Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фундаментальными научно-исследовательскими фондами для Центральных научно-исследовательских институтов социального обеспечения (XKT17002).

Туберкулез, используемый в этом исследовании, был назван BT18, который возник из породы "Цзиньцзяо No 2", культивируемой Исследовательским центром малого разного зерна Академии сельскохозяйственной науки Шаньси. Основные этапы этого протокола иллюстрируются на рисунке 1.</...

Туберкулез был использован в нескольких исследованиях, связанных со вторичными метаболитами на генетическом и метаболических уровнях1,,2,,5,,27,,28. Волосатые корневой культуры, как уникальный источни...

Тартарная гречка (ТБ)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) является одним из видов дикотипидона, относящихся к роду Фагопирум и семейство Polygonaceae1. Как вид гомологионной пищи китайской медицины, ТБ получает значительный интерес благодаря своему характерю химического состава и разнообразной биоактивности против болезней. Туберкулез в основном богат углеводами, белками, витаминами и каротиноидами, а также полифенолами, такими как фенольные кислоты и флавоноиды1. Продемонстрировано различные биологические и фармакологические свойства флавоноидов, в том числе антиоксидативные, антигипертензивные2и противовоспалительные, а также противораковые и антидиабетическиесвойства.
Agrobacterium rhizogenes является бактериейпочвы,которая способствует развитию волосатых корнеплодов в нескольких высших растений, особенно dicotyledons, путем заражения раны сайтов4,5. Этот процесс инициируется передачей T-ДНК в корневой плазмид(Ri) плазмид 5,,6 и обычно сопровождается интеграцией и экспрессией экзогенного гена из плазмида Ri и последующими шагами генерации волосатого фенотипа корня7. A.rhizogenes-опосредованные трансгенные волосатые корни, как мощный инструмент в области биотехнологии растений, наиболее широко используются благодаря их стабильной и высокой производительности и легкому получению в короткий период. Кроме того, волосатые корни, индуцированные A. rhizogenes эффективно отличаются их плагиотропного развития корня и высоко ветвления роста в гормон-свободной среде8. Они могут быть использованы в нескольких областях исследований, в том числе искусственного производства семян, исследования корневых узелков, а также при изучении взаимодействия с другими организмами, такими как микоризные грибы, нематод, и корнеплоды7,9. Кроме того, волосатые культуры преобразования корней широко используются в качестве экспериментальной системы для исследования биохимических путей и химической сигнализации и для производства вторичных метаболитов растений, которые используются в качестве фармацевтических препаратов, косметики и пищевых добавок8,10. Ценные вторичные метаболиты, в том числе индоле алкалоиды, акониты, тропановые алкалоиды, терпеноиды и флавоноиды, синтезированные в волосатых корнях дикого типа, были исследованы в течение нескольких десятилетий у многочисленных2,видов, таких как ginsenoside в panax ginseng11, кумарин в Am majmius12, и phenolic compounds.
Волосатые корни были произведены с использованием A. rhizogenes в 79 видов растений из 27 семейства14. Например, A. rhizogenes-опосредованныеволосатые корня преобразование было сообщено в сое15,16, Сальвиа17, Пламбаго Indica18, Lotus japonicus19, и цикорий (Cichorium intybus Л.) 20. ТБ волосатые преобразования корня также были исследованы2. Немногие подробные протоколы доступны в отношении развития волосатые корни при посредничестве A. rhizogenes либо проведение бинарный вектор или нет. Например, Sandra et al.21 внедрили метод производства трансгенных картофельных волосатых корней, выдержанный в побегах дикого типа. Полностью развитые волосатые корни могут быть визуализированы через 5-6 недель после инъекции А. ризогенов, несущих ген gus reporter в стволовые межузлы картофельных растений. Другое исследование также сообщило трансгенной волосатой корневой системы, индуцированной A. rhizogenes укрывательство гена репортера gusA в джуте (Corchorus capsularis L.) 22. Кроме того, Supaart et al.23 получили трансгенные табачные волосатые корни с использованием A. rhizogenes, преобразованного с помощью экспрессионного вектора pBI121, несущего ген синтазы 11-тетрагидроканнабиноловой кислоты (ТГКА) для производства ТГКА.
Однако поэтапный процесс эффективного поколения трансформации волосатых корней, особенно при тб-тбе, был относительно менее продемонстрирован. В этом исследовании, мы описали подробный протокол с использованием A. rhizogenes проведения репортер гена (GFP), селективный маркер (Кан), и ген интереса (b4, определены из нашей группы, но неопубликованный ген из основных селип-петля-сhelix (bHLH) семьи) для создания волосатых корней генетической трансформации при туберкулезе. Эксперимент длился 5-6 недель, от прививки семян до генерации волосатых корней, включая препарат эксплантации, инфекцию, сокультивирование, субкультирование и последующее распространение. Кроме того, A. rhizogenes, содержащий бинарную плазмиду, несущую тб-трансген транскрипционного фактора миелобластоза 116 (FtMYB116),был использован для определения того, может ли FtMYB116 способствовать накоплению флавоноидов, особенно рутения, в туберкулезе на гене и метаболическом уровне через тб-волосатую трансформацию корня. FtMYB116, который является светоиндуцированным транскрипционным фактором, регулирует синтез рутения при различных условиях света5. Синкон синтаза (CHS), флаванон-3-гидроксилаза (F3H),флавоноид-3'-гидроксилаза (F3'H), и флавонол синтаза (FLS)24 являются ключевыми ферментами, участвующими в метаболический путь биосинтеза рутина. Таким образом, это исследование демонстрирует переэкспрессию FtMYB116 в ТБ волосатые корни и экспрессия ключевых генов фермента, а также содержание рутения и других флавоноидов, таких как кверцетин.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

