Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

تم دعم الدراسة بأموال من جامعة كاليفورنيا، ديفيس، مركز الصحة الحيوانية المرافقة (CCAH 2018-30-F). يود المؤلفون أن ينوهوا بالدكتور كيفن وولارد لاستخدام المجهر الفلوري.

تم تنفيذ جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقًا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كاليفورنيا، ديفيس. وأجريت النُقاز وخزعات الأنسجة بموافقة المالكين.
1. تثبيت الأنسجة، والتضمين، وأقسام
<ol><li>تشريح التشعب الأبهري ، بما في ذلك الشريان الأورطي ...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

نحن نصف بروتوكول لتحديد NETs في خثرة الشرايين القلب ية الثابتة القطط باستخدام بروتوكول تسمية المناعة المزدوجة والمجهر الفلورات المناعية. على الرغم من أن فقط تجلط الشرايين القلبية كانت ملطخة، من الناحية النظرية يمكن استخدام هذا البروتوكول لأنواع أخرى من thrombi وفي الأنواع البيطرية الأخرى. يش...

القطط مع اعتلال عضلة القلب الضخامي هي في خطر من مضاعفات تجلط الدم المهددة للحياة1,2. على الرغم من ارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات المرتبطة بتجلط الشرايين القلبوية (CATE) ، فإن الفيزيولوجيا المرضية الكامنة في CATE في القطط غير مفهومة بشكل جيد. وهناك أيضا محدودة أدوات التشخيص والعلاج لعلاج وتحديد القطط المعرضة لخطر هذه الحالة المدمرة3.
بالإضافة إلى دورها في الحصانة الفطرية، وقد ثبت العدلات للعب دور في تجلط الدم من خلال الإفراج عن الفخاخ خارج الخلية العدلة (NETs)، والتي هي شبكات تشبه على شبكة الإنترنت من الحمض النووي خالية من الخلايا (cfDNA) مرصعة الهستون والبروتينات الحبيبية مثل العدلات الإيلاداس (NE) وmyeloperoxidase. العدلات الخضوع لتكوين NETs استجابة لالتهاب الجهازية، ومواجهة مباشرة مع مسببات الأمراض، والتفاعل معالصفائحالدموية المنشط4،,5،,6،,7. في الكلاب ، وقد ثبت الحمض النووي المستمدة من العدلات لمنع تجلط الجلطات ، في حين أن البروتينات NET تسريع تشكيل الجلطة. قدرة NETs على اعتراض الخلايا المتداولة ومكونات التخثر هو أيضا مفتاح لخصائصها تخثر8،9،10،11،12.
يتم الكشف عن NETs عن طريق توطين البروتينات العدلات خارج الخلية، الهستونات، وcfDNA. وبسبب هذا، فإن تحديد وقياس NETs في الأنسجة الثابتة عن طريق immunofluescence من الأنسجة deparaffinized متفوقة على الهيماتوكسيلين التقليدية والإيوسين (H & E) وصمة عار باستخدام المجهر حقل مشرق4،5. حددت العديد من الدراسات البشرية باستخدام المجهر المناعي NETsك المكونات الهيكلية للتجلط الشرياني التاجي، السكتة الدماغية الدماغية، التروثرومبوسيس، وتجلط الرثرة الوريدية13،14،15،16،17. وحتى الآن، لم يتم وصف طريقة موحدة للكشف عن الـ NETs وقياسها كمياً في ثثرم القطط. لأن تحديد NETs في تجلط الشرايين القلب والقلب القطط قد يسهل البحوث الانتقالية في المستقبل في NETs والتجلط، ونحن وصف تقنيات تحديد صافي وتقييم في تجلط الشرايين جزءا لا يتجزأ من البارافين في القطط.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

الفخاخ خارج الخلية العدلة (NETs)، تتألف من الحمض النووي خالية من الخلايا (cfDNA) والبروتينات مثل الهستونات واللاستاز العدلات (NE)، يتم تحريرها من قبل العدلات استجابة لالتهاب الجهازية أو مسببات الأمراض. على الرغم من أن NETs قد ثبت سابقا لزيادة تكوين الجلطة وتثبيط الانف في البشر والكلاب، ودور NETs في القطط مع تجلط الشرايين القلب (CATE)، وهي مضاعفات تهدد الحياة الثانوية لاعتلال عضلة القلب فرط التروب ، غير معروف. طريقة موحدة لتحديد وقياس NETs في تجلط الشرايين القلب في القطط سوف تعزز فهمنا لدورها المرضي في CATE. هنا ، نصف تقنية لتحديد NETs في الفورمالديهايد ثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من thrombi داخل بيثرة الأبهري ، المستخرجة أثناء النخر. بعد إزالة البارافينمع الزيلين، خضعت الأقسام الأبهرية لاسترجاع مستضد غير مباشر بسبب الحرارة. ثم تم حظر الأقسام ، permeabilized ، وex vivo NETs تم تحديدها عن طريق توطين الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) ، citrullinated histone H3 (citH3) ، وelastase العدلات (NE) باستخدام المجهر المناعي. لتحسين الكشف المناعي للNETs في thrombi ، تم الحد من الفلور اتمنامن عناصر الأنسجة باستخدام عملية إخماد الفلور الذاتي قبل المجهر. يمكن أن تكون هذه التقنية أداة مفيدة لدراسة NETs وتجلط الدم في الأنواع الأخرى وتقدم رؤى جديدة في الفيزيولوجيا المرضية لهذه الحالة المعقدة.

