Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

この作業は、ERC-STG-2015-680242によってサポートされました。
著者らはまた、テクニオン統合癌センター(TICC)の支援を認める。ラッセル・ベリーナノテクノロジー研究所;ローリーI.ローキー生命科学・工学センター;カミングラントのためのイスラエル経済省(52752);イスラエル科学技術宇宙省 - 主任科学者のオフィス (3-11878);イスラエル科学財団(1778/13,1421/17);イスラエル癌協会(2015-0116);GIFヤング助成金のための科学研究開発のためのドイツ・イスラエル財団(I-2328-1139.10/2012);キャリアインテグレーション補助金のための欧州連合FP-7 IRGプログラム(908049)。リン脂質研究センター助成金;ローゼンブラットがん研究財団、マラットファミリー財団助成金;アンガーファミリー財団。A.シュレーダーはアロンとタウブフェローシップを認めています。O. アディールはシャーマンとグットヴィルトのフェローシップを認める。G.チェンはシャーマン・フェローシップを認める。N.クリンスキーは、ロスチャイルド・カイザリア財団のアリアン・ド・ロスチャイルド女性博士課程を認めています。

注: 完全な合成セルの生産プロトコルの図を図 1に示します。ユーザーのニーズに応じて、プロトコルのタンパク質発現(セクション3.2)および合成細胞形成(セクション4)部分も独立して(いくつかの適応を伴って)行うことができる。
1. S30-T7のリセートの調製
<ol><li>50 μg/mL アンピシリンを補ったLB-寒天プレート上にpAR1219プラスミドを発現するT7 RNAポ?...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes.">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li><li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Inside+Liposomes:+From+Early+Studies+to+Current+Protocols.">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li><li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine.">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1,6-bisphosphate+as+an+energy+source.">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells:+a+review.">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells.">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li><li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+by+directed+evolution.">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion.">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li><li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=While-you-wait+proteins?+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need.">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors.">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).</li><li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system.">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li><li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models.">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li><li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip.">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447 (2016).</li><li>Go&#776;pfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells.">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li><li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins.">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).</li><li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+(1,3)-beta-d-glucan+(curdlan)+synthase:+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs.">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li><li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein:+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes.">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry.">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li><li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li><li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis.">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).</li><li>P&#233;delacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

このプロトコルは、大量のタンパク質産生合成細胞を製造するための簡単で手頃な方法を導入しています。アクティブセルの収量は、いくつかの重要なステップに重点を置いて、プロトコルの慎重かつ正確な実行に依存しています。この方法のライセート調製部では、菌体のリセート中に十分な量のタンパク質を得るためには、細胞のリシス前に適切な細菌密度に到達することが不可欠であ?...

合成細胞は、人工的な細胞様粒子であり、生細胞の1つまたは複数の機能を模倣し、例えば、分裂する能力、膜相互作用を形成し、遺伝コード11、2、32,3に基づいてタンパク質を合成する。無細胞タンパク質合成(CFPS)システムを包み込んだ合成細胞は、DNAテンプレートの変化に伴い様々なタンパク質やRNA配列を産生する能力により、高いモジュール性を有します。タンパク質産生の現在のアプローチに代わる魅力的な代替手段を提示するCFPSシステムは、細胞リ,セート、精製成分、または合成成分に基づいており、リボソーム、RNAポリメラーゼ、アミノ酸およびエネルギー源(例えば、3-ホスホグリセリン酸およびアデニンリン酸)4、5、6、7、9、9、リソソー4,5ムなどのタンパク質合成に必要なすべての転写および翻訳機械を含む。6,7,8,9脂質小胞内のCFPSシステムのカプセル化は、生細胞10に依存することなく、タンパク質の簡単かつ効率的な生産を可能にする。さらに、このプラットフォームは、天然細胞内で分解し得るペプチドの合成、生きている細胞に毒性のあるタンパク質の産生、および非天然アミノ酸11、12,12を有するタンパク質を改変することを可能にする。合成細胞は、進化的な視点から細胞の生命を可能にするために必要な最小限の細胞成分を調査する研究目的のモデルとして使用されてきた11,13。合成細胞は、遺伝的回路の構築と実装、および指向進化14、15、1615,16のモデルとしても使用されてきた。14他の研究は、天然細胞の生物活性を模倣する合成細胞の能力に焦点を当て、糖尿病患者におけるベータ細胞などの損傷した天然細胞を置き換えることを目指している17。さらに、これらのCFPSカプセル化合成細胞が種々の治療用タンパク質を産生する能力は、臨床使用18に組み込まれる可能性を示している。
ここでは、脂質小胞に封入されたCFPSシステムに基づくRNAおよびタンパク質産生合成細胞の産生のためのボトムアップラボスケールプロトコル(図1)について説明する。これは、生体内での治療タンパク質薬のオンサイト生産のための新規薬物送達システムとしての合成細胞プラットフォームの潜在的な使用を示す19。これまでの研究では、CFPS反応と細胞ライセート調製プロセス44、8、208,20の最適化を調査してきました。また、細胞サイズのリポソーム製剤としては、マイクロ流体およびポリマーベースの液滴安定化法21,22,23など21,22,、リポソームの脂質組成24,25,2625,26にも異なる手法24が適用されている。23提示されたプロトコルにおいて、合成細胞は、油中の水中のエマルジョン移動法を用いて製造され、カプセル化プロセスは低温(<4°C)5、10、24、27、28で行われる。5,10,24,27,28これらの穏やかな条件は、分子機械、すなわちリボソームおよびタンパク質27、29、3029,30の生体機能完全性を保持27するために好ましいことが判明している。粒子の脂質組成は、コレステロールと1-パルミトイル-2-オレロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)の両方からなる。第1は、すべての哺乳動物細胞膜に見られ、膜の安定性、剛性および透過性の低下に不可欠であり、後者は哺乳動物リン脂質組成物11、13,13を模倣する。細胞転写および翻訳分子機械はBL21(DE3)大腸菌(大腸菌)株から抽出され、PAR1219プラスミドで過剰発現するT7 RNAポリメラーゼで形質転換され、CFPSの効力とタンパク質合成を増加させる。このシステムは、診断および治療用タンパク質を産生するために使用されており、インビトロおよびインビボ19,31,31の最大66 kDaの分子量を有する。以下のプロトコルは、合成細胞系の生産のための簡単かつ効果的な方法を提供し、タンパク質合成に関連する広範な基本的な問題に本質的に対処することができ、また、薬物送達用途に利用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

