Name: preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ERC-STG-2015-680242.
Författarna erkänner också stöd av Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; lastbil I. Lokey tvärvetenskapligt centrum för biovetenskap och teknik; Israel ekonomiministeriet för ett Kamin-bidrag (52752); Israels ministerium för vetenskapsteknik och rymdvetenskap – chefsforskarens kontor (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israeliska stiftelsen för vetenskaplig forskning och utveckling för ett GIF-barnbidrag (I-2328-1139.10/2012); Europeiska unionens IRG-program för karriärintegration (908049). Phospholipid Research Center Grant; en Rosenblatt Foundation for cancer research, en Mallat Family Foundation Grant; och Unger Family Foundation. A. Schroeder erkänner Alon och Taub Fellowships. O. Adir erkänner Sherman och Gutwirth stipendier. G. Chen erkänner Sherman Fellowship. N. Krinsky erkänner Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program från Rothschild Caesarea Foundation.

OBS: Illustration av hela det syntetiska cellernas produktionsprotokoll presenteras i figur 1. Enligt användarens behov kan också proteinuttrycket (avsnitt 3.2) och syntetisk cellbildning (avsnitt 4) av protokollet utföras oberoende av dem (med vissa anpassningar).
1. Beredning av S30-T7 lysate
<ol><li>Streak plattan E. coli BL21(DE3) bakterier omvandlas med T7 RNA polymeras uttrycker pAR1219 plasmid på en LB-agar platta kompletteras med 50 μg/mL a...

<ol>
	<li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+synthetic+cells.">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li><li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes.">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li><li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Inside+Liposomes:+From+Early+Studies+to+Current+Protocols.">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li><li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine.">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system.">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1,6-bisphosphate+as+an+energy+source.">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system.">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li><li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li><li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+without+boundaries:+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research.">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li><li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells:+a+review.">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li><li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells.">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li><li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells.">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li><li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+by+directed+evolution.">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion.">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li><li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=While-you-wait+proteins?+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need.">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors.">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).</li><li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system.">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li><li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models.">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li><li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip.">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447 (2016).</li><li>Go&#776;pfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells.">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li><li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins.">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).</li><li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+(1,3)-beta-d-glucan+(curdlan)+synthase:+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs.">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li><li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein:+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes.">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry.">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li><li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li><li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis.">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).</li><li>P&#233;delacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li><li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li><li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets.">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).</li><li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells.">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167 (2017).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li></ol>

Detta protokoll inför en enkel och prisvärd metod för produktion av stora mängder proteinproducerande syntetiska celler. Avkastningen av aktiva celler är beroende av noggrann och korrekt utförande av protokollet med betoning på flera kritiska steg. I lysate förberedelse delen av denna metod, är det viktigt att nå lämplig bakteriedensitet innan celllys för att uppnå en tillräcklig mängd proteiner i den bakteriella lysate. För det andra bör lysprocessen utföras vid 4 °C och lysate fryst snabbt med flytan...

