sementes até a geração de raízes peludas, envolvendo a preparação explante, infecção, coculturing, subcultura e posterior propagação. Além disso, A. rizogenes contendo um plasmídeo binário que transporta o transgene de TB do fator de transcrição da mieloblastose 116 (FtMYB116) foi usado para determinar se ftMYB116 pode promover o acúmulo de flavonoides, particularmente rutina, em TB no nível genético e metabólico através da transformação da raiz peluda da TB. FtMYB116, que é um fator transcricional induzido pela luz, regula a síntese de rutin em diferentes condições de luz5. Calcone synthase(CHS),flavanone-3-hydroxylase(F3H),flavonoide-3'-hydroxylase(F3'H),e flavonol synthase(FLS)24 são enzimas-chave envolvidas na via metabólica da biossíntese rutina. Portanto, este estudo demonstra a superexpressão de FtMYB116 em raízes peludas da TB e a expressão de genes enzimáticos chave, bem como o conteúdo de rutin e outros flavonoides como a quercetina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

O trigo-sarraceno tartary (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possui várias atividades biológicas e farmacológicas porque contém metabólitos secundários abundantes, como flavonoides, especialmente rutina. Os rizógeness agrobacterium têm sido gradualmente usados em todo o mundo para induzir raízes peludas em plantas medicinais para investigar funções genéticas e aumentar o rendimento de metabólitos secundários. Neste estudo, descrevemos um método detalhado para gerar raízes peludas mediadas por A. Rhizogenesna TB. Cotyledons e eixo hipocotyledonary em 7-10 dias foram selecionados como explants e infectados com A. rizogenes carregando um vetor binário, que induziu raízes peludas aveniosas que apareceram após 1 semana. A transformação da raiz peluda gerada foi identificada com base na morfologia, seleção de resistência (kanamicina) e expressão genética de repórter (proteína fluorescente verde). Posteriormente, as raízes peludas transformadas foram auto-propagadas conforme necessário. Enquanto isso, um fator de transcrição da mieloblastose (MYB), FtMYB116, foi transformado no genoma da TB usando as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespara verificar o papel do FtMYB116 na sintetização dos flavonoides. Os resultados mostraram que a expressão de genes flavonoides e o rendimento de compostos flavonoides (rutina e quercetina) foram significativamente (p < 0,01) promovidos por FtMYB116, indicando que as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespodem ser usadas como uma ferramenta alternativa eficaz para investigar as funções genéticas e a produção de metabólitos secundários. O protocolo detalhado passo a passo descrito neste estudo para a geração de raízes peludas pode ser adotado para qualquer transformação genética ou outras plantas medicinais após o ajuste.

Agrobacterium rhizogenes-transformação de raiz peluda da TB mediada Este estudo descreve o protocolo passo-a-passo que foi estabelecido para obter raízes peludas geneticamente transformadas usando A. rhizogenes. Levou aproximadamente 5-6 semanas desde a inoculação das sementes de TB até a colheita das raízes peludas identificadas, e alguns passos-chave são retratados na Figura 1 (A-H). Resumidamente, as sementes com casca esteril...

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Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Descrevemos um método de indução de raízes peludas pela transformação mediada pelo Agrobacterium rhizogenesno trigo-sarraceno tartary(Fagopyrum tataricum). Isso pode ser usado para investigar funções genéticas e produção de metabólitos secundários em trigo sarraceno tartary, ser adotado para qualquer transformação genética, ou usado para outras plantas medicinais após a melhoria.

