Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

इस काम को ईआरसी-एसटीजी-2015-680242 ने सपोर्ट किया।
लेखक भी टेक्नियन इंटीग्रेटेड कैंसर सेंटर (टीआईसीसी) के समर्थन को स्वीकार करते हैं; रसेल बेरी नैनोटेक्नोलॉजी संस्थान; लॉरी I. Lokey इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर लाइफ साइंसेज एंड इंजीनियरिंग; एक Kamin अनुदान (52752) के लिए इसराइल अर्थव्यवस्था मंत्रालय; इज़राइल विज्ञान प्रौद्योगिकी और अंतरिक्ष मंत्रालय - मुख्य वैज्ञानिक का कार्यालय (3-11878); इज़राइल साइंस फाउंडेशन (1778/13, 1421/17); इज़राइल कैंसर एसोसिएशन (2015-0116); एक GIF युवा अनुदान के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान और विकास के लिए जर्मन-इजरायल फाउंडेशन (I-2328-1139.10/2012); एक कैरियर एकीकरण अनुदान (908049) के लिए यूरोपीय संघ एफपी-7 IRG कार्यक्रम; फॉस्फोलिपिड रिसर्च सेंटर ग्रांट; कैंसर अनुसंधान के लिए एक Rosenblatt फाउंडेशन, एक मल्लात परिवार फाउंडेशन अनुदान; और Unger परिवार फाउंडेशन । ए श्रोडर एलोन और तौब फैलोशिप को स्वीकार करता है । ओ Adir शर्मन और Gutwirth फैलोशिप स्वीकार करते हैं । जी चेन शर्मन फैलोशिप को स्वीकार करते हैं । एन क्रिंस्की रोथस्चिल्ड सीजेरिया फाउंडेशन से बैरोनेस एरियाने डी रोथस्चिल्ड वुमन डॉक्टोरल प्रोग्राम को स्वीकार करते हैं ।

नोट: पूर्ण सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन प्रोटोकॉल का चित्रण चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है। उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार, प्रोटोकॉल के प्रोटीन अभिव्यक्ति (धारा 3.2) और सिंथेटिक सेल गठन (ध?...

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	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए एक सरल और सस्ती विधि का परिचय देता है। सक्रिय कोशिकाओं की उपज कई महत्वपूर्ण चरणों पर जोर देने के साथ प्रोटोकॉल के सावधा?...

