Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل ERC-STG-2015-680242.
ويعترف المؤلفون أيضا بدعم مركز تكنيون المتكامل للسرطان( TICC)؛ معهد راسل بيري للتكنولوجيا النانوية؛ مركز لوري لوكي متعدد التخصصات لعلوم الحياة والهندسة؛ وزارة الاقتصاد الإسرائيلية لمنحة كامين (52752)؛ وزارة تكنولوجيا العلوم والفضاء الإسرائيلية - مكتب كبير العلماء (3-11878)؛ المؤسسة الإسرائيلية للعلوم (1778/13، 1421/17)؛ الجمعية الإسرائيلية للسرطان (2015-0116)؛ المؤسسة الألمانية الإسرائيلية للبحث العلمي والتطوير من أجل منحة من شركة GIF Young (I-2328-1139.10/2012)؛ برنامج الاتحاد الأوروبي FP-7 IRG لمنحة الاندماج الوظيفي (908049)؛ منحة مركز أبحاث فوسفوليبيد؛ (أ) مؤسسة روزنبلات لبحوث السرطان، منحة مؤسسة الأسرة في مالات؛ ومؤسسة عائلة (أونغر) أ. شرودر يعترف زمالتي ألون وتاوب. O. Adir يعترف زمالات شيرمان وغوتويرث. ز. تشين يعترف زمالة شيرمان. ن. كرينسكي يعترف البارونة أريان دي روتشيلد برنامج الدكتوراه النسائية من مؤسسة روتشيلد قيصرية.

ملاحظة: يتم تقديم توضيح بروتوكول إنتاج الخلايا الاصطناعية الكاملة في الشكل 1. وفقا لاحتياجات المستخدم، يمكن أيضا أن يتم التعبير البروتين (القسم 3.2) وتشكيل الخلايا الاصطناعية (القسم 4) أجزاء من البروتوكول بشكل مستقل (مع بعض التعديلات).
1. إعداد S30-T7 lysate
<ol><li>لوحة...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes.">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li><li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Inside+Liposomes:+From+Early+Studies+to+Current+Protocols.">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li><li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine.">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1,6-bisphosphate+as+an+energy+source.">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells:+a+review.">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells.">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li><li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+by+directed+evolution.">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion.">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li><li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=While-you-wait+proteins?+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need.">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors.">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).</li><li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system.">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li><li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models.">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li><li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip.">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447 (2016).</li><li>Go&#776;pfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells.">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li><li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins.">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).</li><li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+(1,3)-beta-d-glucan+(curdlan)+synthase:+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs.">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li><li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein:+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes.">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry.">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li><li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li><li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis.">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).</li><li>P&#233;delacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وبأسعار معقولة لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين. تعتمد غلة الخلايا النشطة على التنفيذ الدقيق والدقيق للبروتوكول مع التركيز على العديد من الخطوات الحاسمة. في قسم إعداد الليكل من هذه الطريقة ، من الضروري الوصول إلى كثافة البكتيريا ?...

