Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי ERC-STG-2015-680242.
המחברים גם מכירים בתמיכת מרכז הסרטן המשולב של הטכניון (TICC); מכון ראסל ברי לננוטכנולוגיה; המרכז הבינתחומי הראשי למדעי החיים & הנדסה; משרד הכלכלה הישראלי למענק כמאנה (52752); משרד המדע של הטכנולוגיה והחלל – משרד המדען הראשי (3-11878); הקרן הישראלית למדע (1778/13, 1421/17); האגודה הישראלית לסרטן (2015-0116); הקרן הגרמנית-ישראלית למחקר ופיתוח מדעי לגרנט הצעיר GIF (I-2328-1139.10/2012); האיחוד האירופי FP-7 IRG תוכנית עבור מענק אינטגרציה לקריירה (908049); מרכז המחקר פוספוליפיד מענק; קרן רוזנבלט לחקר הסרטן, מלגת קרן משפחת מאלון; וקרן משפחת אונגר. א. שרדר מכיר במלגות אלון וטאוב. א. אדיר מכיר במלגות שרמן וגוטוויה. ז. חן מכיר במלגת שרמן. נ. קרינסקי מכיר בתוכנית הדוקטורט לנשים ברונית אריאן דה רוטשילד מקרן רוטשילד בקיסריה.

הערה: האיור המלא של פרוטוקול הייצור של התאים הסינתטיים מוצג באיור 1. על פי צורכי המשתמש, ביטוי החלבון (סעיף 3.2) והיווצרות תאים סינתטיים (סעיף 4) חלקים מהפרוטוקול יכול להתבצע גם באופן עצמאי (עם כמה עיבודים).
1. הכנת S30-T7 ליפוסט
<ol><li>פס הצלחת ה -E. coli BL21 (DE3) חיידקי...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes.">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li><li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Inside+Liposomes:+From+Early+Studies+to+Current+Protocols.">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li><li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine.">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1,6-bisphosphate+as+an+energy+source.">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells:+a+review.">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells.">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li><li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+by+directed+evolution.">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion.">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li><li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=While-you-wait+proteins?+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need.">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors.">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).</li><li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system.">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li><li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models.">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li><li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip.">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447 (2016).</li><li>Go&#776;pfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells.">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li><li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins.">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).</li><li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+(1,3)-beta-d-glucan+(curdlan)+synthase:+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs.">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li><li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein:+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes.">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry.">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li><li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li><li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis.">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).</li><li>P&#233;delacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ובמחיר נוח לייצור כמויות גדולות של תאים סינתטיים המייצרים חלבונים. התשואה של תאים פעילים תלויה בביצוע קפדני ומדויק של הפרוטוקול עם דגש על מספר שלבים קריטיים. בסעיף ההכנה ליפוסט של שיטה זו, חיוני להגיע לצפיפות החיידקים המתאימה לפני הפירוק התאים כדי להשיג כמות מ?...

