Name: delivery of modified mrna in a myocardial infarction mouse model
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model at JoVE.com

作者感谢安·阿努·库里安帮助这份手稿。这项工作由授予赞吉实验室的心脏病学启动赠款以及NIH授予R01 HL142768-01资助。

这里概述的所有动物程序都已获得西奈山机构护理和使用委员会的伊坎医学院的批准。
1. 模RNA的合成
注：modRNA合成的细节可以在Kondrat等人13中找到。
<ol><li>订购质粒模板 （材料表），并生成干净的 PCR 产品用作 mRNA 模板。</li>
	<li>通过体外转录准备modRNA，并定制如下核苷混合物（材料表）：T7转录试剂盒， 6 mM...

<ol>
	<li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors.">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li><li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors.">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li><li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+Immune+Response+to+AAV.">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).</li><li>Diebold, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction.">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li><li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration.">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li><li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery.">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li><li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes.">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).</li></ol>

基因治疗在显著推进心脏病治疗方面显示出巨大的潜力。然而，在治疗HF的最初临床试验中使用的传统工具已证明成功有限，并与严重的副作用有关。修饰RNA呈现非病毒基因传递，作为心脏的基因转移工具越来越受欢迎。ModRNA不需要基因的核定位进行翻译，因此提供有效和快速的蛋白质表达。此外，由于mRNA不集成到基因组宿主中，modRNA的基因传递跳过了诱变的风险。因此，由于其比传统的基因传?...

基因治疗是一种强大的工具，涉及核酸的传递，用于治疗、治愈或预防人类疾病。尽管在心脏病的诊断和治疗方法方面取得了进展，但在心肌梗死（MI）和心力衰竭（HF）的基因传递方面，成功程度有限。与基因治疗过程一样简单，考虑到在使用特定交付工具之前需要优化的许多因素，这种方法显然很复杂。正确的传递载体应该是非免疫性、高效性和稳定的人体内部。这一领域的努力产生了两种类型的输送系统：病毒或非病毒。广泛使用的病毒系统，包括腺病毒、逆转录病毒、扁病毒或腺相关病毒的基因转移，都显示出了特殊的转导能力。然而，由于诱导的强免疫反应1、肿瘤发生的风险2或中和抗体3的存在，这些抗体在诊所的使用是有限的，所有这些都仍然是病毒载体在人类基因治疗中广泛和有效应用的主要障碍。另一方面，尽管其令人印象深刻的表达模式，裸质质质DNA的传递显示低转染效率，而mRNA转移表现出高免疫原性和易退化的RNase4。
随着mRNA领域的广泛研究，modRNA因其比传统载体5具有许多优势，已成为将基因输送到心脏和各种其他器官的诱人工具。用自然产生的伪尿丁完全取代尿氨酸，导致更健壮和瞬态的蛋白质表达，与自然免疫反应的最小诱导和基因组整合的风险6。最近建立的协议使用优化量的抗反向帽模拟（ARCA），通过提高合成mRNA7的稳定性和可转换性，进一步增强蛋白质的转化。
以前的报告已经表明，在MI之后，modRNA在啮齿动物心肌中传递的各种报告器或功能基因的表达。在ModRNA应用方面，心肌病的显著区域，包括心肌细胞和非心肌细胞，已成功转染后心肌损伤8，诱导血管生成9,9，10，心脏细胞生存11，和心肌细胞增殖12。单次为突变的人类卵泡素1编码的modRNA，可诱导小鼠成年CM的增殖，并显著增加心脏功能，减少疤痕大小，并增加MI12后4周的毛细管密度。最近的一项研究报告说，在MI之后，在猪模型10中应用VEGFA modRNA，心脏功能有所改善。
因此，随着modRNA在心脏领域的日益普及，开发和优化一种将modRNA输送到MI后心脏的协议至关重要。 Herein是一种描述生物相容性酸碱制剂中纯化和优化的modRNA制备和输送的协议，提供健壮、稳定的蛋白质表达，而不会刺激任何免疫反应。本协议和视频中所示的方法演示了小鼠MI的标准外科程序，通过左前部下部动脉（LAD）的永久连接，然后是三个部位的心肌注射modRNA。本文旨在明确定义一种高度准确和可重复的modRNA输送方法，以达到小鼠心肌，使modRNA的应用在心脏基因治疗中广泛普及。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>N-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescense imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>IVIS100 charge-coupled device imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac tropnin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Anesthesia System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps- Adson</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps- Dumont #7</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>5X MEGAscript T7 Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intubation cannula</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaclear kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-4279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-methylpseudouridine-5-triphosphate</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>N-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen hegar needle holder with suture scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid templates</td>
			<td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14200-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y433H</td>
			<td>5.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y432H</td>
			<td>6.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>7733G</td>
			<td>7.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNase enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape station</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription clean up kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>Megaclear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-4 centrifugal filters 10k</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC801096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of modified mrna in a myocardial infarction mouse model

