Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Undersøgelsen blev støttet af midler fra University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kevin Woolard for brug af fluorescens mikroskop.

Alle metoder, der er beskrevet her blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Davis. Obduktioner og biopsier af væv blev udført med ejernes samtykke.
1. Vævsfiksering, indlejring og skæring
<ol><li>Dissekere den aorta tverumation, herunder faldende aorta, femoralarterie, og de fælles iliaca arterier (Figur 1A), kort efter human dødshjælp eller død. Stump dissekere fas...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Vi beskriver en protokol til at identificere NETs i faste feline kardiogene trombi ved hjælp af en dobbelt immunmærkning protokol og immunfluorescens mikroskopi. Selv om kun kardiogene arteriel trombi blev plettet, kunne denne protokol i teorien anvendes til andre typer trombi og til andre veterinære arter. Identifikation af nets inden feline arterielt trombose tyder på, at NETs kan spille en rolle i trombose hos katte.
Påvisning af nets ved immunfluorescens i fast og paraffin-indlejret v...

Katte med hypertrofisk kardiomyopati er i risiko for livstruende tromboemboliske komplikationer1,2. På trods af den høje sygelighed og dødelighed forbundet med feline kardiogene arteriel tromboemboli (CATE), den underliggende patofysiologi af CATE hos katte er dårligt forstået. Der er også begrænset diagnostiske og terapeutiske værktøjer til behandling og identifikation af katte i risiko for denne ødelæggende tilstand3.
Ud over sin rolle i medfødte immunitet, neutrofiler har vist sig at spille en rolle i trombose ved at frigive neutrofile ekstracellulære fælder (NETs), som er web-lignende netværk af celle-fri DNA (cfDNA) encrusted med histoner og granulatproteiner som neutrofile elastase (NE) og myeloperoxidase. Neutrofiler gennemgår nets dannelse som reaktion på systemisk inflammation, direkte møde med patogener og interaktion med aktiverede blodplader4,5,6,7. Hos hunde har neutrofil-afledt DNA vist sig at hæmme blodproplyse, mens NET-proteiner accelererer dannelsen af blodpropper. Tonitternes evne til at fange cirkulerende celler og koagulationskomponenter er også nøglen til deres trombogenegenskaber8,9,10,11,12.
NETs påvises ved samlokalisering af ekstracellulære neutrofile proteiner, histoner og cfDNA. På grund af dette er identifikation og kvantificering af net i faste væv ved immunfluorescens af deparaffineret væv bedre end traditionel hæmatoxylin og eosin (H&E) plet ved hjælp af lyse feltmikroskopi4,5. Adskillige humane undersøgelser med immunfluorescensmikroskopi identificerede nets som strukturelle komponenter i koronararterietrombi, cerebralt slagtilfælde trombi, attherothrombosis, og venøs trombi13,14,15,16,17. Til dato er en standardiseret metode til påvisning og kvantificering af nets i feline trombi ikke blevet beskrevet. Da identifikation af net i feline kardiogene arteriel trombose kan lette fremtidig translationel forskning i NET og trombose, beskriver vi teknikker til NET-identifikation og vurdering hos paraffin-indlejret arteriel trombose hos katte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Neutrofile ekstracellulære fælder (NETs), der består af cellefrit DNA (cfDNA) og proteiner som histoner og neutrofil elastase (NE), frigives af neutrofiler som reaktion på systemisk inflammation eller patogener. Selvom nets tidligere har vist sig at øge blodprop dannelse og hæmme fibrinolyse hos mennesker og hunde, rolle NETs hos katte med kardiogene arteriel tromboemboli (CATE), en livstruende komplikation sekundært til hypertrofisk kardiomyopati , er ukendt. En standardiseret metode til at identificere og kvantificere NETs i kardiogene arteriel trombi hos katte vil fremme vores forståelse af deres patologiske rolle i CATE. Her beskriver vi en teknik til at identificere nets i formaldehyd-fast og paraffin-indlejret trombi i aorta bifurcation, udvundet under obduktion. Efter deparaffinisering med xylen gennemgik aorta sektioner indirekte varmeinduceret antigenudtagning. Sektioner blev derefter blokeret, permeabilized, og ex vivo NETS blev identificeret ved samlokalisering af celle-fri DNA (cfDNA), citrullinlinated histone H3 (citH3), og neutrofile elastase (NE) ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi. For at optimere immundetektionen af netter i trombi blev autofluorescens en af vævselementerne begrænset ved hjælp af en autofluorescensdæmpningsproces før mikroskopi. Denne teknik kunne være et nyttigt redskab til at studere nets og trombose hos andre arter og giver ny indsigt i patofysiologi af denne komplekse tilstand.