תאים סינתטיים הם חלקיקים כמו תא מלאכותי, מחקה פונקציות אחת או מרובות של תא חי, כגון היכולת לחלק, אינטראקציה ממברנה טופס, ולסנתז חלבונים על בסיס קוד גנטי1,2,3. תאים סינתטיים התוחמים את התאים ללא חלבון סינתזה (CFPS) מערכות בעלי מודולריות גבוהים בשל יכולתם לייצר חלבונים שונים רצפי RNA לאחר שינויים בתבנית ה-DNA. הצגת חלופה אטרקטיבית לגישות הנוכחיות של ייצור החלבון, מערכות cfps מבוססות על תאי ליפוסט, רכיבים מטוהרים או רכיבים סינתטיים וכוללים את כל מכונות התמלול והתרגום הדרושות לסינתזה חלבונים כגון ריבוזומים, RNA פולימראז, חומצות אמינו ומקורות אנרגיה (למשל, 3-פוספוליגליט ואדלין טריפוספט)4,5,6,7,8,9. האנקפסולציה של מערכת CFPS בתוך שלפוחיות השומנים מאפשר ייצור פשוט ויעיל של חלבונים ללא תלות תא חי10. יתר על כן, פלטפורמה זו מאפשרת סינתזה של פפטידים שעלולים לבזות בתוך תאים טבעיים, ייצור של חלבונים רעילים לתאים חיים, ולשנות חלבונים עם חומצות אמינו לא טבעיות11,12. תאים סינתטיים שימשו כמודל למטרות מחקר החוקרים את רכיבי התא המינימלי הנדרש כדי לאפשר את החיים הסלולריים מנקודת מבט אבולוציונית1,13. תאים סינתטיים גם שימשו כדי לבנות וליישם מעגל גנטי וכמודלים עבור אבולוציה מכוונת14,15,16. מחקרים אחרים התמקדו ביכולת של תאים סינתטיים לחקות את הפעילות הביולוגית של תאים טבעיים, במטרה להחליף תאים טבעיים פגומים, כגון תאים ביתא בחולים עם סוכרת17. יתר על כן, היכולת של אלה CFPS encapsulating תאים סינתטיים כדי לייצר מגוון של חלבונים טיפוליים ממחיש את הפוטנציאל שלה להיות שולבו לשימוש קליני18.
כאן אנו מתארים מלמטה-up פרוטוקול בקנה מידה (איור 1) לייצור של רנ א ו חלבון להפקת תאים סינתטיים מבוסס על מערכת cfps מקומסת ב vesicle השומנים. זה מראה את השימוש הפוטנציאלי של פלטפורמות תאים סינתטיים כמו מערכות משלוח התרופה הרומן לייצור באתר של תרופה לחלבון טיפולית ב vivo19. מחקרים קודמים חקרו את האופטימיזציה של התגובה cfps ואת תהליכי ההכנה של התא ליפוסט4,8,20. יתר על כן, טכניקות מספר הוחלו עבור ליפוכי תא בגודל הכנה, כגון microflu, מבוססי פולימר שיטות ייצוב מבוסס droplet21,22,23, אשר גם שונים ליפוזומים ' הרכב השומנים24,25,26. בפרוטוקול המוצג, תאים סינתטיים מיוצרים באמצעות שיטת העברת אמולסיה בשמן מים ותהליך עטיפת האנקפסולציה מבוצע בטמפרטורות נמוכות (< 4 ° c)5,10,24,27,28. תנאים אלה מתון נמצאו חיוביות עבור שמירה על היושרה הביו תפקודית של המכונות המולקולריות, כלומר ריבוזומים וחלבונים27,29,30. הרכב השומנים של החלקיקים מורכב הן של כולסטרול והן 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-לגליקו-3-פוספולולין (POPC). הראשון נמצא בכל ממברנות התא של היונקים, והוא חיוני עבור יציבות, קשיחות וחדירות הפחתת הקרום, ואת האחרון מחקה ממגלית פוספוליפיד הרכב11,13. תמלול ותרגום מכונות מולקולריות של הסלולר מופקים BL21 (DE3) es, מאמץ קולי (E. coli) זן, אשר הופך עם pAR1219 פלמביטוי יתר T7 RNA פולימראז כדי להגדיל את העוצמה cfps וסינתזה חלבון. מערכת זו שימש כדי לייצר חלבונים אבחון וטיפולי, עם משקולות מולקולרים של עד 66 kda ב מבחנה ב vivo19,31. הפרוטוקול הבא מספק שיטה פשוטה ואפקטיבית לייצור מערכת התאים הסינתטית, שיכולה לענות על מגוון רחב של שאלות עקרוניות הקשורות לסינתזה החלבונים בטבע ויכולה לשמש גם ליישומים של משלוחי סמים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

גישת ההרכבה מלמטה-למעלה לבניית תאים סינתטיים היא כלי יעיל לבידוד ולחקירת תהליכים סלולאריים בסביבה תא מחקה. יתר על כן, הפיתוח של מערכות ביטויים ללא תא הפגינו את היכולת ליצור מחדש את ייצור החלבון, שעתוק ותהליכי תרגום (DNA → RNA ← חלבון) באופן מבוקר, רתימת ביולוגיה סינתטית. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מערכת ביטוי ללא תא, כולל הייצור של ליפוסט בקטריאלי חזק ו encapsulating זה ליפוסט בתוך כולסטרול עשיר מבוסס השומנים ענק unilamellar שלפוחיות (GUVs) (כלומר, ליפוזומים יציבים), כדי ליצור תאים סינתטיים. הפרוטוקול מתאר את השיטות להכנת הרכיבים של התאים הסינתטיים, כולל ייצור ליטים חיידקיים פעילים, ואחריו הכנה מפורטת של שלב אחר שלב של התאים הסינתטיים המבוססים על שיטת העברת אמולסיה בשמן מים. אלה מקלים על ייצור מיליוני תאים סינתטיים באופן פשוט ובמחיר נוח עם רב-תכליתיות גבוהה להפקת סוגים שונים של חלבונים. התאים הסינתטיים המתקבלים ניתן להשתמש כדי לחקור את הייצור של חלבון/RNA ופעילות בסביבה מבודדת, האבולוציה מכוונת, וגם כפלטפורמת משלוח סמים מבוקרת לייצור על פי דרישה של חלבונים טיפוליים בתוך הגוף.

אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים סינתטיים על-ידי encapsulating S30-T7 CFPS מערכת מבוסס על BL21 E. coli בתוך שלפוחית השומנים. תיאור סכמטי של תהליך ההכנה הכולל תמונה של כל שלב מוצג באיור 2. הצלחת תהליך ההכנה של התא הסינתטי תלויה בביצועים המתאימים של כל שלב ומושפע מפרמטרים שונים. הפרוטוקול ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

חלבונים המייצרים תאים סינתטיים מציעים פלטפורמה רב-תכליתית לחקר מקורות החיים, כמו גם טיפולים סינתטיים מבוססי תאים לאספקת תרופות מתקדמות. שיטה זו היא פשוטה ובמחיר סביר עבור ביטוי RNA וחלבון והוא יכול להיות מיושם לייצור חלבון טיפולי באתר ישירות בתוך הגוף. המערכות יכולות לשמש לטיפול במגוון רחב של מחלות ממחלות מטבוליות והחלפת חלבונים לסרטן ואולי גם לסוכרת.פרוטוקול מרובה שלבים זה כולל נקודת עצירה מוגדרת. בעת ביצועו בפעם הראשונה, מומלץ לחלק את העבודה על פני מספר ימים. הפרוטוקול לייצור תאים סינתטיים מתחיל בהכנת ליססאט S30-T7 נטול תאים.לאחר מכן, השומנים הממברנה ותוכנון התזונתי התאי מוכנים לדמות את הסביבה הפנימית ולתמוך בייצור חלבונים. השלב האחרון הוא הכנת התאים הסינתטיים עצמם. הכינו תרבויות מתנע כפולות בבקבוקי ארלנפייר 100 מיליליטר.לכל בקבוקון, להוסיף חמישה מיליליטר של מדיה LB בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין לחסן עם מושבת E.coli אחת. לגדל את התרבות לילה בשייקר אינקובטור הרצפה ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להכין שני בקבוקים ארלנזיר מבולבל ליטר המכיל 500 מיליליטר של מדיה TB בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין.לחסן כל בקבוק שני ליטר עם תרבות המתנע חמישה מיליליטר. מניחים את הבקבוקים בשייקר ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס. לפקח על התרבויות מעת לעת באמצעות ספקטרופוטומטר ולהגדיל את התרבויות עד OD600 בין 0.8 ואחד.כדי לגרום לביטוי פולימראז T7 RNA, להוסיף לכל בקבוק שלושה מיליליטר של 100 מילימולר IPTG להגיע 0.6 מילימולר. המשך לגדל את התרבויות עד OD600 הוא כארבעה. לאחר שהתרבויות מגיעות לצפיפות האופטית הרצויה, מעבירים את ההשעיה מכל בקבוק ארלנפייר לשני צינורות צנטריפוגה מעוקרים 250 מיליליטר.צנטריפוגה הצינורות ב 7, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי. יש להשתמש שוב בכל גלולה ב-250 מיליליטר של חיץ ליזאט S30 קר באמצעות ערבוב במידת הרצוי.צנטריפוגה ב 7, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את כל הכדורים יחד ב-15 מיליליטר של חיץ ליאזט S30 קר. סנן את ההשעיה באמצעות רפידות גזה.לפני שתמשיך לשלב הבא, מראש את הטיפים 1.5 בקבוקונים מיליליטר כי יהיה צורך לאחסון lysate. הומוגניזציה של ההשעיה פעמיים. השתמש בלחץ עבודה של 15,000 PSI עם לחץ אוויר של ארבעה ברים לשבריג תאים.לאסוף את הומוגנית. הוסף 100 microliters של 0.1 DTT טוחן לכל 10 מיליליטר של ההשעיה הומוגנית. צנטריפוגה ההשעיה ב 24, 700 פעמים גרם ב 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.DTT וכלורופורם מסווגים כמרגיזים ומזיקים ולכן יש לטפל בהם בזהירות. כלורופורם המשמש מאוחר יותר בפרוטוקול חייב לשמש באזור עם מיצוי אדים. כדי לשמר את פעילות ה-lysate, בצע את השלב במהירות.מניחים 200 aliquots microliter של על טבעי בקבוקונים מקוררים מראש מיד לצלם להקפיא אותם עם חנקן נוזלי. לאחסן את הבקבוקונים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי לשימוש עתידי. בנפרד להמיס POPC וכולסטרול בכלורופורם כל לריכוז סופי של 100 מיליגרם למיליליטר.וורטקס כל בקבוקון בנפרד. שלב את הרכיבים בבקבוקון זכוכית שני מיליליטר. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תוסף הכולסטרול-כלורופורם, 50 מיקרוליטרים של פתרון POPC-כלורופורם ו-500 מיקרוליטרים של שמן מינרלי.