Name: delivery of modified mrna in a myocardial infarction mouse model
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model at JoVE.com

De auteurs erkennen Ann Anu Kurian voor haar hulp met dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een cardiologie start-up subsidie toegekend aan het Zangi laboratorium en ook door NIH subsidie R01 HL142768-01

Alle dierprocedures die hier zijn beschreven zijn goedgekeurd door Icahn School of Medicine op mount Sinai Institutional Care and Use Committee.
1. Synthese van modRNA
OPMERKING: De details van modRNA synthese zijn te vinden in Kondrat et al.13.
<ol><li>Bestel de plasmide sjablonen(Tabel van materialen) en het genereren van een schoon PCR-product te gebruiken als de mRNA-sjabloon.</li>
	<li>Bereid de modRNAs door transcript...

<ol>
	<li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors.">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li><li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors.">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li><li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+Immune+Response+to+AAV.">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).</li><li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides.">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li><li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart.">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy.">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA.">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li><li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction.">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li><li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine.">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li><li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction.">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li><li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration.">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li><li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery.">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li><li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes.">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).</li></ol>

Gentherapie heeft aangetoond enorm potentieel om aanzienlijk te bevorderen van de behandeling van hart-en vaatziekten. Echter, traditionele instrumenten die worden gebruikt in de eerste klinische studies voor de behandeling van HF hebben aangetoond beperkt succes en worden geassocieerd met ernstige bijwerkingen. Gemodificeerd RNA presenteert een niet-virale genlevering die voortdurend aan populariteit wint als een genoverdrachtsinstrument in het hart. ModRNA vereist geen nucleaire lokalisatie van genen voor vertaling, en...

Gentherapie is een krachtig instrument waarbij de levering van nucleïnezuren voor de behandeling, genezing, of preventie van menselijke ziekten. Ondanks de vooruitgang in de diagnostische en therapeutische benaderingen voor hart-en vaatziekten, is er beperkt succes in de levering van genen in hartinfarct (MI) en hartfalen (HF). Zo eenvoudig als het proces van gentherapie lijkt, het is een duidelijk complexe aanpak gezien de vele factoren die moeten worden geoptimaliseerd voordat u een bepaald leveringsvoertuig in dienst neemt. De juiste toedoogd moet niet-immunogeen, efficiënt en stabiel zijn in het menselijk lichaam. Inspanningen op dit gebied hebben geleid tot twee soorten leveringssystemen: virale of niet-virale. De veelgebruikte virale systemen, met inbegrip van genoverdracht door adenovirus, retrovirus, lentivirus, of adeno-geassocieerd virus, hebben aangetoond uitzonderlijke transduction capaciteit. Het gebruik ervan in klinieken is echter beperkt als gevolg van de sterke immuunrespons geïnduceerde1, risico op tumorigenese2, of de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen3, die allemaal een groot obstakel blijven voor een brede en effectieve toepassing van virale vectoren in menselijke gentherapie. Aan de andere kant, ondanks hun indrukwekkende expressie patroon, de levering van naakte plasmiDE DNA toont een lage transfectie efficiëntie, terwijl mRNA overdracht presenteert een hoge immunogeniciteit en gevoeligheid voor afbraak door RNase4.
Met het uitgebreide onderzoek op het gebied van mRNA is modRNA een aantrekkelijk instrument geworden voor de levering van genen aan het hart en diverse andere organen vanwege de vele voordelen ten opzichte van traditionele vectoren5. Volledige vervanging van uridine door natuurlijk voorkomende pseudouridine resulteert in een robuustere en voorbijgaande eiwitexpressie, met minimale inductie van aangeboren immuunrespons en risico op genomische integratie6. Recent vastgestelde protocollen maken gebruik van een geoptimaliseerde hoeveelheid anti-reverse cap analog (ARCA) die de eiwitvertaling verder verbetert door de stabiliteit en transabiliteit van het synthetische mRNA7te verhogen.
Eerdere rapporten hebben aangetoond dat de uitdrukking van verschillende verslaggever of functionele genen geleverd door modRNA in het knaagdier myocardium na MI. Met modRNA-toepassingen zijn belangrijke gebieden van het myocardium, waaronder zowel cardiomyocyten als noncardiomyocyten, met succes doorgetransfecteerd na hartletsel8 om angiogenese9,10,hartceloverleving11en cardiomyocyte proliferatie12te induceren . Een enkele toediening van modRNA gecodeerd voor gemuteerde menselijke follistatine-achtige 1 induceert de proliferatie van muis volwassen CMs en aanzienlijk verhoogt de cardiale functie, vermindert litteken grootte, en verhoogt capillaire dichtheid 4 weken na MI12. Een meer recente studie gemeld verbeterde cardiale functie na MI met toepassing van VEGFA modRNA in een varkens model10.
Dus, met de toegenomen populariteit van modRNA in het hartveld, is het essentieel om een protocol te ontwikkelen en te optimaliseren voor de levering van modRNA aan het hart post-MI. Herein is een protocol dat de voorbereiding en levering van gezuiverde en geoptimaliseerde modRNA beschrijft in een biocompatibele citraat-zoutoplossing die robuuste, stabiele eiwitexpressie biedt zonder enige immuunrespons te stimuleren. De methode in dit protocol en video toont de standaard chirurgische ingreep van een muis MI door permanente ligatie van de linker voorste aflopende slagader (LAD), gevolgd door drie site intracardiac injecties van modRNA. Het doel van dit document is om een zeer nauwkeurige en reproduceerbare methode van modRNA levering aan murine myocardium duidelijk te definiëren om modRNA toepassing wijd toegankelijk voor hartgentherapie te maken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>N-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescense imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>IVIS100 charge-coupled device imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac tropnin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Anesthesia System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps- Adson</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps- Dumont #7</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>5X MEGAscript T7 Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intubation cannula</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaclear kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-4279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-methylpseudouridine-5-triphosphate</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>N-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen hegar needle holder with suture scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid templates</td>
			<td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14200-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y433H</td>
			<td>5.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y432H</td>
			<td>6.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>7733G</td>
			<td>7.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNase enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape station</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription clean up kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>Megaclear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-4 centrifugal filters 10k</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC801096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of modified mrna in a myocardial infarction mouse model

