Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo ERC-STG-2015-680242.
Os autores também reconhecem o apoio do Centro Integrado de Câncer Technion (TICC); o Russell Berrie Nanotechnology Institute; o Centro Interdisciplinar de Ciências e Engenharia de Vida Lorry I. Lokey; o Ministério da Economia de Israel para um Kamin Grant (52752); o Ministério da Ciência de Israel Tecnologia e Espaço – Escritório do Cientista Chefe (3-11878); a Fundação de Ciência de Israel (1778/13, 1421/17); a Associação israelense de câncer (2015-0116); a Fundação German-Israelense de Pesquisa e Desenvolvimento Científico para uma bolsa GIF Young (I-2328-1139.10/2012); o Programa FP-7 IRG da União Europeia para uma Bolsa de Integração de Carreira (908049); o Subsídio do Centro de Pesquisa Fosfolipídeo; uma Fundação Rosenblatt para pesquisa de câncer, uma Bolsa da Fundação Da Família Mallat; e a Unger Family Foundation. A. Schroeder reconhece as Bolsas Alon e Taub. O. Adir reconhece as bolsas Sherman e Gutwirth. G. Chen reconhece a Bolsa Sherman. N. Krinsky reconhece o Programa de Doutorado feminino da Baronesa Ariane de Rothschild da Fundação Rothschild Caesarea.

NOTA: A ilustração do protocolo completo de produção das células sintéticas é apresentada na Figura 1. De acordo com as necessidades do usuário, a expressão proteica (seção 3.2) e a formação de células sintéticas (seção 4) do protocolo também podem ser realizadas independentemente (com algumas adaptações).
1. Preparação do lysate S30-T7
<ol><li>Placa de raia a bactéria E. coli BL21(DE3) transformada com a polimerase T7 RNA express...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. 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D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

Este protocolo introduz um método simples e acessível para a produção de grandes quantidades de células sintéticas produtoras de proteínas. O rendimento das células ativas depende da execução cuidadosa e precisa do protocolo com ênfase em várias etapas críticas. Na seção de preparação de lisato deste método, é essencial alcançar a densidade de bactérias apropriada antes da lse celular para alcançar uma quantidade suficiente de proteínas no lisato bacteriano. Em segundo lugar, o processo de lyse dev...