Тартарная гречка (ТБ) -Фагопирум татарикум (L.) Gaertn) обладает различными биологическими и фармакологическими видами деятельности, поскольку содержит обильные вторичные метаболиты, такие как флавоноиды, особенно рутетин. Агробактерии rhizogenes постепенно используются во всем мире, чтобы вызвать волосатые корни в лекарственных растений для исследования функций генов и повышения урожайности вторичных метаболитов. В этом исследовании мы описали подробный метод для создания A. rhizogenes-опосредованноговолосатые корни при туберкулезе. Cotyledons и hypocotyledonary соты на 7-10 дней были выбраны в качестве explants и инфицированных A. rhizogenes проведения бинарного вектора, который индуцированных приключений волосатые корни, которые появились после 1 недели. Генерируемая трансформация волосатых корней была определена на основе морфологии, отбора резистентности (канамицин) и экспрессии генов репортера (зеленый флуоресцентный белок). Впоследствии, преобразованные волосатые корни были самораспространены по мере необходимости. Между тем, миелобластоз (MYB) транскрипционный фактор, FtMYB116, был преобразован в геном тб с помощью A. rhizogenes-опосредованноговолосатые корни для проверки роли FtMYB116 в синтезации флавоноидов. Результаты показали, что экспрессия генов, связанных с флавоноидами, и урожайность флавоноидных соединений (рутина и кверцетина) были значительно (p qlt; 0.01) способствовали FtMYB116, что свидетельствует о том, что A. rhizogenes-опосредованныеволосатые корни могут быть использованы в качестве эффективного альтернативного инструмента для исследования функций генов и производства вторичных метаболитов. Подробный пошаговый протокол, описанный в данном исследовании для генерации волосатых корней, может быть принят для любой генетической трансформации или других лекарственных растений после корректировки.

Agrobacterium rhizogenes-опосредованный ТБ волосатые корня преобразования Это исследование описывает пошаговое протокол, который был создан для получения генетически преобразованных волосатых корней с использованием A. rhizogenes. Потребовалось около 5-6 недель от прививки семян ...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum at JoVE.com

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Описываем метод индуцирования волосатых корней агробактериями ризогенов-опосредованногопреобразования в тартарной гречке(Fagopyrum tataricum). Это может быть использовано для исследования функций генов и производства вторичных метаболитов в тартарной гречихе, быть принятым для любой генетической трансформации, или использоваться для других лекарственных растений после улучшения.