सिंथेटिक कोशिकाएं कृत्रिम कोशिका की तरह कण हैं, जो जीवित कोशिका के एक या कई कार्यों की नकल करते हैं, जैसे कि आनुवंशिक कोड1,2,2,3के आधार पर विभाजित करने की क्षमता, झिल्ली इंटरैक्शन और संश्लेषित प्रोटीन। सिंथेटिक कोशिकाएं जो कोशिका-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रणालियों को संलग्न करती हैं, डीएनए टेम्पलेट में परिवर्तन के बाद विभिन्न प्रोटीन और आरएनए दृश्यों का उत्पादन करने की क्षमता के कारण उच्च मॉड्यूलरता होती हैं। प्रोटीन उत्पादन के वर्तमान दृष्टिकोणों के लिए एक आकर्षक विकल्प पेश करते हुए, सीएफपीएस सिस्टम सेल लाइसेट, शुद्ध घटकों या सिंथेटिक घटकों पर आधारित हैं और इसमें प्रोटीन संश्लेषण के लिए आवश्यक सभी प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी शामिल हैं जैसे राइबोसोम्स, आरएनए बहुलक, अमीनो एसिड और ऊर्जा स्रोत (जैसे, 3-फॉस्होग्लेरेट और एडेनिन,7,ट्रिप्होस्फेट)8,944,5,,6, लिपिड वेसिकल्स के अंदर सीएफपीएस प्रणाली का एनकैप्सुलेशन जीवित कोशिका10के आधार पर प्रोटीन के सरल और कुशल उत्पादन को सक्षम बनाता है । इसके अलावा, यह प्लेटफ़ॉर्म पेप्टाइड्स के संश्लेषण की अनुमति देता है जो प्राकृतिक कोशिकाओं के अंदर नीचा हो सकते हैं, प्रोटीन का उत्पादन जो जीवित कोशिकाओं के लिए जहरीले हैं, और गैर-प्राकृतिक अमीनो एसिड11,,12के साथ प्रोटीन को संशोधित करते हैं। सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग अनुसंधान उद्देश्यों के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया है जो सेलुलर जीवन को विकासवादी परिप्रेक्ष्यसे सक्षमबनाने के लिए आवश्यक न्यूनतम कोशिका घटकों की जांच करते हैं 1,13. सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग जेनेटिक सर्किट के निर्माण और कार्यान्वयन के लिए और निर्देशित विकास के लिए मॉडल के रूप में14,15,16के लिए भी किया गया है । अन्य अध्ययनों ने प्राकृतिक कोशिकाओं की जैविक गतिविधि की नकल करने के लिए सिंथेटिक कोशिकाओं की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसका उद्देश्य क्षतिग्रस्त प्राकृतिक कोशिकाओं को बदलना है, जैसे मधुमेह17के रोगियों में बीटा कोशिकाएं। इसके अलावा, इन सीएफपीएस की क्षमता सिंथेटिक कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए संलग्न करती है, जो नैदानिक उपयोग18में शामिल होने की क्षमता को दर्शाती है।
यहां हम एक लिपिड वेसिकल में समझाया एक CFPS प्रणाली के आधार पर आरएनए और प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक नीचे-अप प्रयोगशाला पैमाने पर प्रोटोकॉल(चित्रा 1)का वर्णन करते हैं । यह वीवो19में चिकित्सीय प्रोटीन दवा के ऑनसाइट उत्पादन के लिए उपन्यास दवा वितरण प्रणालियों के रूप में सिंथेटिक सेल प्लेटफार्मों के संभावित उपयोग को दर्शाता है । पिछले अध्ययनों ने सीएफपीएस प्रतिक्रिया के अनुकूलन और सेल लाइसेट तैयारीप्रक्रिया4,8,20की जांच की है । इसके अलावा, सेल के आकार के लिपोसोम तैयारी के लिए कई तकनीकें लागू की गई हैं, जैसे माइक्रोफ्लूइडिक और बहुलक आधारित ड्रॉपलेट स्थिरीकरण विधियां21,,22,,23,जो लिपोसोम्स लिपिड संरचना24,25,,26में भी भिन्न होती हैं।, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, सिंथेटिक कोशिकाओं को पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि का उपयोग करके उत्पादित किया जाता है और एन्कैप्सुलेशन प्रक्रिया कम तापमान (<4 डिग्री सेल्सियस)5,,10,24,,27,,28पर की जाती है।, ये हल्की परिस्थितियां आणविक मशीनरी की जैव-कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए अनुकूल पाई गई हैं, नामत राइबोसोम और प्रोटीन27,29,30। कणों की लिपिड संरचना में कोलेस्ट्रॉल और 1-पामोलिटोइल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (पीओसी) दोनों होते हैं। पहला सभी स्तनधारी कोशिका झिल्ली में पाया जाता है और झिल्ली की स्थिरता, कठोरता और परगम्यता में कमी के लिए आवश्यक है, और बाद में स्तनधारी फॉस्फोलिपिड संरचना11,,13की नकल करता है। सेलुलर ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद आणविक मशीनरी BL21 (DE3) एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई) तनाव से निकाली जाती है, जो CFPS शक्ति और प्रोटीन संश्लेषण को बढ़ाने के लिए PAR1219 प्लाज्मिड ओवरएक्सप्रेसिंग T7 आरएनए बहुलक के साथ बदल जाती है। इस प्रणाली का उपयोग नैदानिक और चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए किया गया है, जिसमें 66 केडीए इन विट्रो और वीवो19,,31तक का आणविक वजन है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सिंथेटिक सेल प्रणाली के उत्पादन के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करता है, जो प्रकृति में प्रोटीन संश्लेषण से जुड़े मौलिक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित कर सकता है और दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