מערבולת הבקבוקון, ואז כדי להתאדות את הכלורופורם, לחמם אותו במשך כשעה ב 80 מעלות צלזיוס במכסה המנוע כימי. לפני תחילת שלב ייצור התא הסינתטי, הכינו את הפתרונות החיצוניים, הקדם-פנימיים וההזנה כמתואר בכתב היד. לאחר מכן מניחים 1.2 מיליליטר של הפתרון החיצוני בצינור 15 מיליליטר לאט להוסיף שכבה של 500 microliters של שומנים בשמן פתרון מן בקבוקון הזכוכית הראשון.דגירה הצינור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. כדי לסיים את הכנת הפתרון הפנימי, יש לערבב על הקרח לנפח סופי של 100 מיקרוליטרים על-ידי הוספת ליאזט S30-T7 ופלסמיד DNA. הוסף 100 microliters של הפתרון הפנימי עם lysate ו plasmid לבקבוקון זכוכית שני מיליליטר השני עם 500 microliters של תמיסת שומנים בשמן.פיפטה למעלה ולמטה במרץ לדקה אחת ולאחר מכן מערבולת לדקה נוספת ברמה חמש. לאחר דגירה אמולסיה וכתוצאה מכך במשך 10 דקות על קרח כתוש, לאט להוסיף את אמולסיה על גבי שלב השמן בצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור במשך 10 דקות ב 100 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.ואז צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. עד סוף הצנטריפוגה, גלולה צריכה להיות ניתנת לצפייה בתחתית הצינור. כדי לחלץ את גלולה, תחילה להסיר את שכבת השמן העודף.לאחר מכן, לטעון קצה פיפטה גזוז עם כ 400 microliters של פתרון החיצוני ולהשתמש טיפ פיפטה כדי לאסוף את גלולה, שחרור הפתרון החיצוני כמו קצה פיפטה עובר דרך שלב השמן. לנגב את קצה פיפטה ולהעביר את גלולה לצינור נקי 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה גלולה במשך 10 דקות ב 1, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 100 microliters של פתרון האכלה. לביטוי חלבון, הדגירה את ההשעיה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. פלסמידים המבטאים את המודל חלבון sfGFP ורניה לוציפראז הוכנסו סינתזת חלבון ללא תאים, תגובות בתפזורת CFPS, ותאים סינתטיים.ייצור החלבון הוערך במספר שיטות. ניתוח כתם מערבי זיהה ייצור sfGFP His6 הן בתגובות בתפזורת CFPS והן בתוך תאים סינתטיים. SfGFP מטוהרים His6 שימש כבקרה חיובית.מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ברייטפילד ומסנן GFP מראים תאים סינתטיים המייצרים sfGFP. ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח sfGFP המייצר תאים סינתטיים. חישוב אוכלוסיית התאים הסינתטיים הפעילה התבסס על סף עוצמת הפלואורסצנטיות sfGFP שהוגדר על ידי דגימת ה- DNA השלילית המיוצגת על ידי ההיסטוגרמה האדומה.עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של sfGFP המייצרת תאים סינתטיים חושבה מאוכלוסיית התאים הסינתטיים הפעילה ונורמלה לדגימה השלילית של הדנ"א. התפלגות הקוטר של התאים הסינתטיים הפעילים חושבה בהתבסס על אות sfGFP. פעילות רנילה לוציפראז כומתה במדידות זוהרות.שיטה זו היא רב-תכליתית מאוד והוא יכול להיות אופטימיזציה עבור חלבונים היעד שונים על ידי שינוי מקור ליט, הרכב השומנים וריכוזי פתרון פנימי. ניתוח FACS של תאים סינתטיים המייצרים חלבון סמן פלואורסצנטי יכול להתבצע כדי לספק ערך כמותי של שבר של תאים סינתטיים פעילים. ניתוח כתם מערבי ימדד את ייצור החלבון.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

משלוח siRNA טיפולית על מערכת העצבים המרכזית באמצעות קטיוני anionic ליפוזומים

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

אפיון ביומכנית של רקמות רכות אדם באמצעות זחה ו מתיחת בדיקה

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

באמצעות ביולוגיה סינתטית מהנדס תאים חיים המתממשקות חומרים לתכנות

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

מיקרו-בקר המופעל התקן לדור של נוזלי תמציות קונבנציונאלי סיגריה סיגריה עשן ואלקטרוניקה תרסיס

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...