Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von ERC-STG-2015-680242 unterstützt.
Die Autoren würdigen auch die Unterstützung des Technion Integrated Cancer Center (TICC); das Russell Berrie Nanotechnology Institute; das Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; das israelische Wirtschaftsministerium für einen Kamin-Zuschuss (52752); das israelische Ministerium für Wissenschaftstechnologie und Raumfahrt – Büro des Chefwissenschaftlers (3-11878); die Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); der Israel Cancer Association (2015-0116); die Deutsch-Israelische Stiftung für wissenschaftliche Forschung und Entwicklung für ein GIF-Young-Stipendium (I-2328-1139.10/2012); das FP-7 IRG-Programm der Europäischen Union für einen Stipendien für die berufliche Eingliederung (908049); das Phospholipid Research Center Grant; eine Rosenblatt Foundation for Cancer Research, ein Mallat Family Foundation Grant; und der Familienstiftung Unger. A. Schroeder würdigt Alon und Taub Fellowships. O. Adir würdigt die Sherman- und Gutwirth-Stipendien. G. Chen erkennt die Sherman Fellowship an. N. Krinsky würdigt das Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program der Rothschild Caesarea Foundation.

ANMERKUNG: Abbildung des vollständigen Produktionsprotokolls der synthetischen Zellen ist in Abbildung 1dargestellt. Je nach Bedarf des Anwenders können die Proteinexpression (Abschnitt 3.2) und die synthetische Zellbildung (Abschnitt 4) Teile des Protokolls auch unabhängig (mit einigen Anpassungen) durchgeführt werden.
1. Herstellung von S30-T7-Lysat
<ol><li>Streifenplatte die E. coli BL21(DE3) Bakterien transformiert mit der T7 RNA Polymerase exze...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes.">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li><li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Inside+Liposomes:+From+Early+Studies+to+Current+Protocols.">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li><li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine.">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1,6-bisphosphate+as+an+energy+source.">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells:+a+review.">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells.">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li><li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+by+directed+evolution.">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion.">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li><li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=While-you-wait+proteins?+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need.">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors.">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).</li><li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system.">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li><li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models.">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li><li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip.">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447 (2016).</li><li>Go&#776;pfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells.">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li><li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins.">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).</li><li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+(1,3)-beta-d-glucan+(curdlan)+synthase:+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs.">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li><li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein:+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes.">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry.">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li><li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li><li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis.">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).</li><li>P&#233;delacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

Mit diesem Protokoll wird eine einfache und erschwingliche Methode zur Herstellung großer Mengen proteinproduzierender synthetischer Zellen eingeführt. Die Ausbeute aktiver Zellen hängt von einer sorgfältigen und genauen Ausführung des Protokolls ab, wobei der Schwerpunkt auf mehreren kritischen Schritten liegt. Im Lysatpräparat dieser Methode ist es wichtig, die entsprechende Bakteriendichte vor der Zelllyse zu erreichen, um eine ausreichende Menge an Proteinen im bakteriellen Lysat zu erreichen. Zweitens sollte d...

