Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af ERC-STG-2015-680242.
Forfatterne anerkender også støtte fra Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Lorry I. Lokey Tværfagligt Center for Biovidenskab og Teknik; det israelske økonomiministerium for et Kamin Grant (52752); Det Israelske Ministerium for Videnskabsteknologi og Rum – Chefforskerens Kontor (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israelske fond for videnskabelig forskning og udvikling af et GIF-tilskud (I-2328-1139.10/2012); Den Europæiske Unions FP-7 IRG-program for et karriereintegrationsstipendium (908049) Phospholipid Forskningscenter Grant; en Rosenblatt Foundation for kræftforskning, en Mallat Family Foundation Grant; og Unger Family Foundation. A. Schroeder anerkender Alon og Taub Stipendier. O. Adir anerkender Sherman og Gutwirth stipendier. G. Chen anerkender Sherman Fellowship. N. Krinsky anerkender baronesse Ariane de Rothschild Kvinder Ph.d.-program fra Rothschild Caesarea Foundation.

BEMÆRK: Illustration af hele produktionsprotokollen for syntetiske celler er vist i figur 1. Ifølge brugerens behov kan proteinekspressionen (afsnit 3.2) og de syntetiske celledannelsesdele (afsnit 4) dele af protokollen også udføres uafhængigt (med visse tilpasninger).
1. Forberedelse af S30-T7 lysate
<ol><li>Stribeplade E. coli BL21(DE3) bakterier omdannet med T7 RNA polymerase udtrykker pAR1219 plasmid på en LB-agar plade suppleret med 50 μg/m...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes.">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li><li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Inside+Liposomes:+From+Early+Studies+to+Current+Protocols.">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li><li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine.">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1,6-bisphosphate+as+an+energy+source.">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells:+a+review.">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells.">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li><li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+by+directed+evolution.">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion.">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li><li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=While-you-wait+proteins?+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need.">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors.">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).</li><li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system.">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li><li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models.">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li><li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip.">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447 (2016).</li><li>Go&#776;pfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells.">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li><li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins.">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).</li><li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+(1,3)-beta-d-glucan+(curdlan)+synthase:+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs.">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li><li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein:+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes.">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry.">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li><li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li><li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis.">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).</li><li>P&#233;delacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

Denne protokol indfører en enkel og økonomisk overkommelig metode til produktion af store mængder proteinproducerende syntetiske celler. Udbyttet af aktive celler er afhængig af omhyggelig og præcis udførelse af protokollen med vægt på flere kritiske trin. I lysatpræparatdelen af denne metode er det vigtigt at nå den relevante bakterietæthed før cellelysis for at opnå en tilstrækkelig mængde proteiner i bakterielysatet. For det andet bør lysisprocessen udføres ved 4 °C, og lysatet nedfryses hurtigt med ...

