Name: delivery of modified mrna in a myocardial infarction mouse model
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model at JoVE.com

Gli autori riconoscono Ann Anu Kurian per il suo aiuto con questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio di cardiologia assegnata al laboratorio di zangi e anche dalla sovvenzione NIH R01 HL142768-01

Tutte le procedure sugli animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine del Comitato per la cura e l'uso istituzionale del Monte Sinai.
1. Sintesi di modRNA
NOTA: I dettagli della sintesi di modRNA sono disponibili in Kondrat etal.
<ol><li>Ordinare i modelli di plasmide (Tabella dei materiali) e generare un prodotto PCR pulito da utilizzare come modello mRNA.</li>
	<li>Preparare i modRNA per trasc...

<ol>
	<li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors.">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li><li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors.">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li><li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+Immune+Response+to+AAV.">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).</li><li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides.">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li><li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart.">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li><li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability.">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li><li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy.">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA.">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li><li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction.">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li><li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine.">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li><li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction.">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li><li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration.">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li><li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery.">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li><li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes.">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).</li></ol>

La terapia genica ha mostrato un enorme potenziale per far progredire significativamente il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, gli strumenti tradizionali impiegati negli studi clinici iniziali per il trattamento di HF hanno dimostrato un successo limitato e sono associati a gravi effetti collaterali. L'RNA modificato presenta una distribuzione di geni non virali che sta guadagnando continuamente popolarità come strumento di trasferimento genico nel cuore. ModRNA non richiede alcuna localizzazione nucleare d...

La terapia genica è un potente strumento che coinvolge la consegna di acidi nucleici per il trattamento, la cura o la prevenzione delle malattie umane. Nonostante i progressi compiuti negli approcci diagnostici e terapeutici per le malattie cardiache, c'è stato un successo limitato nella fornitura di geni nell'infarto miocardico (MI) e nell'insufficienza cardiaca (HF). Per quanto semplice sembri il processo di terapia genica, si tratta di un approccio marcatamente complesso considerando i molti fattori che devono essere ottimizzati prima di impiegare un particolare veicolo di consegna. Il vettore di consegna corretto deve essere non immunogenico, efficiente e stabile all'interno del corpo umano. Gli sforzi in questo campo hanno generato due tipi di sistemi di consegna: virali o non virali. I sistemi virali ampiamente utilizzati, tra cui il trasferimento genico mediante adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adeno-associato, hanno dimostrato un'eccezionale capacità di trasduzione. Tuttavia, il loro uso nelle cliniche è limitato a causa della forte risposta immunitaria indotta1, rischio di tumorigenesi2, o la presenza di anticorpi neutralizzanti3, che rimangono tutti un grande ostacolo all'applicazione ampia ed efficace di vettori virali nella terapia genica umana. D'altra parte, nonostante il loro impressionante modello di espressione, la consegna di DNA plasmide nudo mostra una bassa efficienza di trasfezione, mentre il trasferimento di mRNA presenta un'elevata immunogenicità e suscettibilità alla degradazione da parte di RNase4.
Con la vasta ricerca nel campo dell'mRNA, modRNA è diventato uno strumento attraente per la consegna di geni al cuore e vari altri organi a causa dei suoi numerosi vantaggi rispetto ai vettori tradizionali5. La sostituzione completa dell'uridina con pseudouridina naturale si traduce in un'espressione proteica più robusta e transitoria, con minima induzione di risposta immunitaria innata e rischio di integrazione genomica6. I protocolli stabiliti di recente utilizzano una quantità ottimizzata di analogico anti-tap-tap inganompio (ARCA) che migliora ulteriormente la traduzione delle proteine aumentando la stabilità e la transabilità del mRNA sintetico7.
Rapporti precedenti hanno dimostrato l'espressione di vari reporter o geni funzionali forniti da modRNA nel miocardio del roditore dopo l'MI. Con le applicazioni modRNA, aree significative del miocardio, tra cui cardiomiociti e non cardiomiociti, sono stati trasettati con successo lesioni post-cardiache8 per indurre l'angiogenesi9,10, la sopravvivenza delle cellule cardiache11, e la proliferazione cardiomiocite12. Una singola somministrazione di modRNA codificato per follistatina umana mutata 1 induce la proliferazione di TRI adulti topo e aumenta significativamente la funzione cardiaca, diminuisce la dimensione della cicatrice e aumenta la densità capillare 4 settimane dopo-MI12. Uno studio più recente ha riferito una migliore funzione cardiaca dopo l'MI con l'applicazione del modRNA VEGFA in un modello suina10.
Così, con la maggiore popolarità del modRNA in campo cardiaco, è essenziale sviluppare e ottimizzare un protocollo per la consegna di modRNA al cuore post-MI. Herein è un protocollo che descrive la preparazione e la consegna di modRNA purificato e ottimizzato in una formulazione citrate-salina biocompatibile che fornisce una robusta e stabile espressione proteica senza stimolare alcuna risposta immunitaria. Il metodo mostrato in questo protocollo e video dimostra la procedura chirurgica standard di un MI del mouse mediante legatura permanente dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), seguita da tre iniezioni intracardiache del sito di modRNA. L'obiettivo di questo documento è definire chiaramente un metodo altamente accurato e riproducibile di consegna del modRNA al miocardio murino per rendere l'applicazione del modRNA ampiamente accessibile per la terapia genica cardiaca.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic Phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>N-7003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescense imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>IVIS100 charge-coupled device imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>18200-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac tropnin I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>47003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Anesthesia System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>75-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps- Adson</td>
			<td>FST</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps- Dumont #7</td>
			<td>FST</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine triphosphate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>5X MEGAscript T7 Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intubation cannula</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaclear kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-4279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1-methylpseudouridine-5-triphosphate</td>
			<td>TriLink Biotechnologies</td>
			<td>N-1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen hegar needle holder with suture scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid templates</td>
			<td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14200-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y433H</td>
			<td>5.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y432H</td>
			<td>6.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>7733G</td>
			<td>7.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNase enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMB13345</td>
			<td>Included in Megascript kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape station</td>
			<td>Aligent</td>
			<td>4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription clean up kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1908</td>
			<td>Megaclear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-4 centrifugal filters 10k</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC801096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of modified mrna in a myocardial infarction mouse model