Syntetiska celler är konstgjorda cellliknande partiklar, härma en eller flera funktioner i en levande cell, såsom förmågan att dela, bilda membran interaktioner, och syntetisera proteiner baserat på en genetisk kod1,2,3. Syntetiska celler som omsluter cellfria proteinsyntessystem (CFPS) har hög modularitet på grund av deras förmåga att producera olika proteiner och RNA-sekvenser efter förändringar i DNA-mallen. Cfps-system bygger på celllystnat, renade komponenter eller syntetiska komponenter och omfattar alla transkriptions- och översättningsmaskiner som krävs för proteinsyntes såsom ribosomer, RNA-polymeras, aminosyror och energikällor (t.ex. 3-fosfoglycerat och adenintriphosfat)4,,5,,6,,7,8,9. Inkapslingen av ett CFPS-system inuti lipidblåsor möjliggör enkel och effektiv produktion av proteiner utan att vara beroende av en levande cell10. Dessutom tillåter denna plattform syntes av peptider som kan försämras inuti naturliga celler, produktion av proteiner som är giftiga för levande celler, och ändra proteiner med icke-naturliga aminosyror11,12. Syntetiska celler har använts som modell för forskningsändamål som undersöker de minimala cellkomponenter som krävs för att möjliggöra cellliv ur ett evolutionärt perspektiv1,13. Syntetiska celler har också använts för att bygga och genomföra genetisk krets och som modeller för riktad evolution14,,15,16. Andra studier har fokuserat på syntetiska cellers förmåga att efterlikna den biologiska aktiviteten hos naturliga celler, som syftar till att ersätta skadade naturliga celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes17. Dessutom visar förmågan hos dessa CFPS som kapslar in syntetiska celler att producera en mängd olika terapeutiska proteiner dess potential att införlivas i klinisk användning18.
Här beskriver vi ett bottom-up lab-skala protokoll (figur 1) för produktion av RNA och proteinproducerande syntetiska celler baserat på en CFPS system inkapslade i en lipid vesikel. Detta visar den potentiella användningen av syntetiska cellplattformar som nya drug delivery-system för produktion på plats av ett terapeutiskt proteinläkemedel in vivo19. Tidigare studier har undersökt optimering av CFPS-reaktionen och cell lysate förberedelseprocesserna4,,8,20. Dessutom har flera tekniker tillämpats för cellstor liposomberedning, såsom mikrofluidiska och polymerbaserade droppstabiliseringsmetoder21,22,23, som också skiljer sig åt i liposomernas lipidsammansättning24,,25,26. I det presenterade protokollet produceras syntetiska celler med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod och inkapslingsprocessen utförs vid låga temperaturer (<4 °C)5,,10,,24,27,28. Dessa milda förhållanden har visat sig vara gynnsamma för att behålla den biologiska funktionella integriteten hos det molekylära maskineriet, nämligen ribosomer och proteiner27,29,30. Partiklarnas lipidsammansättning består av både kolesterol och 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den första finns i alla däggdjurscellmembran och är nödvändig för att membranet ska kunna minska stabiliteten, styvheten och permeabiliteten, och den senare efterliknar phospholipidsammansättningen11,,13. Den cellulära transkription och översättning molekylära maskiner extraheras från BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, som omvandlas med pAR1219 plasmid överuttryckA T7 RNA polymeras att öka CFPS potens och proteinsyntes. Detta system har använts för att producera diagnostiska och terapeutiska proteiner, med molekylvikter på upp till 66 kDa in vitro och in vivo19,31. Följande protokoll ger en enkel och effektiv metod för produktion av syntetiska cellsystemet, som kan ta itu med ett brett spektrum av grundläggande frågor i samband med proteinsyntes i naturen och kan också användas för drug delivery applikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E.coli BL21 (DE3)&#160;</td>
			<td >NEB</td>
			<td >C2527</td>
			<td >E.coli BL21 (DE3).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pAR1219</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T2076</td>
			<td >TargeTron vector for transformation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
			<td >Stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="5" >For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 g/L Agar agar purified</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.01614.5007</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="4" >For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 g/L Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td>19030591</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 g/L Bacto-tryptone</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >211705</td>
			<td rowspan="6" >For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24 g/L Bacto-Yeast extract</td>
			<td >BD Bioscience&#160;</td>
			<td >212750</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% (v/v) Glycerol anhydrous</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >7120501</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2.32 g/L K2HPO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1383</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12.54 g/L KH2PO4</td>
			<td>Spectrum chemical</td>
			<td>P1380</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#160;50 &#181;g/mL Ampicillin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A9518</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&#160;</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
			<td >Filtered using 0.2 &#181;m hydrophilic PVDF syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mM Tris-acetate at pH = 7.4</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T1503</td>
			<td rowspan="5" >S30 lysate buffer (1.5 L)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14 mM magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60 mM potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mM DTT</td>
			<td >TCI</td>
			<td >D1071</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 mL/L 2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M6250</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mL sterilized Erlenmeyer flasks</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >50-154-2846</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles</td>
			<td >KIMAX-KIMBLE</td>
			<td >25630</td>
			<td >2 flasks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Floor incubator shaker</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 
			Should enable at least 13,000 x g.&#160;&#160;&#160;&#160; * Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High pressure homogenizer</td>
			<td >AVESTIN</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td >Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >-80oC freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrophotometer</td>
			<td >TECAN</td>
			<td >IN-MNANO</td>
			<td >Infinite M200 pro</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well transparent plate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized graduated cylinder</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized centrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Preferably pre-cooled to -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Small liquid nitrogen tank</td>
			<td>NALGENE</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td >Lipoid</td>
			<td >556400</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C8667</td>
			<td >Powder</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >3082301</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M5904</td>
			<td >Light oil</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >Equipment required for step 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating block</td>
			<td >TECHNE</td>
			<td >FDB03AD</td>
			<td >Pre-heated to 80 &#176;C. 
			Should enable controlled temperature.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td rowspan="2" >For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >9mm Screw Cap</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >C395R-09LC</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Spectrum</td>
			<td >H1089</td>
			<td rowspan="2" >1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td >Frutarom</td>
			<td >55290</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Magnesium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.05819.0250</td>
			<td >Co-factor and negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 M Potassium acetate</td>
			<td >Carlo Erba</td>
			<td >470147</td>
			<td >Negative charge stabilizor.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5.2 M Ammonium acetate</td>
			<td >Merck</td>
			<td >1.01116.1000</td>
			<td >Stabilizes negative charge.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)</td>
			<td >Merck</td>
			<td >8.07491.1000</td>
			<td >Increases the concentration of the macromolecules.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8877</td>
			<td >Secondary energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 17&#160; natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Amino acids mixture II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>LAA21-1KT</td>
			<td >Amino acids additive. 
			Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Adenine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3377</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mM Guanidine triphosphate (GTP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td >Nucleotides &#38; energy source.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Uridine triphosphate (UTP)</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>226310010</td>
			<td >Nucleotides additive.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 mM Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td >INALCO</td>
			<td >INA-1758-1400</td>
			<td >Genes expression induction.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Sucrose</td>
			<td >J.T. Baker</td>
			<td >1933078</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 M Glucose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >16301</td>
			<td >Generating a density gradient.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >H2O UltraPure Water (UPW)</td>
			<td >Bio-Lab</td>
			<td >2321777500</td>
			<td >DNase &#38; RNase free</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S30-T7 lysate</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Prepared at step 1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Source of transcription &#38; translation components. 
			Store at -80 &#176;c, thaw on crashed ice just before usage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stock of DNA plasmid of choice</td>
			<td >_</td>
			<td >_</td>
			<td >Contains the sequence for the requested protein. 
			Under T7 promotor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="4" >D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Floor incubator shaker or Thermomixer</td>
			<td >MRC</td>
			<td >TOU-120-2</td>
			<td >Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PHMT Grant Bio&#160;</td>
			<td >PSC18</td>
			<td >Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75004270</td>
			<td >(75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. 
			Suited for 15 mL sized tubes. 
			Preferably swinging buckets. 
			Should enable at least 1000 x g. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table centrifuge</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >75002420</td>
			<td >(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. 
			Suited for Eppendorf vials. 
			Pre-cooled to 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex mixer</td>
			<td >Scientific industries</td>
			<td >SI-0256</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crushed ice bucket</td>
			<td >Bel-Art</td>
			<td >M18848-4001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 mL screw neck glass vials</td>
			<td >CSI Analytical Innovations</td>
			<td >VT009M-1232</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile 15 mL plastic tubes</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >339651</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized 1.5 mL plastic tubes</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilized pipette tips</td>
			<td >Corning</td>
			<td ></td>
			<td >Sterilized by autoclave.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer

