Name: inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por los Fondos Fundamentales de Investigación para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público ZXKT17002.

La TB utilizada en este estudio fue nombrada como BT18, que se originó a partir de la raza de "JinQiao No.2" cultivada por el Centro de Investigación de Pequeño Grano Varios de la Academia Shanxi de Ciencias Agrícolas. Los pasos primarios de este protocolo se ilustran en el cuadro 1.
NOTA: Operar la manipulación relacionada con explantes rápidamente, y cuando sea posible, mantener los platos Petri cerrados para evitar marchitamientos y contaminación. A meno...

La tuberculosis se ha utilizado en varios estudios relacionados con metabolitos secundarios a niveles genéticos y metabólicos1,2,5,27,28. El cultivo de raíces peludas, como fuente única para la producción de metabolitos, desempeña un papel fundamental en la ingeniería metabólica29 y se puede utilizar para alterar las vías metab...

Tartary sarraceno (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) es un tipo de dicotiledón perteneciente al género Fagopyrum y la familia Polygonaceae1. Como un tipo de alimento homóloga de la medicina china, la tuberculosis ha estado recibiendo un interés considerable debido a su composición química distintiva y diversas bioactividades contra las enfermedades. La tuberculosis es principalmente rica en carbohidratos, proteínas, vitaminas y carotenoides, así como en polifenoles como ácidos fenólicos y flavonoides1. Varias actividades biológicas y farmacológicas de flavonoides, incluyendo antioxidante, antihipertensivo2, y antiinflamatorias, así como propiedades anticancerígenas y antidiabéticas, se han demostrado3.
Agrobacterium rhizogenes es una bacteria del suelo que contribuye al desarrollo de la enfermedad de las raíces peludas en varias plantas superiores, especialmente dicotiledos, infectando los sitios de la herida4,,5. Este proceso se inicia mediante la transferencia del ADN-T en el plásmido de inducción de raíces (Ri)5,6 y se acompaña comúnmente de la integración y expresión de un gen exógeno del plásmido Ri y los pasos subsiguientes de generación del fenotipo de raíz peluda7. A. rhizogenes-raíces vellosas transgénicas mediadas, como una poderosa herramienta en el campo de la biotecnología vegetal, han sido más ampliamente utilizados debido a su estable y alta productividad y fácil obtención en un corto período de tiempo. Por otra parte, raíces peludas inducidas por A. rizogenes se distinguen eficientemente por su desarrollo de raíz plagiotrópica y crecimiento altamente ramificado en un medio libre de hormonas8. Se pueden utilizar en varios campos de investigación, incluyendo la producción artificial de semillas, investigación de nódulos de raíz, y en el estudio de las interacciones con otros organismos como hongos micorrizas, nematodos, y patógenos de la raíz7,9. Además, los cultivos de transformación de raíces peludas se han utilizado ampliamente como un sistema experimental para investigar las vías bioquímicas y la señalización química y para producir metabolitos secundarios vegetales que se utilizan como productos farmacéuticos, cosméticos y aditivos alimentarios8,,10. Los valiosos metabolitos secundarios, incluyendo alcaloides indólicos, aconitas, alcaloides tropano, terpenoides y flavonoides, sintetizados en raíces peludas de tipo salvaje se han investigado durante varias décadas en numerosas especies, como el ginsenoside en Panax ginseng11,coumarine en Ammi majus12,y compuestos fenólicos en TB2,,13.
Raíces peludas se han producido utilizando A. rizogenes en 79 especies de plantas de 27 familias14. Por ejemplo, A. rhizogenes-transformación de raíz peluda mediada se ha divulgado en soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, y achicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb transformación de raíz peluda también se ha investigado2. Pocos protocolos detallados están disponibles con respecto al desarrollo de raíces peludas mediadas por A. rhizogenes ya sea que lleven un vector binario o no. Por ejemplo, Sandra et al.21 introdujeron un método para producir raíces peludas de papa transgénicas sostenidas en brotes de tipo salvaje. Las raíces peludas completamente desarrolladas podrían visualizarse 5-6 semanas después de la inyección de A. rizogenes llevando el gen del reportero de gus en los internodos del tallo de las plantas de papa. Otro estudio también había reportado un sistema radicular peludo transgénico inducido por A. rhizogenes albergando el gen reportero gusA en yute (Corchorus capsularis L.) 22.23 obtuvieron raíces peludas de tabaco transgénica utilizando A. rhizogenes transformados con la expresión vector pBI121 que transporta el gen del ácido1tetrahidrocannabinólico (THCA) para producir THCA.