الخلايا الاصطناعية هي جزيئات تشبه الخلايا الاصطناعية ، تحاكي وظيفة واحدة أو متعددة للخلية الحية ، مثل القدرة على الانقسام ، وتشكيل تفاعلات الغشاء ، وتوليف البروتينات استنادًا إلى رمز وراثي1،2،3. تمتلك الخلايا الاصطناعية التي تُغلف أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) وحدات عالية بسبب قدرتها على إنتاج بروتينات مختلفة وتسلسلات الحمض النووي الريبي بعد التعديلات في قالب الحمض النووي. تقديم بديل جذاب للنهج الحالية لإنتاج البروتين، وتستند أنظمة CFPS على تحلل الخلايا، والمكونات النقية، أو المكونات الاصطناعية وتشمل جميع آلات النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين مثل الريبوسوم، البوليميراز الحمض النووي الريبي، الأحماض الأمينية ومصادر الطاقة (على سبيل المثال، 3-phosphoglycerate والغدينين ثلاثي الفوسفات)4،,5،,6،,7،,8،,9. تغليف نظام CFPS داخل الحويصلات الدهنية تمكن من إنتاج بسيط وفعال من البروتينات دون الاعتماد على الخلية الحية10. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا المنبر تخليق الببتيدات التي قد تتحلل داخل الخلايا الطبيعية، وإنتاج البروتينات السامة للخلايا الحية، وتعديل البروتينات مع الأحماض الأمينية غير الطبيعية11،12. وقد استخدمت الخلايا الاصطناعية كنموذج لأغراض البحث التحقيق في الحد الأدنى من مكونات الخلية المطلوبة لتمكين الحياة الخلوية من منظور تطوري1,13. كما استخدمت الخلايا الاصطناعية لبناء وتنفيذ الدائرة الوراثية وكنماذج للتطور الموجه14،15،16. وقد ركزت دراسات أخرى على قدرة الخلايا الاصطناعية على تقليد النشاط البيولوجي للخلايا الطبيعية، تهدف إلى استبدال الخلايا الطبيعية التالفة، مثل خلايا بيتا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري17. وعلاوة على ذلك، فإن قدرة هذه الخلايا الاصطناعية CFPS تغليف لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات العلاجية يوضح قدرتها على أن تدمج في الاستخدام السريري18.
هنا نصف بروتوكول المختبر من أسفل إلى أعلى على نطاق(الشكل 1)لإنتاج الحمض النووي الريبي والخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين على أساس نظام CFPS مغلفة في الحويصلات الدهنية. وهذا يدل على الاستخدام المحتمل لمنصات الخلايا الاصطناعية كأنظمة جديدة لتوصيل الأدوية لإنتاج المخدرات البروتينية العلاجية في الجسم الحي19في الموقع. وقد بحثت الدراسات السابقة الأمثل من رد فعل CFPS وعمليات إعداد الخلية lysate4،8،20. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق العديد من التقنيات لإعداد الدهون بحجم الخلية، مثل أساليب تثبيت قطرات الدم الدقيقة والبوليمر21،22،23، والتي تختلف أيضًا في تكوين الدهون الدهنية24،25،26. في البروتوكول المعروض ، يتم إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت ويتم عملية التغليف في درجات حرارة منخفضة (<4 °C)5،10،24،27،28. وقد وجد أن هذه الظروف المعتدلة مواتية للاحتفاظ بالسلامة الحيوية الوظيفية للآلات الجزيئية ، وهي الريبوسوم والبروتينات27،29،30. يتكون تكوين الدهون من الجسيمات من كل من الكوليسترول و1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). تم العثور على الأول في جميع أغشية خلايا الثدييات وهو ضروري للاستقرار والصلابة والحد من نفاذية الغشاء ، ويحاكي هذا الأخير تكوين فوسفوليبيد الثدييات11،13. يتم استخراج النسخ الخلوي والآلات الجزيئية الترجمة من سلالة BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) ، والتي يتم تحويلها مع pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase لزيادة قوة CFPS وتخليق البروتين. وقد استخدم هذا النظام لإنتاج البروتينات التشخيصية والعلاجية، مع الأوزان الجزيئية تصل إلى 66 كيلو في المختبر وفي الجسم الحي19،,31. يوفر البروتوكول التالي طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج نظام الخلايا الاصطناعية ، والتي يمكن أن تعالج مجموعة واسعة من الأسئلة الأساسية المرتبطة بتخليق البروتين في الطبيعة ويمكن استخدامها أيضًا في تطبيقات تسليم الأدوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