Den nedifrån och upp monteringsmetod för konstruktion av syntetiska celler är ett effektivt verktyg för att isolera och undersöka cellulära processer i en cell härma miljö. Vidare har utvecklingen av cellfria uttryckssystem visat förmåga att rekonstruera proteinproduktion, transkription och översättningsprocesser (DNA→RNA→protein) på ett kontrollerat sätt, utnyttja syntetisk biologi. Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda en cell-yttrandefrihet system, inklusive produktion av en potent bakteriell lysate och kapsla in denna lysate inuti kolesterol-rika lipid-baserade jätte unilamellar blåsor (GUVs) (dvs. stabila liposomer), att bilda syntetiska celler. I protokollet beskrivs metoderna för att förbereda komponenterna i de syntetiska cellerna, inklusive produktion av aktiva bakteriella lyserter, följt av en detaljerad steg-för-steg-beredning av de syntetiska cellerna baserat på en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod. Dessa underlättar produktionen av miljontals syntetiska celler på ett enkelt och prisvärt sätt med en hög mångsidighet för att producera olika typer av proteiner. De erhållna syntetiska cellerna kan användas för att undersöka protein/RNA-produktion och aktivitet i en isolerad miljö, i riktad evolution, och även som en kontrollerad drug delivery-plattform för on-demand-produktion av terapeutiska proteiner inuti kroppen.