Myocardiaal infarct (MI) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de westerse wereld. In het afgelopen decennium is gentherapie een veelbelovende behandelingsoptie geworden voor hart- en vaatziekten, vanwege de efficiëntie en uitzonderlijke therapeutische effecten. In een poging om het beschadigde weefsel post-MI te herstellen, hebben verschillende studies gebruik genomen van DNA-gebaseerde of virale gentherapie, maar hebben aanzienlijke hindernissen ondervonden als gevolg van de slechte en ongecontroleerde expressie van de geleverde genen, oedeem, aritmie en cardiale hypertrofie. Synthetische gemodificeerde mRNA (modRNA) presenteert een nieuwe gentherapie benadering die hoge, voorbijgaande, veilige, niet-immunogenic, en gecontroleerde mRNA levering aan het hartweefsel biedt zonder enig risico van genomische integratie. Door deze opmerkelijke kenmerken in combinatie met de klokvormige farmacokinetiek in het hart is modRNA een aantrekkelijke aanpak geworden voor de behandeling van hartziekten. Om de effectiviteit ervan in vivo te vergroten, moet echter een consistente en betrouwbare leveringsmethode worden gevolgd. Om de modRNA-leveringsefficiëntie en de consistentie van modRNA voor in vivo-toepassingen te maximaliseren, wordt daarom een geoptimaliseerde methode voor voorbereiding en levering van modRNA intracardiac-injectie in een muis-MI-model gepresenteerd. Dit protocol zal modRNA levering toegankelijker maken voor fundamenteel en translationeel onderzoek.

Acht tot tien weken oude muizen werden verdoofd met isoflurane en geïntubeerd. Nadat het dier onder narcose was, werd het linker thoracale gebied geschoren en gesteriliseerd met ethanol, en het hart werd blootgesteld voor LAD ligatie. De linker kransslagader werd afgesloten door stevig knopen van de hechting onder de slagader (diagram vertegenwoordiging Figuur 1A). Na een succesvol infarct (aangegeven door de paling van de linker ventriculaire vrije muur), werd een directe injectie van 100 ...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model at JoVE.com

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Dit protocol presenteert een eenvoudige en coherente manier om een gen van belang te upreguleren met behulp van modRNA na een hartinfarct bij muizen.