Syntetiske celler er kunstige celle-lignende partikler, efterligne en eller flere funktioner i en levende celle, såsom evnen til at opdele, danne membran interaktioner, og syntetisere proteiner baseret på en genetisk kode1,2,3. Syntetiske celler, der omslutter cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS) har høj modularitet på grund af deres evne til at producere forskellige proteiner og RNA-sekvenser efter ændringer i DNA-skabelonen. Cfps-systemer, der udgør et attraktivt alternativ til de nuværende tilgange til proteinproduktion, er baseret på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og omfatter alle de transskriptions- og oversættelsesmaskiner, der kræves til proteinsyntese, såsom ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-phosphoglycerat og adenintrifosfat)4,5,6,7,8,9. Indkapslingen af et CFPS-system inde i lipidvesikler muliggør enkel og effektiv produktion af proteiner uden at være afhængig af en levende celle10. Desuden, denne platform tillader syntese af peptider, der kan nedbrydes inde i naturlige celler, produktion af proteiner, der er giftige for levende celler, og ændre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer11,12. Syntetiske celler er blevet anvendt som model til forskningsformål , der undersøger de minimale cellekomponenter , der er nødvendige for at muliggøre celleliv fra et evolutionært perspektiv1,13. Syntetiske celler er også blevet anvendt til at opbygge og implementere genetiske kredsløb og som modeller for styret evolution14,15,16. Andre undersøgelser har fokuseret på evne til syntetiske celler til at efterligne den biologiske aktivitet af naturlige celler, der sigter mod at erstatte beskadigede naturlige celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes17. Desuden illustrerer disse cfps' evne til at producere en række terapeutiske proteiner, at den ser ud til at kunne indarbejdes i klinisk anvendelse18.
Her beskriver vi en bottom-up lab-skala protokol (Figur 1) til produktion af RNA og proteinproducerende syntetiske celler baseret på et CFPS-system indkapslet i en lipidvesikel. Dette viser den potentielle brug af syntetiske celleplatforme som nye lægemiddelfremføringssystemer til onsite-produktion af et terapeutisk proteinlægemiddel in vivo19. Tidligere undersøgelser har undersøgt optimeringen af den fælles fiskeripolitiks reaktion og cellelysatforberedelsesprocesserne4,8,20. Desuden er der anvendt flere teknikker til cellestørrelse liposom præparat, såsom mikrofluidiske og polymer-baserede dråbe stabiliseringsmetoder21,22,23, som også adskiller sig i liposomer 'lipid sammensætning24,25,26. I den præsenterede protokol fremstilles syntetiske celler ved hjælp af en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode , og indkapslingsprocessen udføres ved lave temperaturer (<4 °C)5,10,24,27,28. Disse milde betingelser har vist sig at være gunstige for at bevare den biofunktionelle integritet af de molekylære maskiner, nemlig ribosomer og proteiner27,29,30. Partiklernes lipidsammensætning består af både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC). Den første findes i alle pattedyr cellemembraner og er afgørende for stabilitet, stivhed og permeabilitet reduktion af membranen, og sidstnævnte efterligner pattedyr fosfolipid sammensætning11,13. Den cellulære transskription og oversættelse molekylære maskiner udvindes fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som omdannes med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase at øge CFPS potens og proteinsyntese. Dette system er blevet anvendt til fremstilling af diagnostiske og terapeutiske proteiner med molekylvægt på op til 66 kDa in vitro og in vivo19,31. Følgende protokol giver en enkel og effektiv metode til produktion af det syntetiske cellesystem, som kan behandle en bred vifte af grundlæggende spørgsmål i forbindelse med proteinsyntese i naturen og kan også anvendes til lægemiddellevering applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

Bottom-up-samlingsmetoden til konstruktion af syntetiske celler er et effektivt værktøj til at isolere og undersøge cellulære processer i et celleefterlignende miljø. Desuden har udviklingen af cellefrie ekspressionssystemer vist evnen til at rekonstituere proteinproduktion, transskription og oversættelsesprocesser (DNA→RNA→protein) på en kontrolleret måde, der udnytter syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokol til fremstilling af en celle-frit udtryk system, herunder produktion af en potent bakteriel lysat og indkapsle dette lysat inde kolesterol-rige lipid-baserede kæmpe unilamellar vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), til at danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metoderne til fremstilling af komponenterne i de syntetiske celler, herunder produktion af aktive bakterielysater, efterfulgt af en detaljeret trinvis forberedelse af de syntetiske celler baseret på en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode. Disse letter produktionen af millioner af syntetiske celler på en enkel og overkommelig måde med en høj alsidighed til at producere forskellige typer af proteiner. De opnåede syntetiske celler kan bruges til at undersøge protein/RNA-produktion og -aktivitet i et isoleret miljø, i styret udvikling, og også som en kontrolleret lægemiddelleveringsplatform til on-demand produktion af terapeutiske proteiner inde i kroppen.

Vi præsenterer en protokol til fremstilling af syntetiske celler ved at indkapsle et S30-T7 CFPS-system baseret på BL21 E. coli inde i lipidvesikler. En skematisk beskrivelse af forberedelsesprocessen , der indeholder et billede af hvert trin, præsenteres i figur 2. Succesen af den syntetiske celleforberedelsesproces afhænger af, om hvert trin fungerer korrekt, og at de udføres af forskellige parametre. Protokollen bør tilpasses, så den tager højde for produktionen af et bes...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Denne protokol beskriver metode, materialer, udstyr og trin til bottom-up forberedelse af RNA og proteinproducerende syntetiske celler. Den indre vandige rum af de syntetiske celler indeholdt S30 bakterielle lysat indkapslet i en lipid tolags (dvs. stabile liposomer), ved hjælp af en vand-i-olie emulsion overførsel metode.