باستخدام هذا البروتوكول لdeparaffinization، استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة، وتسمية المناعة المزدوجة من thrombi البارافين المضمنة، حددنا NETs في FELINE CATE للمرة الأولى. تم تحديد موقع Thrombi داخل التشعب الأبهري عن طريق المجهر الفلوري والمجهر الميداني الساطع باستخدام تلطيخ H & E القياسي والمجهر التباين في ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

نحن نصف طريقة لتحديد الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) في الفورمالديهايد ثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من القلب القلب والقلب thrombi باستخدام استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة وبروتوكول تسمية المناعة المزدوجة.

تحديد الفخاخ نيوتروفيل خارج الخلية في البارافين جزءا لا يتجزأ من الخيط الشرياني Thrombi باستخدام المجهر Immunofluorescence

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

يمكن أن يكون هذا البروتوكول ل parafinization متبوعاً باسترجاع مستضد من أقسام الأبهر المضمّنة من البارافين أداة مفيدة لدراسة دور الفخاخ العدلية ثلاثي الخلايا في تجلط القطط. إن الكشف عن الفخاخ العدلية ثلاثية الخلايا عن طريق الفلوروس المناعي في الأنسجة الثابتة والمضمونة من البارافين، هو أعلى من الدعامات النسيجية التقليدية مثل HNE، لأنه يسمح بالكشف المتزامن للحمض النووي أكثر أمانًا والبروتينات خارج الخلية. ويمكن استخدام هذا البروتوكول في نوع آخر من الخثرات وفي الأنواع البيطرية الأخرى.تحديد الفخاخ العدلات خارج الخلية داخل الخثارة الشرايين القطط تشير إلى أنها قد تلعب دورا في تجلط الدم في القطط. البروتوكولات الواردة هنا هي مبادئ توجيهية. ونحن نشجع المحققين بقوة على تعديل مدة وظروف عملية استرجاع المستضدات لتوفير إشارة مرضية.لاستخدام نظام آلي لتنفيذ إزالة الرضاعةفينية وإعادة ترطيب المقاطع على الشرائح الزجاجية، ضع الشرائح الزجاجية في رفوف. غمر تماما في المالحة 100 في المئة لمدة ثلاث دقائق. كرر هذه الخطوة مرتين.لا تشطف بين الخطوات. غمر تماما في انخفاض تركيزات الإيثانول في درجة حرارة الغرفة ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل من. غمر تماما في المياه ديونيد لمدة دقيقتين وكرر مرة أخرى واحدة.بعد العلاج مع TBST، ملء الخزان مع المياه ديونة ساخنة إلى 100 درجة مئوية. السماح لغرفة باخرة لتكدير لمدة 20 دقيقة. على لوحة الحرارة، تسخين محلول استرجاع المستضد المتاحة تجاريا التي تحتوي على تريس وEDTA في درجة حرارة 9.0 إلى 95 إلى 97 درجة مئوية.تأكد من عدم غليه. Suberge الشرائح تماما في حل استرجاع المستضد ساخنة ومواصلة تطبيق التدفئة الخارجية عبر باخرة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة خمس دقائق.الآن، ضع المقاطع في حظر المخزن المؤقت 1. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة تحت هزاز لطيف بين 30 و 50 دورة في الدقيقة. دون غسل، وتطبيق الفور 100 ميكرولترات من الأرانب المخففة المضادة للجسم المضادة للجسم citrullinated H3 هيستون مباشرة على الشريحة.ضع زلة غطاء على كل قسم للسماح بالتوزيع حتى لخليط الأجسام المضادة. احتضان لمدة 12 إلى 16 ساعة في أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف. بعد ذلك، قم بغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة خمس دقائق كل مرة.لتطبيق الأجسام المضادة، استخدم الأنابيب وتوزيع بالتساوي 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة للماعز المضادة للأرنب مترافق إلى أليكسا فلور 488. تغطية الشرائح مع احباط القصدير واحتضان الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تحت هزاز لطيف. بعد الغسيل مع TBST وفقا للمخطوطة، احتضان الأقسام في منع العازلة 2 بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تحت هزاز لطيف.حماية من الضوء. اغسل مع TBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. منع المقاطع في منع العازلة 3 كما فعلت سابقا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين تحت هزاز لطيف.