Sin embargo, un proceso paso a paso para una generación efectiva de transformación de la raíz peluda, especialmente en la tuberculosis, ha sido relativamente menos demostrado. En este estudio, hemos descrito un protocolo detallado utilizando A. rhizogenes que llevan el gen reportero (GFP), un marcador selectivo (Kan), y un gen de interés (b4, un gen identificado de nuestro grupo pero inédito de la familia básica helix-loop-helix(bHLH)) para generar transformación genética de raíz peluda en TB. El experimento duró 5-6 semanas, desde la inoculación de semillas hasta la generación de raíces peludas, que involucraron la preparación de explantas, infección, cocultura, subcultura ción y posterior propagación. Además, A. rhizogenes que contiene un plásmido binario que transporta el transgén de tuberculosis del factor de transcripción de mieloblastosis 116 (FtMYB116) se utilizó para determinar si FtMYB116 puede promover la acumulación de flavonoides, particularmente la rutina, en la tuberculosis a nivel genético y metabólico a través de la transformación de la raíz peluda de TB. FtMYB116, que es un factor transcripcional inducido por la luz, regula la síntesis de rutina en diferentes condiciones de luz5. La calcocona sintasa (CHS), la flavanona-3-hidroxilasa (F3H), el flavonoide-3'-hidroxilasa (F3'H) y la flavonol sintasa (FLS)24 son enzimas clave implicadas en la vía metabólica de la biosíntesis de rutina. Por lo tanto, este estudio demuestra la sobreexpresión de FtMYB116 en raíces peludas de tuberculosis y la expresión de genes clave de enzimas, así como el contenido de rutina y otros flavonoides como la quercetina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2*Taq PCR MasterMix</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>PC0901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems 2720 thermo cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, US</td>
			<td>A37834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>A8110</td>
			<td>Diluted in DMSO, 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>binary vectors</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>/</td>
			<td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime,sodium</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>C8240</td>
			<td>Diluted in Water, 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF15RXII high-speed micro</td>
			<td>Hitachi, Japan</td>
			<td>No. 90560201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diposable Petri-dish</td>
			<td>Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C electrophoresis apparatus</td>
			<td>Bjliuyi, Beijing China</td>
			<td>ECS002301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYspin Plus Plant RNA Kit</td>
			<td>Aidlab, China</td>
			<td>RN38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA purelab untra bioscience</td>
			<td>ELGA LabWater, UK</td>
			<td>82665JK1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>biotek, US</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway BP/LR reaction enzyme</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td>
			<td>11789100/11791110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYG-C multiple-function shaker</td>
			<td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kan</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>K8020</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLS-3750 Autoclave sterilizer</td>
			<td>Sanyo, Japan</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS salts with vitamins</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>M8521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals unstated</td>
			<td>Beijing Chemical Works, China</td>
			<td></td>
			<td>ethanol, mercury bichloride, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHS-3C pH meter</td>
			<td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td>
			<td>a008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Genomic DNA Kit</td>
			<td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td>
			<td>DP305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>R8010</td>
			<td>Diluted in DMSO, 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8040</td>
			<td>Diluted in Water, 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>S8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech, Beijing, China</td>
			<td>BM101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman diameter 9 cm Filter paper</td>
			<td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract powder</td>
			<td>Solarbio Life Science, Beijing, China</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing hairy roots by agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in tartary buckwheat (fagopyrum tataricum)