Forberedelse proteinproducerende syntetiske celler ved hjælp af cellefri bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsionoverførsel

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Proteinproducerende syntetiske celler tilbyder en alsidig platform til at studere livets oprindelse samt syntetiske cellebaserede behandlinger til avanceret lægemiddellevering. Denne metode er enkel og økonomisk overkommelig for RNA og proteinudtryk og kan anvendes til produktion af terapeutisk protein på stedet direkte inde i kroppen. Systemerne kan anvendes til behandling af en bred vifte af sygdomme fra metaboliske sygdomme og protein erstatninger til kræft og muligvis diabetes.Denne flertrinsprotokol har et defineret stoppested. Når du udfører det for første gang, anbefales det at opdele arbejdet over flere dage. Protokollen for fremstilling af syntetiske celler starter med udarbejdelsen af det cellefrie S30-T7-lysat.Dernæst er membranlipiderne og cellulære næringsstofopløsning klar til at simulere det indre miljø og støtte proteinproduktion. Det sidste skridt er fremstillingen af de syntetiske celler selv. Forbered dublerede starterkulturer i 100 milliliter Erlenmeyerkolber.Til hver kolbe tilsættes fem milliliter LB-medier suppleret med 50 mikrogram pr. milliliter ampicillin og inokuleres med en enkelt E.coli-koloni. Dyrk kulturen natten over i et gulv inkubator shaker på 250 rpm og 37 grader Celsius. Dernæst forberede to liter forvirret Erlenmeyer kolber, der indeholder 500 milliliter TB medier suppleret med 50 mikrogram pr. milliliter ampicillin.Inokuler hver to liters kolbe med en fem milliliter starterkultur. Kolber i en shaker ved 250 omdrejninger i minuttet og 37 grader Celsius. Overvåg kulturerne med jævne mellemrum ved hjælp af et spektrofotometer og dyrk kulturerne indtil OD600 mellem 0,8 og en.For at fremkalde T7 RNA polymerase udtryk, tilføje til hver kolbe tre milliliter af 100 millimolar IPTG at nå 0,6 millimolar. Fortsæt med at dyrke kulturerne indtil OD600 er ca. fire. Når kulturerne har nået den ønskede optiske tæthed, overføres suspensionen fra hver Erlenmeyerkolbe til to 250 milliliter steriliserede centrifugerør.Centrifuge rørene ved 7,000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten. Opslæm hver pellet i 250 milliliter kold S30 lysatbuffer ved hjælp af en omrører, hvis det ønskes.Centrifuge ved 7,000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten og opslæmp alle pellets sammen i 15 milliliter kold S30 lysatbuffer. Suspensionen filtreres med gazepuder.Før du går videre til næste trin, forkøl spidserne i 1,5 milliliter hætteglas, der vil være nødvendige for opbevaring af lysatet. Homogeniser suspensionen to gange. Brug et arbejdstryk på 15.000 PSI med et lufttryk på fire bar til cellebrud.Saml homogenate. Der tilsættes 100 mikroliter på 0,1 molar DTT pr. 10 milliliter homogeniseret suspension. Centrifuge suspensionen ved 24, 700 gange g ved 30 minutter ved fire grader Celsius.DTT og chloroform klassificeres som irriterende og skadelige og bør derfor behandles med forsigtighed. Chloroform, der anvendes senere i protokollen, skal anvendes i et område med røgekstraktion. Udfør trinnet hurtigt for at bevare lysataktiviteten.Placer 200 mikroliter aliquots af supernatant i forkølede hætteglas og straks snap fryse dem med flydende nitrogen. Opbevar hætteglassene ved negative 80 grader Celsius til fremtidig brug. Separat opløse POPC og kolesterol i chloroform hver til en endelig koncentration på 100 mg pr. milliliter.Vortex hvert hætteglas separat. Kombiner komponenterne i et glasglas med to milliliterglas. Der tilsættes 50 mikroliter af kolesterolchloroformopløsningen, 50 mikroliter af POPC-chloroformopløsningen og 500 mikroliter mineralsk olie.Vortex hætteglasset, derefter at fordampe chloroform, varme det i omkring en time ved 80 grader Celsius i en kemisk hætte. Før du starter den syntetiske celleproduktionsfase, skal du forberede de ydre, præinderindinderings- og fodringsløsninger som beskrevet i manuskriptet. Derefter anbringes 1,2 milliliter af den ydre opløsning i et 15 milliliterrør, og