सिंथेटिक कोशिकाओं के निर्माण के लिए बॉटम-अप असेंबली दृष्टिकोण एक सेल नकल करने वाले वातावरण में सेलुलर प्रक्रियाओं को अलग करने और जांच करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। इसके अलावा, सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों के विकास ने सिंथेटिक जीव विज्ञान का उपयोग करते हुए प्रोटीन उत्पादन, प्रतिलेखन और अनुवाद प्रक्रियाओं (डीएनए →आरएनए →प्रोटीन) का पुनर्गठन करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। यहां हम एक सेल-फ्री एक्सप्रेशन सिस्टम तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सिंथेटिक कोशिकाओं के गठन के लिए कोलेस्ट्रॉल से भरपूर लिपिड आधारित विशाल यूनिमेलर वेसिकल्स (जीयूवी) (यानी स्थिर लिपोसोम) के अंदर एक शक्तिशाली बैक्टीरियल लाइसेट का उत्पादन और इस लाइकोसेट को encapsulating शामिल है। प्रोटोकॉल सक्रिय बैक्टीरियल lysates के उत्पादन सहित सिंथेटिक कोशिकाओं के घटकों को तैयार करने के तरीकों का वर्णन करता है, जिसके बाद पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि के आधार पर सिंथेटिक कोशिकाओं की विस्तृत कदम-दर-कदम तैयारी की जाती है। ये विभिन्न प्रकार के प्रोटीन के उत्पादन के लिए उच्च बहुमुखी प्रतिभा के साथ सरल और किफायती तरीके से लाखों सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन की सुविधा प्रदान करते हैं। प्राप्त सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग एक अलग वातावरण में प्रोटीन/आरएनए उत्पादन और गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है, निर्देशित विकास में, और शरीर के अंदर चिकित्सीय प्रोटीन के ऑन-डिमांड उत्पादन के लिए एक नियंत्रित दवा वितरण मंच के रूप में भी ।

हम लिपिड वेसिकल्स के अंदर BL21 ई. कोलाई के आधार पर S30-T7 CFPS प्रणाली को समाप करसिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। तैयारी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध विवरण जिसमें प्रत्येक चरण की छव...

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Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

यह प्रोटोकॉल आरएनए और सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले प्रोटीन की बॉटम-अप तैयारी के लिए विधि, सामग्री, उपकरण और चरणों का वर्णन करता है। सिंथेटिक कोशिकाओं के आंतरिक जलीय डिब्बे में पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि का उपयोग करके एक लिपिड बाइलेयर (यानी, स्थिर लिपोसोम) के भीतर S30 बैक्टीरियल लाइसेट को समाहित किया गया था।

