Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av ERC-STG-2015-680242.
Forfatterne anerkjenner også støtte fra Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Det tverrfaglige senter for biovitenskap og ingeniørsenter og Israels finansdepartement for et Kamin Grant (52752); Israel Ministry of Science Technology and Space - Office of the Chief Scientist (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israelske stiftelsen for vitenskapelig forskning og utvikling for en GIF Young stipend (I-2328-1139.10/2012); Den europeiske unions FP-7 IRG-program for en karriereintegrasjonsbevilgning (908049); Fosfolipid Research Center Grant; en Rosenblatt Foundation for kreftforskning, en Mallat Family Foundation Grant; og Unger Family Foundation. A. Schroeder anerkjenner Alon og Taub Fellowships. O. Adir anerkjenner Sherman og Gutwirth fellesskap. G. Chen anerkjenner Sherman Fellowship. N. Krinsky anerkjenner Baronesse Ariane de Rothschild Women Doctoral Program fra Rothschild Caesarea Foundation.

MERK: Illustrasjon av de komplette syntetiske cellenes produksjonsprotokoll er presentert i figur 1. I henhold til brukerens behov kan proteinuttrykket (avsnitt 3.2) og syntetiskcelledannelse (avsnitt 4) deler av protokollen også utføres uavhengig (med noen tilpasninger).
1. Utarbeidelse av S30-T7 lysate
<ol><li>Strekplate E. coli BL21(DE3) bakterier forvandlet med T7 RNA polymerase uttrykker pAR1219 plasmid på en LB-agar plate supplert med 50 μg / ...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes.">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li><li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Inside+Liposomes:+From+Early+Studies+to+Current+Protocols.">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li><li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine.">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1,6-bisphosphate+as+an+energy+source.">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells:+a+review.">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells.">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li><li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+by+directed+evolution.">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion.">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li><li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=While-you-wait+proteins?+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need.">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors.">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).</li><li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system.">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li><li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models.">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li><li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip.">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447 (2016).</li><li>Go&#776;pfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells.">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li><li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins.">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).</li><li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+(1,3)-beta-d-glucan+(curdlan)+synthase:+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs.">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li><li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein:+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes.">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry.">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li><li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li><li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis.">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).</li><li>P&#233;delacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

Denne protokollen introduserer en enkel og rimelig metode for produksjon av store mengder proteinproduserende syntetiske celler. Avkastningen av aktive celler er avhengig av forsiktig og nøyaktig gjennomføring av protokollen med vekt på flere kritiske trinn. I lysate forberedelsedelen av denne metoden er det viktig å nå riktig bakterietetthet før cellelysis for å oppnå en tilstrekkelig mengde proteiner i bakterielysatet. For det andre bør lysisprosessen utføres ved 4 °C og lysatet frosset raskt med flytende ni...