As células sintéticas são partículas artificiais semelhantes a células, imitando uma ou múltiplas funções de uma célula viva, como a capacidade de se dividir, formar interações de membrana e sintetizar proteínas com base em um código genético1,2,3. Células sintéticas que encerram sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) possuem alta modularidade devido à sua capacidade de produzir várias proteínas e seqüências de RNA após alterações no modelo de DNA. Apresentando uma alternativa atraente às abordagens atuais da produção de proteínas, os sistemas CFPS baseiam-se em lisato celular, componentes purificados ou componentes sintéticos e incluem todas as máquinas de transcrição e tradução necessárias para a síntese de proteínas como ribossomos, Polimerase de RNA, aminoácidos e fontes de energia (por exemplo, 3-fosfoliglicerato e adenina,tripofatos)4,5,6,7, 8,8.9 O encapsulamento de um sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite a produção simples e eficiente de proteínas sem depender de uma célula viva10. Além disso, esta plataforma permite a síntese de peptídeos que podem se degradar dentro das células naturais, a produção de proteínas tóxicas para as células vivas e a modificação de proteínas com aminoácidos não naturais11,12. As células sintéticas têm sido utilizadas como modelo para fins de pesquisa investigando os componentes celulares mínimos necessários para permitir a vida celular a partir de uma perspectiva evolutiva1,13. As células sintéticas também têm sido utilizadas para construir e implementar circuitogenético e como modelos para evolução dirigida14,,15,,16. Outros estudos têm focado na capacidade das células sintéticas de imitar a atividade biológica das células naturais, visando substituir células naturais danificadas, como células beta em pacientes com diabetes17. Além disso, a capacidade dessas células sintéticas encapsuladas cfps de produzir uma variedade de proteínas terapêuticas ilustra seu potencial para serem incorporadas ao uso clínico18.
Aqui descrevemos um protocolo de escala de laboratório de baixo para cima (Figura 1) para a produção de RNA e células sintéticas produtoras de proteínas com base em um sistema CFPS encapsulado em uma vesícula lipídica. Isso mostra o potencial uso de plataformas de células sintéticas como novos sistemas de entrega de medicamentos para a produção in loco de uma droga de proteína terapêutica in vivo19. Estudos anteriores têm investigado a otimização da reação cfps e os processos de preparação de lésa celular4,8,20. Além disso, várias técnicas têm sido aplicadas para a preparação do liposome do tamanho celular, tais como os métodos de estabilização de gotículas microfluidas e baseadas em polímeros21,,22,23, que também diferem na composição lipídica dos liposóis24,,25,26. No protocolo apresentado, as células sintéticas são produzidas utilizando-se um método de transferência de emulsão de água-no-óleo e o processo de encapsulamento é realizado a baixas temperaturas (<4 °C)5,10,24,27,28. Estas condições leves têm sido favoráveis para a manutenção da integridade biofuncional das máquinas moleculares, ou seja, ribossomos e proteínas27,29,30. A composição lipídica das partículas consiste tanto no colesterol quanto no 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocholine (POPC). A primeira é encontrada em todas as membranas celulares dos mamíferos e é essencial para a estabilidade, rigidez e redução da permeabilidade da membrana, e esta última imita a composição fosfolipídea dos mamíferos11,13. A transcrição celular e a maquinaria molecular de tradução são extraídas da cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que é transformada com pAR1219 plasmídeo superexpressor t7 rna polimerase para aumentar a potência cfps e a síntese de proteínas. Este sistema tem sido utilizado para produzir proteínas diagnósticas e terapêuticas, com pesos moleculares de até 66 kDa in vitro e in vivo19,31. O protocolo a seguir fornece um método simples e eficaz para a produção do sistema celular sintético, que pode abordar uma ampla gama de questões fundamentais associadas à síntese proteica na natureza e também pode ser utilizado para aplicações de entrega de medicamentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

A abordagem de montagem de baixo para cima para a construção de células sintéticas é uma ferramenta eficaz para isolar e investigar processos celulares em um ambiente de imitação celular. Além disso, o desenvolvimento de sistemas de expressão livre de células demonstrou a capacidade de reconstituir os processos de produção, transcrição e tradução de proteínas (DNA→RNA→protein) de forma controlada, aproveitando a biologia sintética. Aqui descrevemos um protocolo para preparar um sistema de expressão livre de células, incluindo a produção de um potente lisato bacteriano e encapsulamento deste lisato dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) ricas em colesterol( ou seja, lipossomos estáveis), para formar células sintéticas. O protocolo descreve os métodos para a preparação dos componentes das células sintéticas, incluindo a produção de lisatos bacterianos ativos, seguido de uma preparação detalhada passo a passo das células sintéticas com base em um método de transferência de emulsão de água em óleo. Estes facilitam a produção de milhões de células sintéticas de forma simples e acessível, com alta versatilidade para a produção de diferentes tipos de proteínas. As células sintéticas obtidas podem ser utilizadas para investigar a produção e a atividade de proteína/RNA em um ambiente isolado, em evolução direcionada, e também como uma plataforma controlada de entrega de medicamentos para produção sob demanda de proteínas terapêuticas dentro do corpo.

Apresentamos um protocolo para a preparação de células sintéticas encapsulando um sistema CFPS S30-T7 baseado em BL21 E. coli dentro de vesículas lipídicas. Uma descrição esquemmática do processo de preparação que inclui uma imagem de cada etapa é apresentada na Figura 2. O sucesso do processo de preparação de células sintéticas depende do desempenho adequado de cada etapa e efetuado por diferentes parâmetros. O protocolo deve ser ajustado para acomodar a produção...