Индуцирование волосатых корней агробактериями rhizogenes- Посредника Преобразование в тартарной гречихе(Фагопырум татарикум)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Используя этот протокол, мы впервые продемонстрируем шаг за шагом процесс индуцирования волосатых корней в тартари гречневой крупе. Этот метод является простым и недорогим для начала геномики и микробиомики для тартари гречихи и других растений. Хотя этот подробный метод настроен для тартари гречихи, он может быть применен к другим растениям дикот с некоторыми изменениями.Хотя этот метод прост в работе, он имеет много подробных шагов. Визуальная демонстрация может помочь исследователям достичь более эффективной индукции волосатого корня. Демонстрацией процедуры будет Гуантао Цянь, студент магистратуры из моей лаборатории.Начните с выбора пухлые и неповрежденные семена гречихи тартар и замачивания семян в 28 градусов по Цельсию воды в течение примерно 20 минут. Когда семенной слой можно легко удалить, поместите от 100 до 200 очищенных семян в стерилизованную 100 миллилитровую коническую колбу, содержащую 75% этанола в течение 30 секунд. В конце стерилизации замените этанол 5%-ным гипохлоритом натрия.Через 15 минут, декант гипохлорита натрия и мыть семена стерильной деионизированной водой пять раз. Затем промокнете семена сухими с куском стерильной бибуховой бумаги. Чтобы получить саженцы тартари гречихи, добавьте 10 семян на бутылку в отдельные 300 миллилитров растительных тканей культуры бутылки, содержащие 50 миллилитров MSSA среды.Затем прорастают семена в комнате культуры на 25, плюс-минус 1, градусов по Цельсию в условиях света. Через 7-10 дней выберите крепкие саженцы с двумя кусочками развернутого котилендона и вырежьте саженцы из корней. Поместите рассаду в стерильную чашку Петри и разрежьте гипокотилы на сегменты от 0,8 до 1 сантиметра.Чисто cotyledons в приблизительно части 0.5 сантиметра и pre-культура приводящ к explants под светлыми условиями на 24 часа. На следующий день перенесите экспланты в стерилизованную 100-миллилитровую коническую колбу. Чтобы активировать A.rhizogenes, оттепель культуры на льду, прежде чем равномерно покрытие бактерий на YEB твердой среде с антибиотиками для 12 до 16 часов инкубации при 28 градусов по Цельсию.На следующее утро, выбрать моноклональной колонии для культуры в новом чашке Петри, как только что продемонстрировали. После еще 12 до 16 часов инкубации, привить в результате моноклональных колоний в стерилизованной 100 миллилитров конической колбы, содержащей 20 миллилитров YEB твердой среды с антибиотиками при 28 градусов по Цельсию и 200 оборотов в минуту в течение 16 до 18 часов, пока оптическая плотность на 600 достигает 2,0. Затем перенесите 2-4% культуры бактериальных клеток в новую коническую колбу на 100 миллилитров, содержащую 20 миллилитров свежей твердой среды YEB с антибиотиками при 28 градусах Цельсия и 200 оборотов в минуту в течение 4-5 часов, пока оптическая плотность на 600 нанометров не достигнет примерно 0,5.Чтобы вызвать трансформацию волосистого корня, перенесите культуру A.rhizogenes в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку и соберите бактерии путем центрифугации. Переусердуйте гранулы в среде MSSAS до оптической плотности примерно 0,2 и влить суспензию в колбу эксплантов. Через 10 минут, удалить explants из колбы и пятно их с куском стерильной библионной бумаги.Затем поместите стерильный 9-сантиметровый кусок фильтровальной бумаги на блюдо msSAAS среды и наложить explants на фильтровальную бумагу в течение трех дней инкубации при 25 градусов по Цельсию в темноте. В конце инкубации перенесите около 20 зараженных эксплантов на средний MSSACK и вертикально инкубировать растения в условиях света при температуре 25, плюс-минус 1, градусов по Цельсию. После 10 до 14 дней культуры, выберите волосатые корни, демонстрирующие белый вид и быстрый рост и разрезать корни на два-три сантиметра штук.Очевидно, номер корни на чистой скамейке. Субкультура корневых кусочков в стерилизованной 100 миллилитровой конической колбе, содержащей MSSK среды при 25 градусов по Цельсию и 80 оборотов в минуту в темноте, пока они не перехлебнулись до нижней части колбы. Чтобы определить волосатые корни, удалить любые рыжие и загрязненные волосатые корни и выбрать те, с белым внешним видом.Если был использован ген репортера, проверьте корни на флуоресценцию под синим или легким двойным ультрафиолетовым трансилюминатором и выберите волосатые корни, которые демонстрируют сильный флуоресцентный сигнал. Затем высушите корни абсорбющей бумагой и заверните их в маркированную алюминиевую фольгу для немедленного анализа. Для длительного хранения, лиофилизируют корни в жидком азоте и место корни на минус 80 градусов по Цельсию до их исследования.После генетической трансформации и культуры, как попродемонстрировано, волосатые корни будут проявлять пушистый белый цвет и плагиотропной манере в ране сайтов explants и образуют высоко разветвленной и взаимосвязанной матрицы. Ген репортера может быть использован для облегчения дифференциации трансгенных волосатых корней под синим или легким двойным ультрафиолетовым трансиллюминацией, или для идентификации целевого гена интереса. Здесь показано относительное выражение светового транскрипционные факторы в трансгенных линиях тартарных гречневых волосатых корней.Примечательно, что биосинтез рутина и кверцетина также пропагандируется на метаболическом уровне в ответ на индуцированное фактор транскрипции переэкспрессии. Кроме того, относительная экспрессия генов пути синтеза флавеноидов во всех трех трансгенных линиях на удивление выше, чем в контрольной группе, что свидетельствует об успешной трансформации волосатого корня в тартарных эксплантах гречихи. То есть инфекция семян, отбор эксплантов и концентрация бактерий напрямую влияют на успех волосатой индукции корня.Мы можем оценить экспрессию генов, белок ДНК, или белковые реакции или массовое производство вторичных метаболитов для изучения транскрипционные регуляции вторичных метаболитов. Инженерные бактерии опасны для человека и его окружения. Позаботьтесь, чтобы справиться, работать, и распоряжаться бактериями должным образом.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

В Ситу маркировки репликации митохондриальной ДНК в Drosophila взрослых яичников с помощью EDU Окрашивание

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Быстрое удаление продукта в грибах через<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованное преобразование конструкций удаления ОСКАР

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Картирование генома всей доступной хроматина в основной человеческий Т-лимфоцитов, ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Роста и Agrobacterium опосредованной цветочно цинкования трансформации Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Преобразование, редактирование генома и фенотипирование азота фиксации тропических каннабацеи Дерево Параспония andersonii

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...