Synthetische Zellen sind künstliche zellähnliche Teilchen, die eine oder mehrere Funktionen einer lebenden Zelle imitieren, wie z. B. die Fähigkeit, zu teilen, Membraninteraktionen zu bilden und Proteine basierend auf einem genetischen Code1,2,3zu synthetisieren. Synthetische Zellen, die zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) umschließen, besitzen eine hohe Modularität aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene Proteine und RNA-Sequenzen nach Veränderungen in der DNA-Vorlage zu produzieren. Als attraktive Alternative zu den aktuellen Ansätzen der Proteinproduktion basieren CFPS-Systeme auf Zelllysat, gereinigten Komponenten oder synthetischen Komponenten und umfassen alle Transkriptions- und Übersetzungsmaschinen, die für die Proteinsynthese erforderlich sind, wie Ribosomen, RNA-Polymerase, Aminosäuren und Energiequellen (z. B. 3-Phosphoglycerat und Adenintriphosphat)8,4,5,6,7,9. Die Verkapselung eines CFPS-Systems in Lipidbläschen ermöglicht die einfache und effiziente Produktion von Proteinen, ohne von einer lebenden Zelle abhängig zu sein10. Darüber hinaus ermöglicht diese Plattform die Synthese von Peptiden, die in natürlichen Zellen abbauen können, Produktion von Proteinen, die toxisch für lebende Zellen sind, und modifizieren Proteine mit nicht-natürlichen Aminosäuren11,12. Synthetische Zellen wurden als Modell für Forschungszwecke verwendet, um die minimalen Zellkomponenten zu untersuchen, die erforderlich sind, um das zelluläre Leben aus evolutionärer Perspektive zu ermöglichen1,13. Synthetische Zellen wurden auch verwendet, um genetische Schaltung zu bauen und zu implementieren und als Modelle für gerichtete Evolution14,15,16. Andere Studien konzentrierten sich auf die Fähigkeit synthetischer Zellen, die biologische Aktivität natürlicher Zellen nachzuahmen, mit dem Ziel, beschädigte natürliche Zellen zu ersetzen, wie Betazellen bei Patienten mit Diabetes17. Darüber hinaus veranschaulicht die Fähigkeit dieser CFPS, synthetische Zellen zu verkapseln, eine Vielzahl von therapeutischen Proteinen zu produzieren, ihr Potenzial, in den klinischen Einsatz integriert zu werden18.
Hier beschreiben wir ein Bottom-up-Labor-Skalenprotokoll (Abbildung 1) zur Herstellung von RNA- und Protein produzierenden synthetischen Zellen auf Basis eines CFPS-Systems, das in einem Lipidvesikel eingekapselt ist. Dies zeigt die mögliche Verwendung synthetischer Zellplattformen als neuartige Wirkstoffabgabesysteme für die Vor-Ort-Produktion eines therapeutischen Proteinmedikaments in vivo19. Frühere Studien haben die Optimierung der CFPS-Reaktion und der Zelllysatpräparationsprozesse4,8,20untersucht. Darüber hinaus wurden verschiedene Techniken für die zellgroße Liposomenpräparation angewendet, wie mikrofluidische und polymerbasierte Tröpfchenstabilisierungsmethoden21,22,23, die sich auch in der Lipidzusammensetzung der Liposomen24,25,26unterscheiden. Im vorgestellten Protokoll werden synthetische Zellen nach einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren hergestellt und der Verkapselungsprozess bei niedrigen Temperaturen (<4 °C)5,10,24,27,28durchgeführt. Diese milden Bedingungen haben sich als günstig für die Beibehaltung der biofunktionellen Integrität der molekularen Maschinerie erwiesen, nämlich Ribosomen und Proteine27,29,30. Die Lipidzusammensetzung der Partikel besteht sowohl aus Cholesterin als auch aus 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC). Die erste findet sich in allen Säugetierzellmembranen und ist wesentlich für die Stabilität, Steifigkeit und Durchlässigkeit der Membran, und letztere imitiert Säugetier Phospholipid Zusammensetzung11,13. Die zelluläre Transkription und Translation molekulare Maschinerie werden aus dem BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) Stamm extrahiert, der mit pAR1219 Plasmid überexzierende T7-RNA-Polymerase umgewandelt wird, um die CFPS-Potenz und Proteinsynthese zu erhöhen. Dieses System wurde zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Proteine mit Molekulargewichten von bis zu 66 kDa in vitro und in vivo19,31verwendet. Das folgende Protokoll bietet eine einfache und effektive Methode zur Herstellung des synthetischen Zellsystems, die eine Vielzahl grundlegender Fragen im Zusammenhang mit der Proteinsynthese in der Natur angehen und auch für Arzneimittelabgabeanwendungen eingesetzt werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

Der Bottom-up-Montageansatz für den Aufbau synthetischer Zellen ist ein effektives Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung zellulärer Prozesse in einer Zellimittierungsumgebung. Darüber hinaus hat die Entwicklung zellfreier Expressionssysteme die Fähigkeit gezeigt, die Proteinproduktions-, Transkriptions- und Translationsprozesse (DNA-RNA-Protein) kontrolliert zu rekonstituieren und dabei die synthetische Biologie zu nutzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Herstellung eines zellfreien Expressionssystems, einschließlich der Herstellung eines potenten bakteriellen Lysats und der Verkapselung dieses Lysats in cholesterinreichen Lipid-basierten Riesen-Unilamellar-Vesikeln (GUVs) (d.h. stabile Liposomen), um synthetische Zellen zu bilden. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur Herstellung der Komponenten der synthetischen Zellen einschließlich der Herstellung von aktiven bakteriellen Lysaten, gefolgt von einer detaillierten schrittweisen Vorbereitung der synthetischen Zellen auf der Grundlage eines Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahrens. Diese erleichtern die Produktion von Millionen synthetischer Zellen auf einfache und erschwingliche Weise mit einer hohen Vielseitigkeit für die Herstellung verschiedener Arten von Proteinen. Die erhaltenen synthetischen Zellen können verwendet werden, um die Protein-RNA-Produktion und -Aktivität in einer isolierten Umgebung zu untersuchen, in der gerichteten Evolution, und auch als kontrollierte Plattform für die Bereitstellung von Medikamenten für die On-Demand-Produktion von therapeutischen Proteinen im Körper.

Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung synthetischer Zellen, indem wir ein S30-T7 CFPS-System auf Basis von BL21 E. coli in Lipidbläschen verkapseln. Eine schematische Beschreibung des Vorbereitungsprozesses, die ein Bild der einzelnen Stufen enthält, ist in Abbildung 2dargestellt. Der Erfolg des synthetischen Zellvorbereitungsprozesses hängt von der entsprechenden Leistung der einzelnen Stufen ab und wird durch unterschiedliche Parameter bewirkt. Das Protokoll sollte an...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Protein produzierende synthetische Zellen bieten eine vielseitige Plattform, um die Ursprünge des Lebens zu untersuchen, sowie synthetische zellbasierte Therapien für die fortgeschrittene Medikamentenabgabe. Diese Methode ist einfach und erschwinglich für die RNA- und Proteinexpression und kann für die therapeutische Proteinproduktion vor Ort direkt im Körper angewendet werden. Die Systeme können zur Behandlung einer breiten Palette von Krankheiten verwendet werden, von Stoffwechselerkrankungen und Proteinersatz bis hin zu Krebs und möglicherweise Diabetes.Dieses mehrstufige Protokoll verfügt über einen definierten Stopppunkt. Bei der ersten Ausführung wird empfohlen, die Arbeit auf mehrere Tage aufzuteilen. Das Protokoll für die synthetische Zellproduktion beginnt mit der Herstellung des zellfreien S30-T7-Lysats.Als nächstes werden die Membranlipide und die zelluläre Nährstofflösung vorbereitet, um die innere Umgebung zu simulieren und die Proteinproduktion zu unterstützen. Der letzte Schritt ist die Herstellung der synthetischen Zellen selbst. Bereiten Sie doppelte Starterkulturen in 100 Milliliter Erlenmeyer-Flaschen vor.Zu jedem Kolben, fügen Sie fünf Milliliter LB-Medien mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und Inoculate mit einer einzigen E.coli-Kolonie ergänzt. Wachsen Sie die Kultur über Nacht in einem Boden-Inkubator-Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius. Als nächstes bereiten Sie zwei Liter verwirrte Erlenmeyer-Flaschen mit 500 Milliliter TB-Medien zu, ergänzt um 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.Impfen Sie jeden Zwei-Liter-Kolben mit einer Fünf-Milliliter-Starterkultur. Die Kolben bei 250 U/min und 37 Grad Celsius in einen Shaker geben. Überwachen Sie die Kulturen regelmäßig mit einem Spektralphotometer und wachsen Sie die Kulturen bis OD600 zwischen 0,8 und eins.Um die T7-RNA-Polymerase-Expression zu induzieren, fügen Sie jedem Kolben drei Milliliter 100 Millimolar IPTG hinzu, um 0,6 Millimolar zu erreichen. Die Kulturen werden weiter wachsen lassen, bis OD600 ungefähr vier Jahre alt ist. Nachdem die Kulturen die gewünschte optische Dichte erreicht haben, übertragen Sie die Suspension von jedem Erlenmeyerkolben in zwei 250 Milliliter sterilisierte Zentrifugenrohre.Zentrifugieren Sie die Rohre bei 7 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand. Jedes Pellet in 250 Milliliter kaltem S30-Lysatpuffer auf Wunsch mit einem Rührwerk aufheben.Zentrifuge bei 7 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie alle Pellets zusammen in 15 Milliliter kaltem S30-Lysatpuffer wieder auf. Filtern Sie die Aufhängung mit Gazepads.Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, kühlen Sie die Spitzen in 1,5 Milliliter-Fläschchen vor, die für die Lagerung des Lysats benötigt werden. Homogenisieren Sie die Aufhängung zweimal. Verwenden Sie einen Arbeitsdruck von 15.000 PSI mit einem Luftdruck von vier bar für Zellbruch.Sammeln Sie das Homogenat. 100 Mikroliter 0,1 Mol DTT pro 10 Milliliter der homogenisierten Suspension hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Federung bei 24, 700 mal g bei 30 Minuten bei vier Grad Celsius.DTT und Chloroform werden als reizend und schädlich eingestuft und sollten daher mit Vorsicht behandelt werden. Chloroform, das später im Protokoll verwendet wird, muss in einem Bereich mit Rauchabsaugung verwendet werden. Führen Sie den Schritt schnell aus, um die Lysataktivität beizubehalten.200 Mikroliter Aliquots überstand in vorgekühlte Fläschchen geben und sofort mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie die Fläschchen bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung auf. PopC und Cholesterin in Chloroform jeweils auf eine Endkonzentration von 100 Milligramm pro Milliliter auflösen.Wirbel jede Durchstechflasche separat. Kombinieren Sie die Komponenten in einer zwei Milliliter Glasdurchstechflasche. Fügen