心肌梗死（MI）是西方世界发病率和死亡率的主要原因。在过去十年中，基因治疗因其效率和卓越的治疗效果而成为心脏病的一种有前途的治疗选择。为了修复MI后受损的组织，各种研究采用了基于DNA或病毒基因疗法，但由于传递基因表达不力且不受控制，因此面临相当大的障碍。水肿、心律失常和心脏肥大。合成改性mRNA（modRNA）是一种新型的基因治疗方法，为心脏组织提供高、瞬态、安全、非免疫和受控的mRNA传递，没有任何基因组整合的风险。由于这些显著的特点，结合其钟形药代动力学在心脏，modRNA已成为一个有吸引力的方法治疗心脏病。然而，为了提高其在体内的有效性，需要遵循一致和可靠的交付方法。因此，为了最大限度地提高modRNA在体内应用中的modRNA输送效率和屈服一致性，提出了小鼠MI模型中一种优化的modRNA心脏内注射制备和传递方法。该协议将使modRNA交付更容易获得基础和转化研究。

八到十周大的老鼠被麻醉了二分线素和插管。动物麻醉后，左胸区被用乙醇进行扫描和消毒，心脏被暴露为LAD结扎。左冠状动脉被动脉下缝合牢固地缝合（图表示图1A）。成功进入后（由左心室自由壁的支爱表示），直接注射100μg的Luc或Cre modRNA溶解在蔗糖酸液中，使用胰岛素注射器直接输送到三个不同部位的心肌（图1B）。使用modRNA注射的MI程序每只动...

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Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

该协议提供了一种简单和连贯的方法，在小鼠心肌梗死后，使用modRNA暂时调节感兴趣的基因。

在心肌梗死小鼠模型中传递修正的mRNA

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

改性RNA是一种将基因转移到心脏和其他器官的新方法。该协议将提供准确的方法，将所需的基因暂时传递到心脏，心肌梗塞后。该方法不仅限于心肌梗塞，还可应用于缺血再灌注和横向大体收缩模型。改性RNA正被用于几个人体临床试验。然而，没有标准化的协议，基因转移到心脏使用这种方法。视觉演示将使研究人员能够正确注射修饰的RNA在心脏的适当位点。展示蛋白库的将是阿吉特·马加杜姆，一个博士后研究员，和埃琳娜·切普尔科，一个动物主管从我们的实验室。根据以前在 modRNA 中准备的浓度，计算 100 微克注射所需的 modRNA 体积。生产同等体积的蔗糖和柠檬酸盐溶液。然后添加计算的模组RNA体积，并加入足够的盐水溶液，使注射量达到60微升。麻醉动物后，将其腹侧朝上，嘴朝向实验者。然后通过进行内切管保持空道，轻轻拉出舌头。调整颈部的角度，拉直插管路径，并推入插管。观察小鼠的胸腔运动，以验证两个肺是否都接受氧气。呼吸速率应约为每分钟120次呼吸。要开始 LAD 连接，请小心地将鼠标转向右侧。抬起皮肤，并在第三排和第四肋骨之间进行左侧胸腔切除术。小心地打开胸部，不要用任何锋利的物体接触肺部。将缩回器放入切口，以保持胸腔开放，提供心脏的清晰视图。接下来，将肺移动到切口的边缘，并切除覆盖心脏的心包囊部分。仔细识别 LAD，一个深浅的红色容器，位于肺动脉和左动脉之间。用一个丝绸缝合线将近近的LAD缝合。使用胰岛素注射器，向心脏总共提供60微升的modRNA溶液。在三个不同的地点注射20微升肌肉。连接两侧的站点和心脏顶点上的一个站点。将修改后的RNA注射到正确的位点的最佳方法，是在LAD遮挡后，观察在显微镜下组织的变色。此外，当注射时，不要深入到组织，以达到心脏腔进入循环。在层中关闭胸切口。第一次使用是 6 - 0 丝绸运行缝合线， 以适应肋骨。然后使用5-0丝线缝合线关闭皮肤。对于恢复阶段，取出管，并允许自发呼吸。将动物放在加热垫上，直到它恢复知觉。在动物完全清醒之前，不要让动物无人看管。为了管理手术后疼痛，每隔12小时注射丁丙诺啡皮下三天。每公斤体重0.1毫克。在CFW小鼠的LAD结扎和注射荧光素酶模组24小时后，通过使用生物发光成像系统检查荧光酶蛋白表达，验证了转染。与注射荧光素模组RNA的小鼠相比，在比较对照小鼠的图像中可以清楚地检测到荧光素酶信号。白化酶信号的定量显示，治疗小鼠的蛋白质表达明显高于对照小鼠。通过检查其在转基因 ROSA26 mTmG 小鼠中的翻译和生物分布，验证了 Cre modRNA 表达。手术后24小时和cre modRNA注射，艺术被修复和处理免疫着色与心肌细胞标记，心脏肌蛋白I，和核标记DAPI。由于绿色心肌细胞的出现，成功的cre表达是显而易见的。合并的图像显示两个可见注射部位周围的 cre 激活细胞。蓝色是核污渍 DAPI 。经过修改的RNA平台可以在各种器官中提供单个基因或基因组合。因此，可用于治疗目的，如纠正遗传性疾病，或激活体内的有益机制。改性RNA独特的药代动力学使我们能够在注射后立即评估基因功能。这使得研究人员能够瞄准信号通路，这些通路在梗死的最初几个小时内被改变。

Research

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Genetics

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科研

遗传学

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斑马斑马模型系统中 CRISPR/Cas9-generated 基因挖空的高效生产与鉴定

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

基于生物素的下拉法对细胞 miRNAs mRNA 靶点的验证

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