نهج التجميع من أسفل إلى أعلى لبناء الخلايا الاصطناعية هو أداة فعالة لعزل والتحقيق في العمليات الخلوية في بيئة تحاكي الخلية. وعلاوة على ذلك، أظهر تطوير أنظمة التعبير الخالية من الخلايا القدرة على إعادة إنتاج البروتين والنسخ وعمليات الترجمة (DNA→RNA→protein) بطريقة خاضعة للرقابة، مما يسخّر البيولوجيا التركيبية. هنا نصف بروتوكول لإعداد نظام التعبير خالية من الخلايا، بما في ذلك إنتاج تحلل البكتيريا قوية وتغليف هذا تحلل داخل الغنية بالدهون الغنية بالدهون الحويصلات يونيلاميلار (GUVs) (أي liposomes مستقرة)، لتشكيل الخلايا الاصطناعية. ويصف البروتوكول طرق إعداد مكونات الخلايا الاصطناعية بما في ذلك إنتاج الخلايا البكتيرية النشطة، يليها إعداد مفصل للخلايا الاصطناعية خطوة بخطوة على أساس طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت. هذه تسهل إنتاج الملايين من الخلايا الاصطناعية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة مع براعة عالية لإنتاج أنواع مختلفة من البروتينات. يمكن استخدام الخلايا الاصطناعية التي تم الحصول عليها للتحقيق في إنتاج البروتين / الحمض النووي الريبي والنشاط في بيئة معزولة ، في تطور موجه ، وكذلك كمنصة تسليم الأدوية الخاضعة للرقابة لإنتاج البروتينات العلاجية عند الطلب داخل الجسم.

نحن نقدم بروتوكوللإعداد الخلايا الاصطناعية عن طريق تغليف نظام S30-T7 CFPS على أساس BL21 E. القولونية داخل الحويصلات الدهنية. ويرد في الشكل 2وصف تخطيطي لعملية الإعداد يتضمن صورة لكل مرحلة . يعتمد نجاح عملية إعداد الخلايا الاصطناعية على الأداء المناسب لكل مرحلة ويتأثر بمعلمات ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

يصف هذا البروتوكول الطريقة والمواد والمعدات والخطوات اللازمة لإعداد الحمض النووي الريبي والبروتين يُنتج الخلايا الاصطناعية من أسفل إلى أعلى. تحتوي المقصورة المائية الداخلية للخلايا الاصطناعية على تحلل اتبكي S30 مغلف داخل طبقة ثنائية من الدهون (أي الليبوزومات المستقرة) ، وذلك باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت.