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Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

As células sintéticas produtoras de proteínas oferecem uma plataforma versátil para estudar as origens da vida, bem como terapias baseadas em células sintéticas para a entrega avançada de medicamentos. Este método é simples e acessível para RNA e expressão proteica e pode ser aplicado para a produção de proteína terapêutica no local diretamente dentro do corpo. Os sistemas podem ser usados para o tratamento de uma ampla gama de doenças, desde doenças metabólicas e reposições proteicas ao câncer e possivelmente diabetes.Este protocolo de várias etapas tem um ponto de parada definido. Ao realizá-lo pela primeira vez, recomenda-se dividir o trabalho ao longo de vários dias. O protocolo para produção de células sintéticas começa com a preparação do lise S30-T7 livre de células.Em seguida, os lipídios de membrana e a solução de nutrientes celulares são preparados para simular o ambiente interno e apoiar a produção de proteínas. O passo final é a preparação das próprias células sintéticas. Prepare culturas de partida duplicadas em frascos de 100 mililitros Erlenmeyer.A cada frasco, adicione cinco mililitros de mídia LB complementados com 50 microgramas por mililitro de ampicillina e inoculados com uma única colônia de E.coli. Cresça a cultura durante a noite em um agitador de incubadora de piso a 250 rpm e 37 graus Celsius. Em seguida, prepare dois frascos erlenmeyer perplexos contendo 500 mililitros de mídia de TB complementados com 50 microgramas por mililitro de ampicillina.Inocular cada frasco de dois litros com uma cultura inicial de cinco mililitros. Coloque os frascos em um shaker a 250 rpm e 37 graus Celsius. Monitore as culturas periodicamente usando um espectrofotômetro e cresça as culturas até OD600 entre 0,8 e um.Para induzir a expressão de polimerase T7 RNA, adicione a cada frasco três mililitros de 100 mililitros IPTG para atingir 0,6 milimerlar. Continue crescendo as culturas até que OD600 seja aproximadamente quatro. Depois que as culturas atingirem a densidade óptica desejada, transfira a suspensão de cada frasco de Erlenmeyer em dois tubos de centrífuga esterilizados de 250 mililitros.Centrifugar os tubos a 7.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernaspeso. Resuspenda cada pelota em 250 mililitros de tampão de lise S30 frio usando um agitador, se desejar.Centrifugar a 7.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernasciente e resuspenque todas as pelotas juntas em 15 mililitros de tampão de lise S30 frio. Filtre a suspensão usando gaze pads.Antes de prosseguir para a próxima etapa, pré-torne as pontas em frascos de 1,5 mililitro que serão necessários para armazenar o lysate. Homogeneize a suspensão duas vezes. Use uma pressão de trabalho de 15.000 PSI com uma pressão de ar de quatro barras para quebra de células.Recolher o homogeneizar. Adicione 100 microliters de 0,1 molar DTT por 10 mililitros da suspensão homogeneizada. Centrifugar a suspensão a 24.700 vezes g a 30 minutos a quatro graus Celsius.DTT e clorofórmio são classificados como irritantes e prejudiciais e, portanto, devem ser tratados com cuidado. O clorofórmio usado mais tarde no protocolo deve ser usado em uma área com extração de fumaça. Para preservar a atividade de lise, realize o passo rapidamente.Coloque 200 alíquotas de microliter de supernascer em frascos pré-resfriados e congele-os imediatamente com nitrogênio líquido. Armazene os frascos a 80 graus Celsius negativos para uso futuro. Dissolver separadamente POPC e colesterol em clorofórmio cada um para uma concentração final de 100 miligramas por mililitro.Vórtice cada frasco separadamente. Combine os componentes em um frasco de vidro de dois mililitros. Adicione 50 microliters da solução de clorofórmio de colesterol, 50 microlitadores da solução POPC-clorofórmio e 500 microliters de óleo mineral.Vórtice do frasco, depois para evaporar o clorofórmio, aqueça-o por cerca de uma hora a 80 graus Celsius em uma