احتضان المقاطع مع biotin laded ployclonal أرنب المضادة للعدلات البشرية elastase الأجسام المضادة في أربع درجات مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة كما هو موضح سابقا. بعد الغسيل مع TBST احتضان الشرائح مع اليكسا فلور 594 Streptavidin Conjugate لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسلي مع TBST مرة واحدة لمدة خمس دقائق.تطبيق 100 ميكرولتررس من الخليط محلول Autofluorescense Quenching مباشرة على أقسام لمدة دقيقة واحدة حسب تعليمات الشركة المصنعة. اغسل الشرائح على الفور مع TBST ست مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. تغطية كل شريحة مع 100 ميكرولترات من 300 نانومولار DAPI لمدة خمس دقائق في الظلام.ثم يغسل مع TBST خمس مرات لمدة ثلاث دقائق في كل مرة. تطبيق قطرة من antifade تصاعد المتوسطة مباشرة على الشريحة الزجاجية المحيطة القسم. ضع غطاء زلة بلطف على القسم دون خلق أي فقاعات.السماح للعينات لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في أربع درجات مئوية. لتحديد موقع خثرة، مسح الجمجمة إلى caudally على طول الشريان الأورطي، تشعب الأبهر وكل شريان femeral باستخدام المجهر النقيض المرحلة مع هدف 10x. أولاً، قم بفحص الأقسام الخاصة بالحمض النووي الخالي من الخلايا باستخدام قناة DAPI مع الإثارة عند 357 و44 نانومتر.تحديد العدلات خارج الخلية elastase وcitrullinated هيستون H3 على قنوات البروتين الفلورسنت الأحمر والأخضر في تكساس على التوالي. الحفاظ على وقت التعرض المستمر والمكاسب لكل قناة طوال فترة اقتناء الصور لتجنب التشبع في كثافة البكسل. يتم تحديد الفخاخ العدلية خارج الخلية المستندة إلى التعريب المشترك من العدلات elastase، سيترولين هيستون H3 والحمض النووي خالية من الخلايا.باستخدام الهيماتوكسيلين وossin وصمة عار، والمجهر brightfield، الخثار الشرياني القطط تتكون من خلايا الدم الحمراء، الكريات البيض، الفيبرين والصفائح الدموية. ظهرت NETs كشبكات من الخيوط الأرجوانية العميقة من أطوال مختلفة المحيطة الكريات الحمراء القريبة وككرة البيض. باستخدام هذا البروتوكول، كشف المجهر المناعي مجاميع كبيرة من NETs تتكون من الحمض النووي خالية من الخلايا، وcitrullinated هيستون H3 والعدلات elastase.في ظل الطور التباين في المجهر المناعي ، تم وصف خثرة كهيكل جيد ترسيم داخل مساحة الأوعية الدموية. ومع ذلك، لم يتم اكتشاف الخثرة في أي من عينات التحكم. يوضح هذا الرقم الفلورة الذاتية العميقة لعناصر الجلطة مثل كريات الدم الحمراء عندما يتم تصويرها في الطول الموجي 488 نانومتر.وإخماد الفلورة التلقائية الموجزة بعد وضع العلامات المناعية زادت بشكل كبير من حساسية البروتين المشترك في التعريب واكتشاف NET حتى في المناطق التي بها وفرة من كريات الدم الحمراء. مدة التثبيت آثار مناعية مستضدات معينة. نوصي التثبيت لمدة لا تزيد عن 24 ساعة على قدم المساواة الجفاف والبارافين تضمين.بدلا من ذلك، يمكن استخدام شبهفورمالدهيد خالية من الميثانول للحد من القطع الأثرية عن طريق حمض الفورميك والكيتونات من أكسدة الفورمالديهايد. لمنع التداخل عند استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تنشأ من نفس النوع ، قمنا بتضمين خطوة حظر إضافية لتشبع أي مواقع ملزمة متبقية على الأجسام المضادة الثانوية. يجب أن يتضمن المحققون ضوابط سلبية تتكون من الأجسام المضادة للأيزوبت، واستبعاد الأجسام المضادة الأولية وخطوة وضع العلامات المناعية والضوابط البيولوجية من القطط دون تجلط.يمكن أن autofluoresence من حدود الأنسجة من الجلطات مطرقة تحديد المجهرية من الفخاخ خارج الخلية العدلات. يمكن للمحقق تقليل الفلورسينس باستخدام الفلوروفوروورات الحمراء البعيدة. يمكن أن تكون هذه التقنية أداة قيمة لدراسة الفخاخ العدلات خارج الخلية في الأنواع البيطرية الأخرى.وهذا يمكن أن يوفر فهما أفضل للفيزياء المرضية من تجلط الدم.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

الكشف الموضعي من البكتيريا داخل أنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من استخدام المسمى الديجوكسين DNA التحقيق استهداف 16S الريباسي

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

التلقائي القائم علي الصورة الكمية من الفخاخ العدلات خارج الخلية باستخدام NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

التحليل المورفولوجي والتركيبي لمصائد العدلات خارج الخلية التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...