Levering van gemodificeerd mRNA in een myocardikoesmodel

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Gemodificeerd RNA is een nieuwe methode voor genoverdracht naar het hart en andere organen. Dit protocol zal nauwkeurige aanpak van het leveren van gewenste genen tijdelijk naar het hart, post myocardiaal infarct. Deze methode is niet beperkt tot een hartinfarct, maar kan ook worden toegepast op ischemie reperfusie, en transversale aorta vernauwing modellen.Gemodificeerd RNA wordt gebruikt in verschillende menselijke klinische studies. Er is echter geen gestandaardiseerd protocol voor gen overgebracht naar het hart met behulp van deze methode. Visuele demonstratie zal onderzoekers in staat stellen om gemodificeerd RNA correct te injecteren op geschikte plaatsen in het hart.Het demonstreren van de procedule zal Ajit Magadum, een postdoctoraal collega, en Elena Chepurko een dieren supervisor van ons laboratorium. Op basis van de concentratie van de eerder bereid op modRNA, bereken het volume van modRNA die nodig is voor een 100 microgram injectie. Maakt gelijke volumes van sacharose en citraat oplossingen.Voeg vervolgens het berekende volume modRNA toe en voldoende zoutoplossing om het injectievolume op 60 microliter te brengen. Na het verdoven van het dier, plaats het ventrale kant omhoog, met zijn mond naar de experimentator gericht. Dan om een open luchtweg te behouden door intratracheale intubatie uit te voeren, trek voorzichtig de tong eruit.Pas de hoek van de nek aan om het intubatiepad recht te zetten en duw in de intubatie canule. Let op de thoracale beweging van de muis om te controleren of beide longen zuurstof ontvangen. De ademhalingsfrequentie moet ongeveer 120 ademhalingen per minuut bedragen.Om te beginnen met de LAD ligatie, draai de muis voorzichtig op de rechterkant. til de huid op en voer een linkszijdige thoracotomie uit tussen de derde en vierde ribben. Open de thorax voorzichtig, zonder de longen aan te raken met scherpe voorwerpen.Plaats oprolmechanismen in de incisie om de borstholte open te houden, waardoor een duidelijk zicht op het hart wordt geboden. Beweeg vervolgens de longen naar de rand van de incisie en verwijder het deel van de hartzak die het hart bedekt. Identificeer de LAD, een diep lichtrood vat, gelegen tussen de longslagader en de linker oorschelp.Ligate de proximale LAD met een enkele zijden hechting. Met behulp van een insulinespuit, leveren een totaal van 60 microliter van de modRNA oplossing aan het hart. Injecteer 20 microliters intramusculair, op drie verschillende locaties.Een site aan elke kant van de ligatie en een in de top van het hart. De beste manier om het gemodificeerde RNA op de juiste plaatsen te injecteren, is om de verkleuring van het weefsel onder microscoop te observeren, na de occlusie van LAD. Ook bij injectie, ga niet te diep in het weefsel om de hartkamers in de circulatie te bereiken.Sluit de thoracale incisie in lagen. Eerste gebruik was 6-0 zijde lopende hechtingen om de ribben aan te passen. Gebruik vervolgens 5-0 zijde lopende hechtingen om de huid te sluiten.Verwijder voor de herstelfase de canule en laat spontane ademhaling toe. Plaats het dier op een verwarmingskussen totdat het weer bij bewustzijn komt. Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het volledig wakker is.Om posturgical pijn te beheren, injecteer buprenorfine onderhuids met intervallen van 12 uur gedurende drie dagen. Bij een dosis van 0,1 milligram per kilogram lichaamsgewicht. 24 uur na LAD ligatie en injectie van luciferase modRNA in CFW muizen, werd transfectie gevalideerd door te controleren op luciferase eiwitexpressie met behulp van een bioluminescentie beeldvormingssysteem.Het luciferase signaal kan duidelijk worden gedetecteerd in beelden die controlemuizen vergelijken, met muizen geïnjecteerd met luciferase modRNA. Kwantificering van het luciferasesignaal toont een aanzienlijk hogere eiwitexpressie bij behandelde muizen dan bij controlemuizen. Cre modRNA expressie werd gevalideerd door het controleren van de vertaling en bio distributie in transgene ROSA26 mTmG muizen.24 uur na de operatie en cre modRNA injectie, werden kunsten vastgesteld en verwerkt voor immunostaining met cardiomyocyte marker, cardiale troponine I, en kernen marker DAPI. Succesvolle cre expressie was duidelijk te wijten aan het uiterlijk van groen gekleurde cardiomyocyten. Een samengevoegde afbeelding toont cre geactiveerde cellen rond de twee zichtbare injectieplaatsen.Blauw is de nucleaire vlek DAPI. Gemodificeerd RNA-platform kan één gen- of gencombinaties in verschillende organen leveren. En dus kan worden gebruikt voor therapeutische doeleinden, zoals het corrigeren van genetische aandoeningen, of het activeren van gunstige mechanismen in het lichaam.De unieke farmacokinetiek van gemodificeerd RNA stelt ons in staat om de genfunctie onmiddellijk na de injectie te evalueren. Dit stelt onderzoeker in staat om signaleringstrajecten te targeten, die in de eerste paar uur van het infarct worden gewijzigd.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigeren MARRVEL, een web-based tool die Human Genomics en model organisme genetica informatie integreert

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...