El trigo sarraceno taráfilo (TB)[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] posee diversas actividades biológicas y farmacológicas porque contiene abundantes metabolitos secundarios como flavonoides, especialmente rutinarina. Agrobacterium rhizogenes se han utilizado gradualmente en todo el mundo para inducir raíces peludas en plantas medicinales para investigar las funciones genéticas y aumentar el rendimiento de metabolitos secundarios. En este estudio, hemos descrito un método detallado para generar a. rizogenes-raíces peludas mediadas en la tuberculosis. Los cotiledons y el eje hipocotiledónider a los 7-10 días fueron seleccionados como explantas e infectados con A. rizogenes llevando un vector binario, que indujo raíces peludas aventureras que aparecieron después de 1 semana. La transformación de la raíz peluda generada se identificó en función de la morfología, la selección de resistencia (kanamicina) y la expresión génica del reportero (proteína fluorescente verde). Posteriormente, las raíces peludas transformadas se autopropagaron según sea necesario. Mientras tanto, un factor de transcripción de mieloblastosis (MYB), FtMYB116,se transformó en el genoma de la tuberculosis utilizando las raíces pellizudas mediadas por A. rhizogenespara verificar el papel de FtMYB116 en la síntesis de flavonoides. Los resultados mostraron que la expresión de genes relacionados con el flavonoide y el rendimiento de los compuestos flavonoides (rutina y quercetina) fueron significativamente (p < 0.01) promovidos por FtMYB116,lo que indica que las raíces peludas mediadas por A. rhizogenespueden utilizarse como una herramienta alternativa eficaz para investigar las funciones génicas y la producción de metabolitos secundarios. El protocolo detallado paso a paso descrito en este estudio para generar raíces peludas puede ser adoptado para cualquier transformación genética u otras plantas medicinales después del ajuste.

Agrobacterium rhizogenes-mediación de la transformación de la raíz peluda de la tuberculosis Este estudio describe el protocolo paso a paso que se estableció para obtener raíces peludas transformadas genéticamente utilizando A. rhizogenes. Tomó aproximadamente 5-6 semanas desde la inoculación de semillas de tuberculosis hasta la cosecha de las raíces peludas identificadas, y algunos pasos clave se representan en la Figura 1 (A-H...

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Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

Describimos un método de inducir raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-transformación mediada en trigo sarraceno tartá ) (Fagopyrum tataricum). Esto se puede utilizar para investigar las funciones genéticas y la producción de metabolitos secundarios en el trigo sarraceno tártaro, ser adoptado para cualquier transformación genética, o utilizado para otras plantas medicinales después de la mejora.