Syntetiske celler er kunstige cellelignende partikler, etterligner en eller flere funksjoner i en levende celle, for eksempel evnen til å dele, danne membraninteraksjoner og syntetisere proteiner basert på en genetisk kode1,2,3. Syntetiske celler som omslutter cellefrie proteinsyntese (CFPS)-systemer har høy modularitet på grunn av deres evne til å produsere ulike proteiner og RNA-sekvenser etter endringer i DNA-malen. Ved å presentere et attraktivt alternativ til de nåværende tilnærmingene til proteinproduksjon, er CFPS-systemer basert på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og inkluderer alle transkripsjons- og oversettelsesmaskiner som kreves for proteinsyntese som ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-fosforlykemat og adenintriphosfat)4,5,6,7,8,9. Innkapslingen av et CFPS-system inne i lipidvesikler muliggjør enkel og effektiv produksjon av proteiner uten å være avhengig av en levende celle10. Videre tillater denne plattformen syntese av peptider som kan forringes inne i naturlige celler, produksjon av proteiner som er giftige for levende celler, og endre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer11,12. Syntetiske celler har blitt brukt som en modell for forskningsformål som undersøker de minimale cellekomponentene som kreves for å muliggjøre cellulær liv fra et evolusjonært perspektiv1,13. Syntetiske celler har også blitt brukt til å bygge og implementere genetisk krets og som modeller for rettet evolusjon14,15,16. Andre studier har fokusert på evnen til syntetiske celler for å etterligne den biologiske aktiviteten til naturlige celler, med sikte på å erstatte skadede naturlige celler, for eksempel betaceller hos pasienter med diabetes17. Videre illustrerer evnen til disse CFPS-innkapslingssyntetiske cellene til å produsere en rekke terapeutiske proteiner sitt potensial til å bli innlemmet i klinisk bruk18.
Her beskriver vi en bunn-opp lab-skala protokoll (Figur 1) for produksjon av RNA og proteinproduserende syntetiske celler basert på et CFPS-system innkapslet i en lipid vesikkel. Dette viser den potensielle bruken av syntetiske celleplattformer som nye legemiddelleveringssystemer for produksjon av et terapeutisk proteinstoff in vivo19. Tidligere studier har undersøkt optimalisering av CFPS-reaksjonen og cellelysate forberedelsesprosessene4,8,20. Videre har flere teknikker blitt brukt for cellestørrelse liposom forberedelse, for eksempel mikrofluidiske og polymer-baserte dråpestabiliseringsmetoder21,22,23, som også varierer i liposomenes lipidsammensetning24,25,26. I den presenterte protokollen produseres syntetiske celler ved hjelp av en overføringsmetode for vann-i-olje-emulsjon, og innkapslingsprosessen utføres ved lave temperaturer (<4 °C)5,,10,,24,27,28. Disse milde forholdene har vist seg å være gunstige for å beholde den biofunksjonelle integriteten til molekylærmaskineriet, nemlig ribosomer og proteiner27,,29,30. Lipidsammensetningen av partiklene består av både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den første finnes i alle pattedyrcellemembraner og er avgjørende for stabilitet, stivhet og permeabilitetsreduksjon av membranen, og sistnevnte etterligner pattedyrfolipidsammensetning11,13. Den cellulære transkripsjonen og oversettelsesmolekylære maskineriet ekstraheres fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som er forvandlet med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase for å øke CFPS potens og proteinsyntese. Dette systemet har blitt brukt til å produsere diagnostiske og terapeutiske proteiner, med molekylvekter på opptil 66 kDa in vitro og in vivo19,31. Følgende protokoll gir en enkel og effektiv metode for produksjon av det syntetiske cellesystemet, som kan løse et bredt spekter av grunnleggende spørsmål knyttet til proteinsyntese i naturen og kan også brukes til narkotikaleveringsapplikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

Nedenfra og opp montering tilnærming for bygging av syntetiske celler er et effektivt verktøy for å isolere og undersøke cellulære prosesser i en celle etterligne miljø. Videre har utviklingen av cellefrie uttrykkssystemer vist evnen til å rekonstituere proteinproduksjon, transkripsjon og oversettelsesprosesser (DNA→ RNA→protein) på en kontrollert måte, og utnytte syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokoll for å forberede et cellefritt uttrykkssystem, inkludert produksjon av en potent bakteriell lysat og innkapsling av denne lysaten inne i kolesterolrike lipidbaserte, unilamellære vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), for å danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metodene for å forberede komponentene i de syntetiske cellene, inkludert produksjon av aktive bakterielle lysater, etterfulgt av en detaljert trinnvis forberedelse av syntetiske celler basert på en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode. Disse letter produksjonen av millioner av syntetiske celler på en enkel og rimelig måte med høy allsidighet for å produsere forskjellige typer proteiner. De oppnådde syntetiske cellene kan brukes til å undersøke protein/RNA-produksjon og aktivitet i et isolert miljø, i rettet evolusjon, og også som en kontrollert legemiddelleveringsplattform for behovsbetinget produksjon av terapeutiske proteiner inne i kroppen.

Vi presenterer en protokoll for fremstilling av syntetiske celler ved å innkapsle et S30-T7 CFPS-system basert på BL21 E. coli inne i lipidvesikler. En skjematisk beskrivelse av forberedelsesprosessen som inneholder et bilde av hvert trinn, presenteres i figur 2. Suksessen til den syntetiske celleklargjøringsprosessen er avhengig av riktig ytelse for hvert trinn og påvirket av forskjellige parametere. Protokollen bør justeres for å imøtekomme produksjonen av et bestemt protei...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Denne protokollen beskriver metoden, materialer, utstyr og trinn for nedenfra og opp forberedelse av RNA og proteinproduserende syntetiske celler. Det indre akdige rommet i de syntetiske cellene inneholdt S30 bakteriell lysat innkapslet i en lipid bilayer (dvs. stabile liposomer), ved hjelp av en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode.