सेल फ्री बैक्टीरियल अर्क, लिपोसोम्स और इमल्शन ट्रांसफर का उपयोग करके प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन प्रोटीन उन्नत दवा वितरण के लिए जीवन की उत्पत्ति के साथ-साथ सिंथेटिक सेल आधारित उपचारों का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करता है। यह विधि आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सरल और सस्ती है और शरीर के अंदर सीधे ऑनसाइट चिकित्सीय प्रोटीन उत्पादन के लिए लागू की जा सकती है। सिस्टम मेटाबोलिक रोगों और कैंसर और संभवतः मधुमेह के लिए प्रोटीन प्रतिस्थापन से रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।इस बहु-चरण प्रोटोकॉल में एक परिभाषित रोक बिंदु है। पहली बार इसे निष्पादित करते समय, कई दिनों तक काम को विभाजित करने की सिफारिश की जाती है। सिंथेटिक सेल उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल सेल मुक्त S30-T7 lysate की तैयारी के साथ शुरू होता है।इसके बाद, झिल्ली लिपिड और सेलुलर पोषक तत्व समाधान आंतरिक वातावरण का अनुकरण करने और प्रोटीन उत्पादन का समर्थन करने के लिए तैयार हैं। अंतिम चरण सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी खुद है। 100 मिलीलीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में डुप्लिकेट स्टार्टर संस्कृतियां तैयार करें।प्रत्येक फ्लास्क में, एलबी मीडिया के पांच मिलीलीटर जोड़ें जो एम्पिसिलिन के 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक हैं और एक ई.कोलाई कॉलोनी के साथ टीका लगाते हैं। २५० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मंजिल इनक्यूबेटर शेखर में रातोंरात संस्कृति बढ़ो । इसके बाद, दो लीटर चकित एर्लेनमेयर फ्लैक्स तैयार करें जिसमें टीबी मीडिया के 500 मिलीलीटर शामिल हैं, जो एम्पिसिलिन के 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक हैं।पांच मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति के साथ प्रत्येक दो लीटर फ्लास्क टीका। फ्लैक्स को 250 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर में रखें। समय-समय पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संस्कृतियों की निगरानी करें और 0.8 और एक के बीच OD600 तक संस्कृतियों को बढ़ाएं।T7 आरएनए पॉलीमरेज अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, प्रत्येक फ्लास्क में 100 मिलीमोलर आईपीटीजी के तीन मिलीलीटर को 0.6 मिलीमोलर तक पहुंचने के लिए जोड़ें। OD600 लगभग चार है जब तक संस्कृतियों बढ़ जारी रखें। संस्कृतियों के वांछित ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंचने के बाद, प्रत्येक एर्लेनमेयर फ्लास्क से निलंबन को दो 250 मिलीलीटर निष्फल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें।चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7, 000 बार जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को त्याग दें। प्रत्येक गोली को 250 मिलीलीटर ठंड एस 30 में रीसलपेंड करें, यदि वांछित हो तो एक रस्टर का उपयोग करके बफर को थोड़ा सा करें।चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7, 000 बार जी पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्यागें और सभी छर्रों को एक साथ 15 मिलीलीटर ठंडे S30 lysate बफर में फिर से खर्च करें। धुंध पैड का उपयोग कर निलंबन फ़िल्टर करें।अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले, 1.5 मिलीलीटर शीशियों में युक्तियों को प्रीकूल करें जो lysate के भंडारण के लिए आवश्यक होंगे। निलंबन को दो बार समरूप करें। सेल टूटना के लिए चार बार के हवा के दबाव के साथ 15, 000 पीएसआई के एक काम के दबाव का प्रयोग करें।समरूप ले लीजिए। समरूप निलंबन के 10 मिलीलीटर प्रति 0.1 मोलर डीटीटी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। सस्पेंशन को चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट पर 24, ७०० बार जी पर सस्पेंशन ।डीटीटी और क्लोरोफॉर्म को परेशान और हानिकारक के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और इसलिए देखभाल के साथ इलाज किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में बाद में उपयोग किए जाने वाले क्लोरोफॉर्म का उपयोग धुएं निष्कर्षण वाले क्षेत्र में किया जाना चाहिए। lysate गतिविधि को संरक्षित करने के लिए, कदम जल्दी से प्रदर्शन करते हैं।पूर्व-शीतलित शीशियों में सुपरनेटेंट के 200 माइक्रोलीटर एलिकोट रखें और तुरंत उन्हें तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज करें। भविष्य के उपयोग के लिए शीशियों को नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अलग से क्लोरोफॉर्म में POPC और कोलेस्ट्रॉल को भंग करें प्रत्येक मिलीलीटर प्रति 100 मिलीग्राम की अंतिम एकाग्रता के लिए।भंवर प्रत्येक शीशी अलग से। घटकों को दो मिलीलीटर ग्लास शीशी में मिलाएं। कोलेस्ट्रॉल-क्लोरोफॉर्म सॉल्यूशन के 50 माइक्रोलीटर, पीओबीसी-क्लोरोफॉर्म सॉल्यूशन के 50 माइक्रोलीटर और मिनरल ऑयल के 500 माइक्रोलीटर डालें।भंवर शीशी, फिर क्लोरोफॉर्म वाष्पित करने के लिए, यह एक रासायनिक हुड में 80 डिग्री सेल्सियस पर लगभग एक घंटे के लिए गर्म। सिंथेटिक सेल उत्पादन चरण शुरू करने से पहले, पांडुलिपि में वर्णित बाहरी, पूर्व-आंतरिक और भोजन समाधान तैयार करें। फिर बाहरी समाधान के 1.2 मिलीलीटर को 15 मिलीलीटर ट्यूब में रखें और धीरे-धीरे पहली ग्लास शीशी से लिपिड-इन-ऑयल समाधान के 500 माइक्रोलीटर की एक परत जोड़ें।20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब इनक्यूबेट। आंतरिक समाधान तैयारी को अंतिम रूप देने के लिए, S30-T7 lysate और डीएनए प्लाज्मिड जोड़कर 100 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में बर्फ पर मिलाएं। लिपिड-इन-ऑयल सॉल्यूशन के 500 माइक्रोलीटर के साथ दूसरी दो मिलीलीटर ग्लास शीशी में लाइसेट और प्लाज्मिड के साथ आंतरिक समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक मिनट के लिए तेजी से ऊपर और नीचे और फिर पांच स्तर पर एक और मिनट के लिए भंवर । कुचल बर्फ पर 10 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप पायस इनक्यूबेटिंग के बाद, धीरे-धीरे 15 मिलीलीटर ट्यूब में तेल चरण के शीर्ष पर पायस जोड़ें। 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए 100 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।इसके बाद 10 मिनट तक 400 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें। अपकेंद्रित्र के अंत तक, ट्यूब के नीचे एक गोली नमूदार होनी चाहिए। गोली निकालने के लिए सबसे पहले तेल की अतिरिक्त परत को हटा दें।इसके बाद, बाहरी समाधान के लगभग 400 माइक्रोलीटर के साथ एक छंटनी की गई पिपेट टिप लोड करें और गोली इकट्ठा करने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें, बाहरी समाधान जारी करें क्योंकि पिपेट टिप तेल चरण से गुजरता है। पिपेट टिप को पोंछें और गोली को एक साफ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। 1, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गोली अपकेंद्रित्र।सुपरनेट निकालें और फीडिंग सॉल्यूशन के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, बिना किसी झटकों के 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए निलंबन को इनक्यूबेट करें। मॉडल प्रोटीन एसएफजीएफपी और रेनिला लूसिफ़ेरेस को व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड्स को सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण, सीएफपीएस बल्क प्रतिक्रियाओं और सिंथेटिक कोशिकाओं में पेश किया गया था।प्रोटीन उत्पादन का मूल्यांकन कई तरीकों का उपयोग करके किया गया था। पश्चिमी दाग विश्लेषण दोनों CFPS थोक प्रतिक्रियाओं में sfGFP His6 उत्पादन का पता चला और सिंथेटिक कोशिकाओं के अंदर । शुद्ध sfGFP His6 एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।ब्राइटफील्ड और जीएफपी फिल्टर के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप सिंथेटिक कोशिकाओं को दिखाता है जो एसएफजीएफपी का उत्पादन कर रहे हैं। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले एसएफजीएफपी का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। सक्रिय सिंथेटिक सेल आबादी की गणना लाल हिस्टोग्राम द्वारा प्रतिनिधित्व किए गए नकारात्मक डीएनए नमूने द्वारा परिभाषित एसएफजीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता सीमा पर आधारित थी।सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन एसएफजीएफपी की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना सक्रिय सिंथेटिक सेल आबादी से की गई थी और नकारात्मक डीएनए नमूने को सामान्य बनाया गया था। सक्रिय सिंथेटिक कोशिकाओं के व्यास वितरण की गणना एसएफजीएफपी सिग्नल के आधार पर की गई थी। रेनिला लूसिफ़ेरेस गतिविधि को ल्यूमिनेसेंस माप के साथ निर्धारित किया गया था।यह विधि अत्यधिक बहुमुखी है और लाइसेट मूल, लिपिड संरचना और आंतरिक समाधान सांद्रता में फेरबदल करके विभिन्न लक्षित प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन का उत्पादन सिंथेटिक कोशिकाओं के FACS विश्लेषण सक्रिय सिंथेटिक कोशिकाओं के अंश का मात्रात्मक मूल्य प्रदान करने के लिए किया जा सकता है । पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रोटीन उत्पादन को मापने होगा ।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