der tilsættes langsomt et lag 500 mikroliter lipider i olieopløsning fra det første glashætteglas.Rørt inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. For at færdiggøre den indre opløsning forberedelse, bland på is til et endeligt volumen på 100 mikroliter ved at tilføje S30-T7 lysate og DNA plasmid. Der tilsættes 100 mikroliter af den indre opløsning med lysat og plasmid til det andet glashætteglas med to milliliterglas med 500 mikroliter lipider i olieopløsning.Pipette op og ned kraftigt i et minut og derefter vortex i endnu et minut på niveau fem. Efter inkubation af den resulterende emulsion i 10 minutter på knust is tilsættes emulsionen langsomt oven på oliefasen i 15 milliliterrøret. Centrifuge røret i 10 minutter ved 100 gange g og fire grader Celsius.Derefter centrifuge i 10 minutter ved 400 gange g og fire grader Celsius. Ved centrifugerings ende skal der observeres en pellet i bunden af røret. For at udtrække pellet, først fjerne den overskydende olie lag.Dernæst indlæses en trimmet pipettespids med ca. 400 mikroliter af ydre opløsning, og brug pipettespidsen til at opsamle pelletsen, hvilket frigiver den ydre opløsning, når pipettespidsen passerer gennem oliefasen. Tør pipettespidsen af og overfør pellet til et rent 1,5 milliliterrør. Centrifuge pellet i 10 minutter ved 1, 000 gange g og fire grader Celsius.Fjern supernatanten og opsplit pellet i 100 mikroliter af fodring opløsning. For proteinudtryk inkuberes suspensionen i to timer ved 37 grader Celsius uden at ryste. Plasmider udtrykke model protein sfGFP og Renilla luciferase blev indført i celle-fri proteinsyntese, CFPS bulk reaktioner, og syntetiske celler.Proteinproduktionen blev evalueret ved hjælp af flere metoder. Western blot analyse opdaget sfGFP His6 produktion i både CFPS bulk reaktioner og inde i syntetiske celler. Renset sfGFP His6 blev brugt som en positiv kontrol.Et fluorescerende mikroskop med et Brightfield- og et GFP-filter viser syntetiske celler, der producerer sfGFP. Flow cytometri blev brugt til at analysere sfGFP producerer syntetiske celler. Beregningen af den aktive bestand af syntetiske celler var baseret på den sfGFP-fluorescensintensitetstærskel, der blev defineret af den negative DNA-prøve, der repræsenteres af det røde histogram.Den gennemsnitlige fluorescensintensitet for sfGFP, der producerer syntetiske celler, blev beregnet ud fra den aktive syntetiske cellepopulation og normaliseret til den negative DNA-prøve. Diameterfordelingen af de aktive syntetiske celler blev beregnet på grundlag af sfGFP-signalet. Renilla luciferase aktivitet blev kvantificeret med luminescens målinger.Denne metode er meget alsidig og kan optimeres til forskellige målproteiner ved at ændre lysatoprindelse, lipidsammensætning og indre opløsningskoncentrationer. FACS analyse af syntetiske celler, der producerer en fluorescerende markør protein kunne udføres for at give kvantitativ værdi af den brøkdel af aktive syntetiske celler. Western blot analyse ville måle proteinproduktion.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Dobbelt Emulsion Generation Ved hjælp af en Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering af terapeutisk siRNA til CNS Brug kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomekanisk karakterisering af menneskelige bløddele Brug Indrykning og trækprøvning

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Brug Syntetisk Biologi Engineer levende celler der Grænseflade med Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv Generation og redigering af Feeder-gratis IPSCs fra pancreas celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En Microcontroller drives enhed for Generation af flydende ekstrakter fra konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Forberedelse, rensning og brug af fedtsyre-holdige Liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Celle-fri Protein udtryk ved hjælp af hurtigt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo-syntesen af Peptidmembranprækursorer til autonom vesikel vækst

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...