Forbereder proteinproduserende syntetiske celler ved hjelp av cellefrie bakterielle ekstrakter, liposomer og emulsjonsoverføring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Proteinproduserende syntetiske celler tilbyr en allsidig plattform for å studere livets opprinnelse samt syntetiske cellebaserte terapier for avansert legemiddellevering. Denne metoden er enkel og rimelig for RNA og proteinuttrykk og kan brukes til terapeutisk proteinproduksjon på stedet direkte inne i kroppen. Systemene kan brukes til å behandle et bredt spekter av sykdommer fra metabolske sykdommer og proteinerstatninger til kreft og muligens diabetes.Denne flertrinnsprotokollen har et definert stoppested. Når du utfører det for første gang, anbefales det å dele arbeidet over flere dager. Protokollen for syntetisk celleproduksjon starter med utarbeidelsen av den cellefrie S30-T7-lysatet.Deretter er membranlipidene og cellulær næringsløsning forberedt på å simulere det indre miljøet og for å støtte proteinproduksjon. Det siste trinnet er utarbeidelsen av de syntetiske cellene selv. Forbered dupliserte startkulturer i 100 milliliter Erlenmeyer flasker.Til hver kolbe, tilsett fem milliliter LB media supplert med 50 mikrogram per milliliter ampicillin og inokulere med en enkelt E.coli koloni. Vokse kulturen over natten i et gulv inkubator shaker på 250 rpm og 37 grader Celsius. Deretter tilbereder du to liters forbløffede Erlenmeyer kolber som inneholder 500 milliliter TB-medier supplert med 50 mikrogram per milliliter ampicillin.Inokuler hver to liters kolbe med en fem milliliter startkultur. Legg kolben i en shaker på 250 rpm og 37 grader Celsius. Overvåk kulturene regelmessig ved hjelp av et spektrofotometer og øk kulturene til OD600 mellom 0,8 og en.For å indusere T7 RNA polymerase uttrykk, legg til hver kolbe tre milliliter på 100 millimolar IPTG for å nå 0,6 millimolar. Fortsett å dyrke kulturene til OD600 er omtrent fire. Når kulturene når ønsket optisk tetthet, overføre suspensjon fra hver Erlenmeyer kolbe i to 250 milliliter sterilisert sentrifuge rør.Sentrifuger rørene på 7 000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kast det overnaturlige. Resuspend hver pellet i 250 milliliter kald S30 lysate buffer ved hjelp av en røre hvis ønskelig.Sentrifuge ved 7000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Kast den overnaturlige og resuspend alle pellets sammen i 15 milliliter kald S30 lysate buffer. Filtrer suspensjonen ved hjelp av gasbindputer.Før du går videre til neste trinn, precool tipsene i 1,5 milliliter hetteglass som vil være nødvendig for lagring av lysate. Homogeniser suspensjonen to ganger. Bruk et arbeidstrykk på 15 000 PSI med et lufttrykk på fire bar for cellebrudd.Samle homogenatet. Tilsett 100 mikroliter med 0,1 molar DTT per 10 milliliter av den homogeniserte suspensjonen. Sentrifuger suspensjonen ved 24, 700 ganger g ved 30 minutter ved fire grader Celsius.DTT og kloroform klassifiseres som irriterende og skadelig og bør derfor behandles med forsiktighet. Kloroform som brukes senere i protokollen må brukes i et område med røykavsug. For å bevare lysateaktiviteten, utfør trinnet raskt.Plasser 200 mikroliter aliquots av supernatant i forhåndskjølte hetteglass og umiddelbart snap fryse dem med flytende nitrogen. Oppbevar hetteglassene ved negative 80 grader Celsius for fremtidig bruk. Separat oppløse POPC og kolesterol i kloroform hver til en endelig konsentrasjon på 100 milligram per milliliter.Vortex hvert hetteglass separat. Kombiner komponentene i et to milliliter hetteglass. Tilsett 50 mikroliter av kolesterolklorformløsningen, 50 mikroliter popc-kloroformløsning og 500 mikroliter mineralolje.Vortex hetteglasset, deretter for å fordampe kloroformen, varme den i omtrent en time ved 80 grader Celsius i en kjemisk hette. Før du starter det syntetiske celleproduksjonsstadiet, må du forberede de ytre, pre-indre og fôringsløsningene som beskrevet i manuskriptet. Legg deretter 1,2 milliliter av den ytre oppløsningen i et 15 milliliter