Sie 50 Mikroliter der Cholesterin-Chloroform-Lösung, 50 Mikroliter der POPC-Chloroform-Lösung und 500 Mikroliter Mineralöl hinzu.Wirbeln Sie die Durchstechflasche, dann die Chloroform zu verdampfen, erhitzen Sie es für etwa eine Stunde bei 80 Grad Celsius in einer chemischen Haube. Bevor Sie mit der Herstellung der synthetischen Zelle beginnen, bereiten Sie die äußeren, vor-inneren und Fütterungslösungen vor, wie im Manuskript beschrieben. Dann 1,2 Milliliter der äußeren Lösung in ein 15-Milliliter-Rohr geben und langsam eine Schicht von 500 Mikroliter Lipiden-in-Öl-Lösung aus der ersten Glasdurchstechflasche hinzufügen.Inkubieren Sie die Röhre bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Um die innere Lösungsvorbereitung fertigzustellen, mischen Sie auf Eis auf ein endgültiges Volumen von 100 Mikrolitern, indem Sie S30-T7-Lysat und DNA-Plasmid hinzufügen. 100 Mikroliter der inneren Lösung mit Lysat und Plasmid in die zweite Zwei-Milliliter-Glasdurchstechflasche mit 500 Mikroliter Lipid-in-Öl-Lösung geben.Pipette für eine Minute kräftig auf und ab und dann wirbelt für eine weitere Minute auf Stufe fünf. Nachdem Sie die resultierende Emulsion 10 Minuten lang auf zerkleinertem Eis inkubiert haben, fügen Sie die Emulsion langsam auf die Ölphase in die 15-Milliliter-Röhre ein. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 Minuten bei 100 mal g und vier Grad Celsius.Dann Zentrifuge für 10 Minuten bei 400 mal g und vier Grad Celsius. Am Ende der Zentrifugation sollte ein Pellet an der Unterseite des Rohres beobachtbar sein. Um das Pellet zu extrahieren, entfernen Sie zuerst die überschüssige Ölschicht.Als nächstes laden Sie eine getrimmte Pipettenspitze mit ca. 400 Mikroliter außen lösungsmittel und verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Pellet zu sammeln, wobei die äußere Lösung freisetzt wird, während die Pipettespitze die Ölphase durchläuft. Wischen Sie die Pipettenspitze ab und übertragen Sie das Pellet in ein sauberes 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Pellet für 10 Minuten bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter Futterlösung wieder auf. Für die Proteinexpression, inkubieren Sie die Suspension für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius ohne schütteln. Plasmide, die das Modell Protein sfGFP und Renilla luciferase exzessiieren, wurden in die zellfreie Proteinsynthese, CFPS-Massenreaktionen und synthetische Zellen eingeführt.Die Proteinproduktion wurde mit mehreren Methoden bewertet. Western Blot Analyse entdeckt sfGFP His6 Produktion in CFPS Bulk-Reaktionen und in synthetischen Zellen. Purified sfGFP His6 wurde als positiv erachtet.Ein Fluoreszenzmikroskop mit Brightfield und gfP-Filter zeigen synthetische Zellen, die sfGFP produzieren. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um sfGFP zu analysieren, die synthetische Zellen produzierten. Die Berechnung der aktiven synthetischen Zellpopulation basierte auf dem sfGFP-Fluoreszenzintensitätsschwellenwert, der durch die negative DNA-Probe definiert wurde, die durch das rote Histogramm dargestellt wird.Die mittlere Fluoreszenzintensität von sfGFP zur Herstellung synthetischer Zellen wurde aus der aktiven synthetischen Zellpopulation berechnet und zur negativen DNA-Probe normalisiert. Die Durchmesserverteilungen der aktiven synthetischen Zellen wurden auf Basis des sfGFP-Signals berechnet. Die Aktivität der Renilla-Luziferase wurde mit Lumineszenzmessungen quantifiziert.Diese Methode ist sehr vielseitig und kann für verschiedene Zielproteine optimiert werden, indem Lysatursprung, Lipidzusammensetzung und innere Lösungskonzentrationen verändert werden. FaCS-Analysen von synthetischen Zellen, die ein fluoreszierendes Markerprotein produzieren, könnten durchgeführt werden, um einen quantitativen Wert des Anteils aktiver synthetischer Zellen bereitzustellen. Die Western-Blot-Analyse würde die Proteinproduktion messen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Forschung

Biotechnik

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomechanische Charakterisierung humaner Weichgewebeproben mit Einrückungen und Zugprüfung

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Ein Mikrocontroller betrieben Gerät zur Erzeugung von flüssige Extrakte aus herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Zellfreien Protein Ausdruck mithilfe der rasch wachsenden Bakterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...