合成細胞の構築のためのボトムアップアセンブリアプローチは、細胞模倣環境で細胞プロセスを分離し、調査するための効果的なツールです。さらに、無細胞発現系の開発は、タンパク質の産生、転写、翻訳プロセス(DNA→RNA→タンパク質)を制御された方法で再構成する能力を実証し、合成生物学を活用しています。ここでは、コレステロールが豊富な脂質ベースの巨大なユニラメラ小胞(すなわち、安定したリポソーム)の中に強力な細菌リゼートを産生し、カプセル化する、無細胞発現系を調製するためのプロトコル(すなわち、安定リポソーム)を説明する。プロトコルは、活性細菌リセートの生産を含む合成細胞の成分を調製するための方法を説明し、続いて、油中水エマルジョン移動法に基づく合成細胞の詳細なステップバイステップ調製を行う。これらは、タンパク質の異なるタイプを生産するための高い汎用性を持つシンプルで手頃な方法で合成細胞の数百万の生産を容易にします。得られた合成細胞は、単離された環境でのタンパク質/RNA産生および活性を調査し、指示された進化において、また体内での治療タンパク質のオンデマンド生産のための制御薬物送達プラットフォームとして使用することができる。

脂質小胞内にBL21大腸菌を用いたS30-T7 CFPSシステムをカプセル化することにより、合成細胞の調製のためのプロトコルを提示する。各段階のイメージを含む準備プロセスの概略説明を図 2に示します。合成細胞調製プロセスの成功は、各段階の適切な性能に依存し、異なるパラメータによって影響を受けます。プロトコルは、特定のタンパク質の生産に対応するよ?...

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Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