Vi presenterar ett protokoll för beredning av syntetiska celler genom att kapsla in en S30-T7 CFPS system baserat på BL21 E. coli inuti lipid blåsor. En schematisk beskrivning av förberedelseprocessen som innehåller en bild av varje steg presenteras i figur 2. Framgången för den syntetiska cellberedningsprocessen är beroende av lämplig prestanda för varje steg och utförs av olika parametrar. Protokollet bör justeras för att rymma produktionen av ett visst protein.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer at JoVE.com

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Detta protokoll beskriver metod, material, utrustning och steg för nedifrån och upp-beredning av RNA och proteinproducerande syntetiska celler. Det inre vattenrummet i de syntetiska cellerna innehöll S30 bakteriella lysate inkapslade i en lipid bilayer (dvs. stabila liposomer), med hjälp av en vatten-i-olja emulsion överföringsmetod.

Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Proteinproducerande syntetiska celler erbjuder en mångsidig plattform för att studera livets ursprung samt syntetiska cellbaserade terapier för avancerad läkemedelsleverans. Denna metod är enkel och prisvärd för RNA och proteinuttryck och kan appliceras för onsite terapeutiska proteinproduktion direkt inuti kroppen. Systemen kan användas för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar från metabola sjukdomar och proteiner ersättningar till cancer och eventuellt diabetes.Det här flerstegsprotokollet har en definierad stopppunkt. När du utför det för första gången, rekommenderas att dela upp arbetet över flera dagar. Protokollet för syntetisk cellproduktion inleds med beredningen av den cellfria S30-T7-lysate.Därefter är membranet lipider och cellulära näringslösning beredda att simulera den inre miljön och att stödja proteinproduktion. Det sista steget är beredningen av de syntetiska cellerna själva. Förbered duplikat för startkulturer i 100 milliliter Erlenmeyerkolvar.Till varje kolv, tillsätt fem milliliter LB-media kompletterat med 50 mikrogram per milliliter ampicillin och inokulera med en enda E.coli-koloni. Odla kulturen över natten i en golvinkubator shaker på 250 rpm och 37 grader Celsius. Därefter förbereda två liter förbryllad Erlenmeyer kolvar som innehåller 500 milliliter tb media kompletteras med 50 mikrogram per milliliter ampicillin.Inokulera varje två liters kolv med en fem milliliter startodling. Placera kolvarna i en skakmaskin på 250 rpm och 37 grader Celsius. Övervaka kulturerna med jämna mellanrum med hjälp av en spektrofotometer och odla kulturerna till od600 mellan 0,8 och en.För att inducera T7-RNA-polymerasuttryck, tillsätt till varje kolv tre milliliter på 100 millimolar IPTG för att nå 0,6 millimolar. Fortsätt att odla kulturerna tills OD600 är ungefär fyra. Efter att kulturerna nått önskad optisk densitet, överför suspensionen från varje Erlenmeyerkolv till två 250 millilitersteriliserade centrifugrör.Centrifugera rören vid 7, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten. Resuspend varje pellet i 250 milliliter kall S30 lysate buffert med hjälp av en omrörare om så önskas.Centrifugera vid 7, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och respend alla pellets tillsammans i 15 milliliter av kall S30 lysate buffert. Filtrera suspensionen med hjälp av gasvävsdynor.Innan du fortsätter till nästa steg, förkyl tipsen i 1,5 milliliter injektionsflaska som kommer att behövas för förvaring av lysate. Homogenisera suspensionen två gånger. Använd ett arbetstryck på 15, 000 PSI med ett lufttryck på fyra bar för cellsbrott.Samla upp homogenatet. Tillsätt 100 mikroliter på 0,1 molar DTT per 10 milliliter av den homogeniserade suspensionen. Centrifugera upphängningen vid 24, 700 gånger g vid 30 minuter vid fyra grader Celsius.DTT och kloroform klassificeras som irriterande och skadliga och bör därför behandlas med omsorg. Kloroform som används senare i protokollet måste användas i ett område med rökextraktion. Om du vill bevara lysate-aktiviteten utför du steget snabbt.Placera 200 mikroliter alikvoter av supernatant i färdigkylda injektionsflaska och omedelbart knäppa frysa dem med flytande kväve. Förvara injektionsflaskan vid negativ 80 grader Celsius för framtida bruk. Separat lösa UPP POPC och kolesterol i kloroform vardera till en slutlig koncentration av 100 milligram per milliliter.Vortexa varje injektionsflaska separat. Kombinera komponenterna i en två milliliter glas injektionsflaska. Tillsätt 50 mikroliter