Indindo Raízes Peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformação Mediada em Trigo-Buck Tartary(Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Usando este protocolo, demonstraremos o processo passo a passo para induzir raízes peludas no trigo tartário pela primeira vez. Esta técnica é fácil e barata para começar a genômica e microbiomia para trigo-sarraceno tartário e outras plantas. Embora este método detalhado seja configurado para trigo-sarraceno tartário, ele pode ser aplicado a outras plantas dicot com algumas modificações.Embora este método seja fácil de executar, ele tem muitos passos detalhados. A demonstração visual pode ajudar os pesquisadores a alcançar uma indução de raiz pelente mais eficiente. Demonstrando o procedimento será Guangtao Qian, um estudante de mestrado do meu laboratório.Comece selecionando sementes de trigo-trigo tartário gordurosas e não danificadas e absorvendo as sementes em água Celsius de 28 graus por aproximadamente 20 minutos. Quando o casaco de sementes puder ser facilmente removido, coloque 100 a 200 sementes descascadas em um frasco cônico esterilizado de 100 mililitros contendo 75% de etanol por 30 segundos. No final da esterilização, substitua o etanol por hipoclorito de 5%.Após 15 minutos, decante o hipoclorito de sódio e lave as sementes com água deionizada estéril cinco vezes. Em seguida, borrique as sementes secas com um pedaço de papel bibuloso estéril. Para obter mudas de trigo tartário, adicione 10 sementes por garrafa a garrafas individuais de cultura de tecido vegetal de 300 mililitros contendo 50 mililitros de meio MSSA.Em seguida, germine as sementes em uma sala de cultura aos 25, mais ou menos 1, graus Celsius sob condições de luz. Após 7 a 10 dias, selecione mudas robustas com duas peças de cotilledons desdobrados e corte as mudas das raízes. Coloque as mudas em uma placa de petri estéril e corte os hipocotils em segmentos de 0,8 a 1 centímetro.Sheer the cotyledons em aproximadamente 0,5 centímetros de peças e pré-cultura as explantas resultantes sob condições de luz por 24 horas. No dia seguinte, transfira as explantas para um frasco consírico esterilizado de 100 mililitros. Para ativar A.rizogenes, descongele a cultura no gelo antes de emplacar uniformemente as bactérias no meio sólido YEB com antibióticos para uma incubação de 12 a 16 horas a 28 graus Celsius.Na manhã seguinte, escolha uma colônia monoclonal para cultura em uma nova placa de petri como acabou de demonstrar. Após mais 12 a 16 horas de incubação, inocular as colônias monoclonais resultantes em um frasco consílico esterilizado de 100 mililitros contendo 20 mililitros de yeb médio sólido com antibióticos a 28 graus Celsius e 200 revoluções por minuto por 16 a 18 horas até que a densidade óptica em 600 atinja 2,0. Em seguida, transfira 2-4% da cultura celular bacteriana para um novo frasco cônico de 100 mililitros contendo 20 mililitros de meio sólido YEB fresco com antibióticos a 28 graus Celsius e 200 revoluções por minuto por 4 a 5 horas até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja aproximadamente 0,5.Para induzir a transformação da raiz pelrosa, transfira a cultura A.rizogenes em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e colete as bactérias por centrifugação. Resuspenque a pelota em mssas médio para uma densidade óptica de aproximadamente 0,2 e infunda a suspensão no frasco de explants. Após 10 minutos, retire as explantas do frasco e borre-as com um pedaço de papel bibuloso estéril.Em seguida, coloque um pedaço estéril de 9 centímetros de diâmetro de papel filtro sobre um prato de mssaas médio e sobreponha as explantas no papel filtro para uma incubação de três dias a 25 graus Celsius no escuro. Ao final da incubação, transfira aproximadamente 20 explantas infectadas para o mssack médio e verticalmente incubar as plantas em condições leves a 25, mais ou menos 1, graus Celsius. Após 10 a 14 dias de cultura, selecione as raízes peludas demonstrando uma aparência branca e crescimento rápido e corte as raízes em pedaços de dois a três centímetros.Claramente numera as raízes em um banco limpo. Subcultura as peças radiculares em um frasco consílico esterilizado de 100 mililitros contendo mSK médio a 25 graus Celsius e 80 revoluções por minuto no escuro até que se espalharam para o fundo do frasco. Para identificar as raízes peludas, remova as raízes peludas e contaminadas e selecione aquelas com aparência branca.Se um gene repórter foi usado, verifique as raízes quanto à fluorescência sob um transilluminator ultra violeta azul ou leve e selecione as raízes peluadas que exibem um forte sinal fluorescente. Em seguida, seque as raízes com papel absorvente e enrole-as em papel alumínio marcado para análise imediata. Para armazenamento a longo prazo, lyophilize as raízes em nitrogênio líquido e coloque as raízes a menos 80 graus Celsius até sua investigação.Após a transformação genética e a cultura, como demonstrado, as raízes peludas exibirão uma cor branca fofa e uma forma plagiotrópico nos locais de ferida das explantas e formarão uma matriz altamente ramificada e entrelaçada. Um gene repórter pode ser usado para facilitar a diferenciação das raízes peluadas transgênicas sob uma transilluminação ultravioleta ultravioleta azul ou leve, ou a identificação de um gene alvo de interesse. Aqui, mostra-se a expressão relativa de um fator de transcrição induzido pela luz nas linhas transgênicas de raízes peludas tartárias.Notavelmente, a biossíntese de rutina e quercetina também são promovidas no nível metabólico em resposta à superexpressão do fator de transcrição induzida. Além disso, a expressão genética relativa dos genes da síntese flavenóide em todas as três linhas transgênicas, são notavelmente maiores do que as medidas no grupo controle, indicando uma transformação de raiz pelada bem sucedida em explantas tartárias de trigo sarraceno. Isso é infecção das sementes, seleção das explantas, e a concentração das bactérias afetam diretamente o sucesso da indução da raiz pelêgica.Podemos avaliar a expressão genética, a proteína do DNA ou reações proteicas ou a produção em massa de metabólitos secundários para estudar metabólitos secundários de regulação transcricional. As bactérias projetadas são perigosas para os humanos e seu ambiente. Tome cuidado para manusear, operar e descartar as bactérias corretamente.

Research

JoVE Journal

Genetics

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