capa química. Antes de iniciar a fase de produção de células sintéticas, prepare as soluções externas, pré-internas e de alimentação, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, coloque 1,2 mililitros da solução externa em um tubo de 15 mililitros e adicione lentamente uma camada de 500 microliters de solução lipídica em óleo a partir do primeiro frasco de vidro.Incubar o tubo em temperatura ambiente por 20 minutos. Para finalizar a preparação da solução interna, misture o gelo a um volume final de 100 microliters adicionando lysate S30-T7 e plasmídeo de DNA. Adicione 100 microliters da solução interna com liseto e plasmídeo ao segundo frasco de vidro de dois mililitros com 500 microliters de solução lipídica em óleo.Pipeta para cima e para baixo vigorosamente por um minuto e, em seguida, vórtice por mais um minuto no nível cinco. Depois de incubar a emulsão resultante por 10 minutos em gelo esmagado, adicione lentamente a emulsão em cima da fase do óleo no tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo por 10 minutos a 100 vezes g e quatro graus Celsius.Em seguida, centrífuga por 10 minutos a 400 vezes g e quatro graus Celsius. No final da centrifugação, uma pelota deve ser observável na parte inferior do tubo. Para extrair a pelota, primeiro remova a camada de óleo em excesso.Em seguida, carregue uma ponta de pipeta aparada com aproximadamente 400 microlitros de solução externa e use a ponta da pipeta para coletar a pelota, liberando a solução externa à medida que a ponta da pipeta passa pela fase do óleo. Limpe a ponta da pipeta e transfira a pelota para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Centrifugar a pelota por 10 minutos a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius.Remova o supernatante e resuspenja a pelota em 100 microliters de solução alimentar. Para expressão proteica, incubar a suspensão por duas horas a 37 graus Celsius sem tremer. Plasmids expressando o modelo de proteína sfGFP e renilla luciferase foram introduzidos na síntese proteica livre de células, reações em massa cfps e células sintéticas.A produção de proteínas foi avaliada utilizando vários métodos. A análise de manchas ocidentais detectou a produção de sfGFP His6 tanto em reações a granel cfps quanto dentro de células sintéticas. O sfGFP His6 purificado foi usado como controle positivo.Um microscópio fluorescente com um Brightfield e um filtro GFP mostram células sintéticas que estão produzindo sfGFP. A citometria de fluxo foi utilizada para analisar células sintéticas produtoras de sfGFP. O cálculo da população de células sintéticas ativas baseou-se no limiar de intensidade de fluorescência sfGFP definido pela amostra de DNA negativo representada pelo histograma vermelho.A intensidade média de fluorescência das células sintéticas produtoras de sfGFP foi calculada a partir da população de células sintéticas ativas e normalizada para a amostra de DNA negativo. As distribuições de diâmetro das células sintéticas ativas foram calculadas com base no sinal sfGFP. A atividade de renilla luciferase foi quantificada com medidas de luminescência.Este método é altamente versátil e pode ser otimizado para diferentes proteínas-alvo alterando a origem do lysate, a composição lipídica e as concentrações de soluções internas. A análise FACS de células sintéticas que produzem uma proteína marcadora fluorescente poderia ser realizada para fornecer valor quantitativo da fração de células sintéticas ativas. A análise da mancha ocidental mediria a produção de proteínas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Bioengenharia

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Caracterização biomecânica de tecidos moles Humanos Usando recuo e testes de tração

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

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Um microcontrolador operado dispositivo para a geração de extratos líquidos de aerossol de cigarro eletrônico e fumo cigarro convencional

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