av kolesterol-kloroformlösningen, 50 mikroliter av POPC-kloroformlösningen och 500 mikroliter av mineralolja.Vortexa injektionsflaskan, sedan för att avdunsta kloroformen, värm den i ungefär en timme vid 80 grader Celsius i en kemisk huva. Innan du påbörjar det syntetiska cellproduktionssteget, bered den yttre, förinre, och matningslösningar som beskrivs i manuskriptet. Placera sedan 1,2 milliliter av den yttre lösningen i ett 15 milliliter rör och tillsätt långsamt ett lager av 500 mikroliter lipider-i-olja-lösning från den första glasflaskan.Inkubera röret i rumstemperatur i 20 minuter. För att slutföra den inre lösningsberedningen, blanda på is till en slutlig volym på 100 mikroliter genom att tillsätta S30-T7-lysate och DNA-plasmid. Tillsätt 100 mikroliter av den inre lösningen med lysate och plasmid till den andra två milliliter glasflaskan med 500 mikroliter av lipider-i-olja-lösning.Pipett upp och ner kraftigt i en minut och sedan virvel för en minut på nivå fem. Efter inkubering av den resulterande emulsionen i 10 minuter på krossad is, tillsätt långsamt emulsionen ovanpå oljefasen i 15 milliliterröret. Centrifugera röret i 10 minuter vid 100 gånger g och fyra grader Celsius.Sedan centrifug i 10 minuter vid 400 gånger g och fyra grader Celsius. Vid centrifugeringens bör en pellet kunna observeras i botten av röret. För att extrahera pelleten, ta först bort överflödigt oljeskikt.Därefter laddar du en trimmad pipettspets med cirka 400 mikroliter ytterlösning och använd pipettspetsen för att samla pelleten, och frigör den yttre lösningen när pipettspetsen passerar genom oljefasen. Torka av pipettspetsen och överför pelleten till ett rent 1,5 milliliterrör. Centrifugera pelleten i 10 minuter vid 1, 000 gånger g och fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 100 mikroliter av utfodringslösning. För proteinuttryck, inkubera suspensionen i två timmar vid 37 grader Celsius utan att skaka. Plasmider som uttrycker modellen protein sfGFP och Renilla luciferas infördes i cell-free protein syntes, CFPS bulk reaktioner och syntetiska celler.Proteinproduktionen utvärderades med hjälp av flera metoder. Western blot analys upptäckt sfGFP His6 produktion i både CFPS bulk reaktioner och inuti syntetiska celler. Renad sfGFP His6 användes som en positiv kontroll.Ett fluorescerande mikroskop med ett Brightfield och ett GFP-filter visar syntetiska celler som producerar sfGFP. Flow cytometry användes för att analysera sfGFP producerar syntetiska celler. Beräkning av den aktiva syntetiska cellpopulationen baserades på tröskelvärdet för sfGFP-fluorescensintensitet som definieras av det negativa DNA-provet som representeras av det röda histogrammet.Genomsnittlig fluorescensintensitet hos sfGFP producerar syntetiska celler beräknades från den aktiva syntetiska cellen befolkningen och normaliseras till det negativa DNA-provet. Diameterfördelningarna för de aktiva syntetiska cellerna beräknades baserat på sfGFP-signalen. Renilla luciferase verksamhet kvantifierades med lumininde mätningar.Denna metod är mycket mångsidig och kan optimeras för olika målproteiner genom att ändra lysate ursprung, lipidsammansättning och inre lösningskoncentrationer. FACS analys av syntetiska celler som producerar ett fluorescerande markörprotein skulle kunna utföras för att ge kvantitativt värde av fraktionen av aktiva syntetiska celler. Western blot analys skulle mäta proteinproduktion.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Använda en Polydimetylsiloxan (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Avgivning av terapeutiska siRNA mot CNS Använda katjoniska och anjoniska liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomekanisk karakterisering av mänskliga mjuka vävnader med hjälp av indrag och dragprovning

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Använda Syntetisk biologi ingenjör levande celler som har gränssnitt programmerbara material

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En mikrokontroller drivs enhet för generering av flytande extrakt från konventionella cigarett rök och elektronisk cigarett Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Förberedelse, rening och användning av fettsyra-innehållande liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellfria Protein uttryck med den snabbt växande bakterien Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo syntes av peptid membran prekursorer för autonoma vesikler tillväxt

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...