गैर संपर्क, सेल और बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करते हुए रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का लेबल मुक्त निगरानी

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

एक polydimethylsiloxane (PDMS) सह-अक्षीय प्रवाह फोकस डिवाइस का उपयोग डबल पायस पीढ़ी

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

सीएनएस को चिकित्सीय siRNA की डिलिवरी cationic और Anionic Liposomes का प्रयोग

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

मानव मुलायम ऊतकों की biomechanical विशेषता खरोज और तन्य परीक्षण का उपयोग

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

जीवित कोशिकाओं अभियंता को सिंथेटिक जीव विज्ञान का प्रयोग कि प्रोग्राम सामग्री के साथ इंटरफेस

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

कुशल पीढ़ी और फीडर का संपादन-CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग मानव अग्नाशय कोशिकाओं से मुक्त IPSCs

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

एक Microcontroller पारंपरिक सिगरेट का धुआं और इलेक्ट्रॉनिक सिगरेट एयरोसोल से तरल निष्कर्षों की पीढ़ी के लिए उपकरण संचालित

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

तैयारी, शुद्धि, और फैटी एसिड युक्त Liposomes का उपयोग

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

कोशिका मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति तेजी से बढ़ जीवाणु vibrio natriegens का उपयोग

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

स्वायत्त वेसिकल विकास के लिए पेप्टाइड झिल्ली precursors के Vesiculo संश्लेषण में

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...