L'infarto miocardico (MI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale. Nell'ultimo decennio, la terapia genica è diventata un'opzione di trattamento promettente per le malattie cardiache, grazie alla sua efficienza e agli eccezionali effetti terapeutici. Nel tentativo di riparare il tessuto danneggiato post-MI, vari studi hanno impiegato la terapia genica virale o basata sul DNA, ma hanno affrontato notevoli ostacoli a causa della scarsa e incontrollata espressione dei geni consegnati, dell'edema, dell'aritmia e dell'ipertrofia cardiaca. L'mRNA modificato sintetico (modRNA) presenta un nuovo approccio alla terapia genica che offre un'elevata, transitoria, sicura, non immunogenica e controllata e controllata esodaal tessuto cardiaco senza alcun rischio di integrazione genomica. Grazie a queste notevoli caratteristiche combinate con la sua farmacocinetica a forma di campana nel cuore, il modRNA è diventato un approccio attraente per il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, per aumentare la sua efficacia in vivo, è necessario seguire un metodo di consegna coerente e affidabile. Quindi, per massimizzare l'efficienza di consegna del modRNA e la coerenza di rendimento nell'uso di modRNA per applicazioni in vivo, viene presentato un metodo ottimizzato di preparazione e somministrazione dell'iniezione intracardiaca del modRNA in un modello MI del mouse. Questo protocollo renderà la consegna di modRNA più accessibile per la ricerca di base e traslazionale.

I topi da otto a dieci settimane sono stati anestesizzati con isoflurane e intubati. Dopo che l'animale era sotto anestesia, la regione toracica sinistra è stata rasata e sterilizzata con etanolo, e il cuore è stato esposto per la legatura LAD. L'arteria coronaria sinistra è stata occlusa annoccando saldamente la sutura sotto l'arteria (rappresentazione diagramma Figura 1A). Dopo un infarto di successo (indicato dall'accoglimento della parete libera ventricolare sinistra), un'iniezione di...

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Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Questo protocollo presenta un modo semplice e coerente per eseguire l'upregolazione transitoria di un gene di interesse usando modRNA dopo l'infarto miocardico nei topi.

Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

L'RNA modificato è un nuovo metodo per il trasferimento genico al cuore e ad altri organi. Questo protocollo fornirà un approccio accurato per fornire i geni desiderati transitoriamente al cuore, post infarto del miocardio. Questo metodo non è limitato all'infarto del miocardio, ma può anche essere applicato alla riperfusione di ischemia e ai modelli di costrizione aortica trasversale.L'RNA modificato viene utilizzato in diversi studi clinici sull'uomo. Tuttavia, non esiste un protocollo standardizzato per il gene trasferito nel cuore usando questo metodo. La dimostrazione visiva consentirà ai ricercatori di iniettare correttamente RNA modificato in siti appropriati nel cuore.A dimostrare la procedura saranno Ajit Magadum, un post-dottorato, ed Elena Chepurko un supervisore animale del nostro laboratorio. Sulla base della concentrazione del modRNA precedentemente preparato, calcolare il volume di modRNA necessario per un'iniezione di 100 microgrammi. Produce volumi uguali di soluzioni di saccarosio e citrato.Quindi aggiungere il volume calcolato di modRNA e una soluzione salina sufficiente per portare il volume di iniezione a 60 microlitri. Dopo aver anestetizzato l'animale, posizionarlo lato ventrale verso l'alto, con la bocca rivolta verso lo sperimentatore. Quindi, per mantenere una via d'aria aperta eseguendo l'intubazione intratracheale, estrarre delicatamente la lingua.Regolare l'angolo del collo per raddrizzare il percorso di intubazione e spingere la cannula di intubazione. Osservare il movimento toracico del topo per verificare che entrambi i polmoni ricevano ossigeno. La frequenza respiratoria dovrebbe essere di circa 120 respiri al minuto.Per iniziare la legatura LAD, ruotare il mouse con attenzione sul lato destro. sollevare la pelle ed eseguire una toracotomia laterale sinistra tra la terza e la quarta costola. Aprire attentamente il torace, senza toccare i polmoni con oggetti appuntiti.Posizionare i retrattiri nell'incisione per mantenere aperta la cavità toracica, fornendo una visione chiara del cuore. Quindi, spostare i polmoni sul bordo dell'incisione e rimuovere la parte del sacco pericardico che copre il cuore. Identificare attentamente il LAD, un vaso rosso chiaro intenso, situato tra l'arteria polmonare e il padiglione auricolare sinistro.Legare il LAD prossimale con un'unica sutura di seta. Utilizzando una siringa per insulina, fornire un totale di 60 microlitri della soluzione di modRNA al cuore. Iniettare 20 microlitri per via intramuscolare, in tre siti diversi.Un sito su ciascun lato della legatura e uno all'apice del cuore. Il modo migliore per iniettare l'RNA modificato nei siti corretti, è osservare lo scolorimento del tessuto al microscopio, dopo l'occlusione del LAD. Anche se iniettato, non andare troppo in profondità nel tessuto per raggiungere le camere cardiache nella circolazione.Chiudere l'incisione toracica a strati. Il primo uso fu 6-0 suture da corsa in seta per adattare le costole. Quindi usa 5-0 suture da corsa in seta per chiudere la pelle.Per la fase di recupero, rimuovere la cannula e consentire la respirazione spontanea. Posizionare l'animale su una pastiglia riscaldante fino a quando non riprende conoscenza. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non è completamente sveglio.Per gestire il dolore postchirurgico, iniettare buprenorfina per via sottocutanea a intervalli di 12 ore per tre giorni. A una dose di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo. 24 ore dopo la legatura del LAD e l'iniezione di modRNA luciferasi nei topi CFW, la trasfezione è stata convalidata controllando l'espressione proteica della luciferasi utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza.Il segnale luciferasi può essere chiaramente rilevato nelle immagini che confrontano i topi di controllo, con topi iniettati con modRNA luciferasi. La quantificazione del segnale luciferasi mostra un'espressione proteica significativamente più elevata nei topi trattati che nei topi di controllo. L'espressione cre modRNA è stata convalidata controllandone la traduzione e la bio distribuzione nei topi transgenici ROSA26 mTmG.24 ore dopo l'intervento chirurgico e l'iniezione di cre modRNA, le arti sono state fissate ed elaborate per l'immunostaining con marcatore di cardiomiociti, troponina cardiaca I e marcatore di nuclei DAPI. L'espressione cre di successo era evidente a causa della comparsa di cardiomiociti di colore verde. Un'immagine unita mostra le celle attivate da Cre intorno ai due siti di iniezione visibili.Il blu è la macchia nucleare DAPI. La piattaforma di RNA modificata può fornire un singolo gene o combinazioni geniche in varietà di organi. E quindi può essere utilizzato per scopi terapeutici, come correggere i disturbi genetici o attivare meccanismi benefici nel corpo.L'esclusiva farmacocinetica dell'RNA modificato ci consente di valutare la funzione genica immediatamente dopo la sua iniezione. Ciò consente al ricercatore di indirizzare i percorsi di segnalazione, che vengono alterati nelle prime ore di infarto.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

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Ricerca

Genetica

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Produzione efficiente e identificazione di CRISPR/Cas9-generato Gene Ko nel sistema modello Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

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