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية توفر منصة متعددة لدراسة أصول الحياة، فضلا عن العلاجات الاصطناعية القائمة على الخلايا للتسليم الدوائي المتقدمة. هذه الطريقة بسيطة وبأسعار معقولة لرنا والتعبير البروتين ويمكن تطبيقها على إنتاج البروتين العلاجي في الموقع مباشرة داخل الجسم. ويمكن استخدام هذه الأنظمة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض من أمراض التمثيل الغذائي وبدائل البروتين إلى السرطان وربما مرض السكري.يحتوي هذا البروتوكول متعدد الخطوات على نقطة إيقاف معرّفة. عند تنفيذها لأول مرة ، يوصى بتقسيم العمل على عدة أيام. بروتوكول لإنتاج الخلايا الاصطناعية يبدأ مع إعداد الخلية الخالية من S30-T7 lysate.بعد ذلك، يتم إعداد الدهون الغشاء والمحلول الغذائي الخلوي لمحاكاة البيئة الداخلية ودعم إنتاج البروتين. الخطوة الأخيرة هي إعداد الخلايا الاصطناعية نفسها. إعداد الثقافات بداية مكررة في 100 ملليلتر قارورة Erlenmeyer.إلى كل قارورة، إضافة خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام LB تكمل مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين وتطعيم مع مستعمرة الإشريكية القولونية واحدة. تنمو الثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة الكلمة شاكر في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. المقبل, إعداد اثنين لتر حيرة قارورة Erlenmeyer التي تحتوي على 500 ملليلتر من وسائل الإعلام السل تكمل مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من أمبيسيلين.تلقيح كل قارورة لترين مع ثقافة بداية خمسة ملليلتر. ضع القارورة في شاكر عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. مراقبة الثقافات بشكل دوري باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتنمو الثقافات حتى OD600 بين 0.8 وواحد.للحث T7 RNA RNA التعبير البوليميراز، إضافة إلى كل قارورة ثلاثة ملليلتر من 100 ملليمولار IPTG للوصول إلى 0.6 ملليمولار. مواصلة نمو الثقافات حتى OD600 هو ما يقرب من أربعة. بعد أن تصل الثقافات إلى الكثافة البصرية المطلوبة، قم بنقل التعليق من كل قارورة إرلينماير إلى أنبوبين للطرد المركزي معقمة 250 ملليلتر.أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 7،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل المُندفع. Resuspend كل بيليه في 250 ملليلتر من S30 الباردة lysate العازلة باستخدام مُحرك إذا رغبت في ذلك.جهاز طرد مركزي في 7،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل عظمى وإعادة تعليق جميع الكريات معا في 15 ملليلتر من S30 الباردة العازلة lysate. تصفية التعليق باستخدام منصات الشاش.قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، precool النصائح في 1.5 قوارير ملليلتر التي ستكون هناك حاجة لتخزين lysate. التجانس تعليق مرتين. استخدام ضغط العمل من 15،000 PSI مع ضغط الهواء من أربعة شريط لكسر الخلية.جمع التجانس. إضافة 100 ميكرولتر من 0.1 داتر مول لكل 10 ملليلتر من تعليق متجانسة. الطرد المركزي تعليق في 24،700 مرات ز في 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.ويصنف كل من DTT والكلوروفورم على أن هما مهيجين وضارين، ولذلك ينبغي التعامل مع كل من هذه المواد بعناية. يجب استخدام الكلوروفورم المستخدم لاحقًا في البروتوكول في منطقة مع استخراج الدخان. للحفاظ على نشاط lysate، قم بتنفيذ الخطوة بسرعة.ضع 200 ميكرولتر aliquots من اغرات في قارورة ما قبل التبريد وال المفاجئة تجميدها على الفور مع النيتروجين السائل. تخزين قارورة في درجة مئوية سلبية 80 لاستخدامها في المستقبل. بشكل منفصل حل POPC والكوليسترول في كل من الكلوروفورم إلى تركيز نهائي من 100 ملليغرام لكل ملليلتر.دوامة كل قارورة على حدة. الجمع بين المكونات في قارورة زجاجية مليلتر اثنين. إضافة 50 ميكرولترات من محلول الكوليسترول الكلوروفورم، 50 ميكرولترات من حل الكلوروفورم POPC، و 500 ميكرولترات من الزيوت المعدنية.دوامة القارورة، ثم لتبخر الكلوروفورم، تسخينه لمدة ساعة واحدة في 80 درجة مئوية في غطاء محرك السيارة الكيميائية. قبل البدء في مرحلة إنتاج الخلايا الاصطناعية، قم بإعداد حلول التغذية الخارجية، و ما قبل الداخلية، كما هو موضح في المخطوطة. ثم ضع 1.2 ملليلتر من المحلول الخارجي في أنبوب 15 ملليلتر وأضف ببطء طبقة من 500 ميكرولترات من محلول الدهون في الزيت من قارورة الزجاج الأولى.احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. لوضع اللمسات الأخيرة على إعداد الحل الداخلي، مزيج على الجليد إلى حجم النهائي من 100 ميكرولترات بإضافة S30-T7 lysate والحمض النووي plasmid. إضافة 100 ميكرولترات من المحلول الداخلي مع lysate وplsmid إلى الثانية اثنين من المليلتر الزجاج قارورة مع 500 ميكرولترات من الدهون في حل النفط.الماصة صعودا وهبوطا بقوة لمدة دقيقة واحدة ثم دوامة لمدة دقيقة أخرى على المستوى الخامس. بعد احتضان المستحلب الناتج لمدة 10 دقائق على الجليد المسحوق ، أضف ببطء المستحلب على قمة مرحلة الزيت في أنبوب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقائق في 100 مرة ز وأربع درجات مئوية.ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 400 مرة ز وأربع درجات مئوية. بحلول نهاية الطرد المركزي ، يجب أن تكون الكريه ملحوظة في الجزء السفلي من الأنبوب. لاستخراج بيليه، أولا إزالة طبقة النفط الزائدة.بعد ذلك، قم بتحميل طرف ماصة مشذبة مع حوالي 400 ميكرولترات من المحلول الخارجي واستخدم طرف الماصات لجمع البيليت، والإفراج عن الحل الخارجي مع مرور طرف الماصات عبر مرحلة النفط. مسح تلميح ماصة ونقل بيليه إلى أنبوب 1.5 ملليلتر نظيفة. الطرد المركزي بيليه لمدة 10 دقائق في 1،000 مرات ز وأربع درجات مئوية.إزالة عظمى و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من محلول التغذية. للتعبير عن البروتين، احتضان تعليق لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية دون اهتزاز. Plasmids التعبير عن البروتين النموذجي sfGFP ورينيلا luciferase أدخلت في تخليق البروتين خالية من الخلايا, ردود الفعل السائبة CFPS, والخلايا الاصطناعية.تم تقييم إنتاج البروتين باستخدام عدة طرق. كشف تحليل البقعة الغربية sfGFP His6 الإنتاج في كل من ردود الفعل السائبة CFPS وداخل الخلايا الاصطناعية. تم استخدام sfGFP تنقية His6 كتحكم إيجابي.مجهر الفلورسنت مع برايتفيلد ومرشح GFP تظهر الخلايا الاصطناعية التي تنتج sfGFP. تم استخدام عملية استئصال الخلايا في التدفق لتحليل إنتاج الخلايا الاصطناعية sfGFP. واستند حساب مجموعة الخلايا الاصطناعية النشطة إلى عتبة كثافة الفلورية sfGFP التي تحددها عينة الحمض النووي السلبية التي يمثلها الرسم البياني الأحمر.تم حساب متوسط كثافة الفلوراس من sfGFP إنتاج الخلايا الاصطناعية من السكان الخلايا الاصطناعية النشطة وتطبيعها إلى عينة الحمض النووي السلبية. تم حساب توزيعات القطر للخلايا الاصطناعية النشطة على أساس إشارة sfGFP. تم قياس نشاط رينيلا لوسيفيراز كمياً بقياسات الإنارة.هذه الطريقة هي تنوعا للغاية ويمكن تحسينها للبروتينات المستهدفة المختلفة عن طريق تغيير الأصل lysate, تكوين الدهون وتركيزات الحل الداخلي. ويمكن إجراء تحليل FACS للخلايا الاصطناعية التي تنتج بروتيناً للعلامة الفلورية لتوفير القيمة الكمية لجزء الخلايا الاصطناعية النشطة. تحليل البقعة الغربية من شأنه أن يقيس إنتاج البروتين.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

ضعف مستحلب الجيل باستخدام Polydimethylsiloxane (PDMS) المشارك المحوري تدفق التركيز الأجهزة

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

تسليم العلاجية سيرنا إلى الجهاز العصبي المركزي عن طريق الموجبة وأنيوني الليبوزومات

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

توصيف النشاط الحيوي للأنسجة لينة الإنسان عن طريق المسافة البادئة واختبار الشد

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

باستخدام البيولوجيا الاصطناعية إلى المهندس الخلايا الحية تتفاعل مع المواد القابلة للبرمجة

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

متحكم يعمل الجهاز لتوليد السائل مقتطفات من الهباء الجوي السجائر الإلكترونية ودخان السجائر التقليدية

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

الخلية الحرة "استخدام تعبير البروتين" "سرعة نمو بكتيريا" الضمة ناتريجينس

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

في فيسيكولو التوليف من السلائف غشاء الببتيد لنمو الحويصلة المستقلة

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...