タンパク質産生合成細胞は、高度な薬物送達のための合成細胞ベースの治療法と同様に、生命の起源を研究するための汎用性の高いプラットフォームを提供します。この方法は、RNAおよびタンパク質発現のためのシンプルで手頃な価格であり、体内で直接オンサイト治療タンパク質の生産に適用することができます。このシステムは、代謝疾患やタンパク質置換から癌、糖尿病に至る幅広い疾患の治療に使用できます。この複数ステッププロトコルには、定義された停止点があります。初めて実行する場合は、数日間にわたって作業を分割することをお勧めします。合成細胞製造のためのプロトコルは、細胞を含まないS30-T7リセートの調製から始まります。次に、膜脂質と細胞栄養溶液は、内部環境をシミュレートし、タンパク質の生産をサポートするために準備されます。最後のステップは、合成細胞自体の調製です。100ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで重複したスターター培養を準備します。各フラスコに、アンピシリン1ミリリットル当たり50マイクログラムを添加したLB培地5ミリリットルを加え、単一の大腸菌コロニーで接種する。250 rpm と 37°C で床インキュベーター シェーカーで一晩培養を育てる。次に、500ミリリットルの結核培地を含む2リットルのバッフル・エルレンマイヤーフラスコを調製し、1ミリリットルのアンピシリン当たり50マイクログラムを補う。5ミリリットルのスターター培養で各2リットルフラスコを接種する。フラスコを250rpmと37°Cのシェーカーに入れます。分光光度計を使用して培養物を定期的に監視し、0.8~1のOD600まで培養を成長させます。T7 RNAポリメラーゼの発現を誘導するには、各フラスコに100ミリモルIPTGの3ミリリットルを加え、0.6ミリモルに達する。OD600が約4になるまで培養を続けます。培養物が所望の光学密度に達した後、各エルレンマイヤーフラスコから250ミリリットルの殺菌された遠心分離管に懸濁液を移す。チューブを摂氏4度で10分間7,000倍に遠心します。上清を捨てます。必要に応じて攪拌機を使用して、各ペレットを250ミリリットルの冷たいS30溶液緩衝液で再懸濁する。摂氏4度で10分間、7,000倍gの遠心分離機。上清を捨て、冷たいS30ライセートバッファーの15ミリリットルですべてのペレットを再懸濁します。ガーゼパッドを使用して懸濁液をフィルターします。次のステップに進む前に、ライセートを保存するために必要な1.5ミリリットルバイアルでチップを予冷します。懸濁液を2回均質化する。細胞破損のための4つの棒の空気圧の15,000 PSIの働く圧力を使用する。ホモジネートを収集します。均質化懸濁液の10ミリリットルあたり0.1モルDTTの100マイクロリットルを加える。24、摂氏4度で30分で700回gでサスペンションを遠心分離する。DTTとクロロホルムは刺激性と有害に分類されるため、注意して扱う必要があります。プロトコルで後述するクロロホルムは、ヒューム抽出のある領域で使用する必要があります。ライセート活性を維持するには、迅速にステップを実行します。あらかじめ冷却されたバイアルに上澄み液の200マイクロリットルのアリコートを入れ、すぐに液体窒素でそれらを凍結します。バイアルは、将来の使用のためにマイナス80°Cで保存してください。別々にクロロホルムでPOPCとコレステロールを溶解します 1 ミリリットルあたり 100 ミリグラムの最終濃度.各バイアルを別々に渦。2ミリリットルのガラスバイアルにコンポーネントを組み合わせます。コレステロール-クロロホルム溶液50マイクロリットル、POPC-クロロホルム溶液50マイクロリットル、ミネラルオイル500マイクロリットルを加えます。バイアルをボルテックスし、クロロホルムを蒸発させ、化学フードで摂氏80度で約1時間加熱する。合成細胞製造段階を開始する前に、原稿に記載されているように外液、プレインナー、および給餌液を調製する。その後、15ミリリットルのチューブに外側溶液の1.2ミリリットルを入れ、最初のガラスバイアルから500マイクロリットルの脂質油中溶液の層をゆっくりと追加します。室温でチューブを20分間インキュベートします。内部溶液の調製を確定するには、S30-T7溶解液およびDNAプラスミドを添加して、氷上で100マイクロリットルの最終体積に混ぜます。500マイクロリットルの脂質油中溶液を用いて、2ミリリットルのガラスバイアルに溶解液とプラスミドを使用して100マイクロリットルの内部溶液を加えます。ピペットは1分間激しく上下し、レベル5でさらに1分間渦巻きします。得られたエマルジョンを砕いた氷の上で10分間インキュベーションした後、15ミリリットルチューブの油相の上にエマルジョンをゆっくりと加える。チューブを100倍gと摂氏4度で10分間遠心分離します。その後、400倍gと摂氏4度で10分間遠心分離機。遠心分離の終わりまでに、ペレットはチューブの底部で観察可能であるべきです。ペレットを抽出するには、まず余分な油層を除去する。次に、約400マイクロリットルの外側溶液でトリミングされたピペットチップをロードし、ピペットチップを使用してペレットを採取し、ピペットチップが油相を通過する際に外側溶液を放出する。ピペットチップを拭き、ペレットをきれいな1.5ミリリットルのチューブに移します。ペレットを1,000倍gと摂氏4度で10分間遠心します。上清を取り除き、100マイクロリットルの供給溶液でペレットを再懸濁します。タンパク質発現の場合は、振盪することなく摂氏37度で2時間の懸濁液をインキュベートします。モデルタンパク質sfGFPおよびレニラルシメラーゼを発現するプラスミドを無細胞タンパク質合成、CFPSバルク反応、および合成細胞に導入した。タンパク質の産生は、いくつかの方法を用いて評価した。ウェスタンブロット分析は、CFPSバルク反応と合成細胞内部の両方でsfGFP His6産生を検出した。精製されたsfGFP His6は陽性対照として使用した。ブライトフィールドとGFPフィルターを備えた蛍光顕微鏡は、sfGFPを産生している合成細胞を示しています。フローサイトメトリーを用い、sfGFP産生合成細胞を分析した。活性合成細胞集団の計算は、赤色ヒストグラムで表される陰性DNAサンプルで定義されるsfGFP蛍光強度閾値に基づいていた。合成細胞を産生するsfGFPの平均蛍光強度は、活性合成細胞集団から算出し、陰性DNA試料に正規化した。活性合成細胞の直径分布はsfGFP信号に基づいて算出した。ルシメラーゼ活性を発光測定で定量した。この方法は非常に汎用性が高く、溶解物の起源、脂質組成および内部溶液濃度を変化させることによって異なる標的タンパク質に対して最適化することができる。蛍光マーカータンパク質を産生する合成細胞のFACS分析を行い、活性合成細胞の画分の定量値を提供することができる。ウェスタンブロット分析はタンパク質の産生を測定するであろう。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

ポリジメチルシロキサン（PDMS）同軸フローフォーカス・デバイスを使用したダブルエマルションの生成

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

カチオン性およびアニオン性リポソームを用いてCNSへの治療用のsiRNAの送達

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

インデントと引張試験を用いたヒト軟部組織の生体力学的特性評価

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Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

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効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

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