Inducción de raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformación mediada en trigo sarracenotataricum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Usando este protocolo, demostraremos el proceso paso a paso para inducir raíces peludas en trigo sarraceno tartar por primera vez. Esta técnica es fácil y económica para empezar a genómica y microbiomómica para el trigo sarraceno tartar y otras plantas. Aunque este método detallado está configurado para el trigo sarraceno tartar, se puede aplicar a otras plantas de dicot con algunas modificaciones.Aunque este método es fácil de realizar, tiene muchos pasos detallados. La demostración visual puede ayudar a los investigadores a lograr una inducción de raíz peluda más eficiente. Demostrar el procedimiento será Guangtao Qian, un estudiante de maestría de mi laboratorio.Comience seleccionando semillas de trigo sarraceno regordetas y sin daños y remojando las semillas en agua de 28 grados Celsius durante aproximadamente 20 minutos. Cuando la capa de semilla se pueda quitar fácilmente, coloque de 100 a 200 semillas peladas en un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros que contenga 75% de etanol durante 30 segundos. Al final de la esterilización, reemplace el etanol con 5%hipoclorito sódico.Después de 15 minutos, decantar el hipoclorito de sodio y lavar las semillas con agua desionizada estéril cinco veces. Luego seque las semillas con un pedazo de papel bibulous estéril. Para obtener plántulas de trigo sarraceno tartar, agregue 10 semillas por botella a botellas individuales de cultivo de tejido vegetal de 300 mililitros que contengan 50 mililitros de medio MSSA.Luego, germinar las semillas en una sala de cultivo a 25, más o menos 1, grados Celsius en condiciones de luz. Después de 7 a 10 días, seleccione plántulas robustas con dos piezas de cotiledones desplegados y corte las plántulas de las raíces. Coloque las plántulas en un plato de petri estéril y corte los hipocotilos en segmentos de 0,8 a 1 centímetro.Estriden los cotiledones en trozos de aproximadamente 0,5 centímetros y precultivo los explantes resultantes en condiciones de luz durante 24 horas. Al día siguiente, transfiera los explants a un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros. Para activar A.rhizogenes, descongele el cultivo sobre hielo antes de encojerar uniformemente las bacterias en un medio sólido YEB con antibióticos durante una incubación de 12 a 16 horas a 28 grados centígrados.A la mañana siguiente, elige una colonia monoclonal para el cultivo en un nuevo plato de petri como acabamos de demostrar. Después de otra incubación de 12 a 16 horas, inocular las colonias monoclonales resultantes en un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros que contiene 20 mililitros de medio sólido YEB con antibióticos a 28 grados Celsius y 200 revoluciones por minuto durante 16 a 18 horas hasta que la densidad óptica a 600 alcance 2.0. A continuación, transfiera entre el 2 y el 4% del cultivo celular bacteriano a un nuevo matraz cónico de 100 mililitros que contenga 20 mililitros de medio sólido YEB fresco con antibióticos a 28 grados celsius y 200 revoluciones por minuto durante 4 a 5 horas hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance aproximadamente 0,5.Para inducir la transformación de la raíz peluda, transferir el cultivo de A.rhizogenes a un tubo cónico estéril de 50 mililitros y recoger las bacterias por centrifugación. Resuspender el pellet en medio MSSAS a una densidad óptica de aproximadamente 0,2 e infundir la suspensión en el matraz de explantas. Después de 10 minutos, retire los explantes del matraz y sople con un pedazo de papel bibulous estéril.A continuación, coloque un pedazo estéril de papel de filtro de 9 centímetros de diámetro en un plato de medio MSSAAS y superponga los explantes en el papel de filtro para una incubación de tres días a 25 grados celsius en la oscuridad. Al final de la incubación, transfiera aproximadamente 20 explantes infectados al medio MSSACK e incubar verticalmente las plantas en condiciones de luz a 25, más o menos 1 grados Centígrados. Después de 10 a 14 días de cultivo, seleccione las raíces peludas que demuestran un aspecto blanco y un crecimiento rápido y corte las raíces en piezas de dos a tres centímetros.Numera claramente las raíces en un banco limpio. Subcultivo de las piezas de raíz en un matraz cónico esterilizado de 100 mililitros que contiene medio MSSK a 25 grados Celsius y 80 revoluciones por minuto en la oscuridad hasta que se generalizaron en exceso hasta que se generalizaron en el fondo del matraz. Para identificar las raíces peludas, retire las raíces peludas leonadas y contaminadas y seleccione aquellas con un aspecto blanco.Si se utilizó un gen reportero, compruebe las raíces en busca de fluorescencia bajo un transilumumina ultra violeta doble azul o claro y seleccione las raíces peludas que exhiben una señal fluorescente fuerte. A continuación, seque las raíces con papel absorbente y envuélvalas en papel de aluminio marcado para su análisis inmediato. Para el almacenamiento a largo plazo, liofilizar las raíces en nitrógeno líquido y colocar las raíces en menos 80 grados Celsius hasta su investigación.Después de la transformación genética y el cultivo, como se demostró, las raíces peludas exhibirán un color blanco esponjoso y una manera plagiotrópica en los sitios de heridas de los explantes y formarán una matriz altamente ramificada y entrelazada. Un gen reportero se puede utilizar para facilitar la diferenciación de las raíces peludas transgénicas bajo una transiluminación ultravioleta dual azul o ligera, o la identificación de un gen objetivo de interés. Aquí, se muestra la expresión relativa de un factor de transcripción inducido por la luz en las líneas transgénicas de las raíces peludas de trigo sarraceno tartar.En particular, la biosíntesis de la rutina y la quercetina también se promueven a nivel metabólico en respuesta a la sobreexpresión del factor de transcripción inducida. Además, la expresión génica relativa de los genes de la vía de síntesis de flavenoides en las tres líneas transgénicas, son notablemente más altas que las medidas en el grupo de control, lo que indica una transformación de raíz peluda exitosa en explantes de trigo sarraceno tartar. Es decir, la infección de las semillas, la selección de los explantes, y la concentración de las bacterias afectan directamente el éxito de la inducción de la raíz peluda.Podemos evaluar la expresión génica, las reacciones de proteínas de ADN o proteínas o la producción en masa de metabolitos secundarios para estudiar los metabolitos secundarios de la regulación transcripcional. Las bacterias diseñadas son peligrosas para los humanos y su medio ambiente. Tenga cuidado de manejar, operar y desechar las bacterias correctamente.

Research

JoVE Journal

Genetics

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