rør og legg langsomt til et lag med 500 mikroliter lipider-i-olje-løsning fra det første hetteglasset med glass.Inkuber t-banen ved romtemperatur i 20 minutter. For å fullføre det indre løsningspreparatet, bland på is til et endelig volum på 100 mikroliter ved å legge til S30-T7 lysate og DNA plasmid. Tilsett 100 mikroliter av den indre oppløsningen med lysat og plasmid til det andre to milliliter hetteglasset med 500 mikroliter lipider-i-olje-løsning.Pipette opp og ned kraftig i ett minutt og deretter virvel i et minutt på nivå fem. Etter å ha inkubert den resulterende emulsjonen i 10 minutter på knust is, legg langsomt emulsjonen på toppen av oljefasen i 15 milliliterrøret. Sentrifuger røret i 10 minutter ved 100 ganger g og fire grader Celsius.Deretter sentrifuge i 10 minutter på 400 ganger g og fire grader Celsius. Ved slutten av sentrifugeringen bør en pellet observeres på bunnen av røret. For å trekke ut pelleten, fjern først overflødig oljelag.Deretter laster du en trimmet pipettespiss med ca. 400 mikroliter ytre oppløsning og bruker pipettespissen til å samle pelleten, og slipper ut den ytre løsningen når pipettespissen passerer gjennom oljefasen. Tørk av pipettespissen og overfør pelleten til et rent 1,5 milliliter rør. Sentrifuger pelleten i 10 minutter ved 1000 ganger g og fire grader Celsius.Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i 100 mikroliter fôringsoppløsning. For proteinuttrykk, inkuber suspensjonen i to timer ved 37 grader Celsius uten å riste. Plasmider som uttrykker modellproteinet sfGFP og Renilla luciferase ble introdusert i cellefri proteinsyntese, CFPS bulkreaksjoner og syntetiske celler.Proteinproduksjon ble evaluert ved hjelp av flere metoder. Western blot analyse oppdaget sfGFP His6 produksjon i både CFPS bulk reaksjoner og inne syntetiske celler. Renset sfGFP His6 ble brukt som en positiv kontroll.Et fluorescerende mikroskop med brightfield og et GFP-filter viser syntetiske celler som produserer sfGFP. Flow cytometri ble brukt til å analysere sfGFP produsere syntetiske celler. Beregning av den aktive syntetiske cellepopulasjonen var basert på sfGFP fluorescensintensitetsterskelen definert av den negative DNA-prøven representert ved det røde histogrammet.Gjennomsnittlig fluorescensintensitet av sfGFP som produserer syntetiske celler ble beregnet ut fra den aktive syntetiske cellepopulasjonen og normalisert til den negative DNA-prøven. Diameterfordelingene til de aktive syntetiske cellene ble beregnet basert på sfGFP-signalet. Renilla luciferase aktivitet ble kvantifisert med luminescence målinger.Denne metoden er svært allsidig og kan optimaliseres for ulike målproteiner ved å endre lysate opprinnelse, lipidsammensetning og indre oppløsningskonsentrasjoner. FACS analyse av syntetiske celler som produserer et fluorescerende markørprotein kan utføres for å gi kvantitativ verdi av fraksjonen av aktive syntetiske celler. Vestlig flekkanalyse ville måle proteinproduksjon.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Ved hjelp av en Polydimethylsiloxane (PDMS) Koaksial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Levering av Terapeutisk siRNA til CNS Bruke kationiske og anioniske liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomekaniske Karakterisering av menneske bløtvev Bruke Innrykk og Strekkprøving

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Bruke Syntetisk biologi Ingeniør levende celler som grensesnitt med Programmerbare Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En Microcontroller drives enhet for generering av flytende ekstrakter fra konvensjonelle sigarett røyk og elektronisk sigarett Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Forberedelse, rensing og bruk av fettsyrer inneholder liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellen gratis Protein uttrykk ved hjelp av den raskt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo syntese av peptid membran forløpere for autonome vesicle vekst

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...