Ved hjælp af denne protokol til deparaffinisering, varme-induceret antigen hentning, og dobbelt immunmærkning af paraffin-indlejret trombi, vi identificeret NETs i katte CATE for første gang. Thrombi inden for aorta tvefurcation var placeret ved fluorescens mikroskopi og lyse felt mikroskopi ved hjælp af standard H & E farvning og fase kontrast mikroskopi. På lyse felt mikroskopi, feline arteriel trombi bestod af røde blodlegemer, leukocytter, fibrin, og blodplader (Figur 3A). Selvom H...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Vi beskriver en metode til at identificere neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) i formaldehyd-faste og paraffin-indlejret feline kardiogene trombi ved hjælp af varme-induceret antigen hentning og en dobbelt immunmærkning protokol.

Identifikation af neutrofile ekstracellulære fælder i paraffin-embedded feline arteriel trombose ved hjælp af Immunofluorescence Mikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Denne protokol af parafinisering efterfulgt af antigen hentning af paraffin-indlejret aorta sektioner kan være et nyttigt redskab til at studere den rolle, neutrofile trekantede fælder i feline trombose. Påvisning af neutrofile trekantede fælder ved immunfluorescens i fast og paraffin-indlejret væv, er overlegen i forhold til konventionelle histologiske stenter som HNE, da det giver mulighed for samtidig påvisning af sikrere DNA og ekstracellulære proteiner. Denne protokol kan anvendes i andre typer af trombi og i andre veterinære arter.Identifikation af neutrofil ekstracellulære fælder i kattearterietrombi tyder på, at de kan spille en rolle i trombose hos katte. Protokoller, der præsenteres her, er retningslinjer. Vi opfordrer på det kraftigste efterforskerne til at justere varigheden og betingelserne for antigenhentningsprocessen for at give et tilfredsstillende signal.Hvis du vil bruge et automatiseret system til at udføre deparaffinisering og hydrering af sektionerne på glasdias, skal du placere glasdiasene i stativer. Nedsænk helt i 100 procent saltvand i tre minutter. Gentag dette trin to gange.Skyl ikke mellem trinene. Nedsænk helt i faldende koncentrationer af ethanol ved stuetemperatur tre gange i tre minutter hver. Nedsænk helt i deioniseret vand i to minutter og gentag en gang til.Efter behandling med TBST fyldes reservoiret med deioniseret vand opvarmet til 100 grader Celsius. Damperkammeret bringes i ligevægt i 20 minutter. På en varmeplade opvarmes den kommercielt tilgængelige antigenudtagningsopløsning, der indeholder Tris og EDTA ved pH 9,0 til 95 til 97 grader Celsius.Sørg for, at den ikke koger. Understænning af objektglassene helt i den opvarmede antigenhentningsopløsning, og fortsæt anvendelsen af ekstern opvarmning via damperen i 20 minutter. Vask derefter rutsjebanerne tre gange med TBST i fem minutter.Placer nu sektionerne i blokeringsbuffer 1. Inkuber i to timer ved stuetemperatur under blid rokkende mellem 30 og 50 omdr./min. Uden vask, straks anvende 100 mikroliter af fortyndet kanin polyklonale anti-human citrullinated histone H3 antistof direkte på diaset.Placer en dæksel på hver sektion for at tillade en jævn fordeling af antistofblandingen. Inkubere i 12 til 16 timer ved fire grader Celsius med blid rokkende. Derefter vaskes diasene tre gange med TBST i fem minutter hver gang.At anvende antistof, bruge en pipet og jævnt distribuere 100 mikroliter af ged anti-kanin antistof konjugeret til Alexa Fluor 488. Dæk objektglassene med sølvpapir og inkuber objektglassene i en time ved stuetemperatur under blid rokkende. Efter vask med TBST i henhold til manuskriptet, inkubere sektionerne i blokering buffer 2 natten over ved fire grader celsius under blid rokkende.Beskyt mod lyset. Vask med TBST tre gange i fem minutter hver gang. Bloker sektionerne i blokerende buffer 3 som gjort tidligere ved stuetemperatur i to timer under blid rokkende.Inkuber sektionerne med biotin laded ployklonal kanin anti-human neutrofil elastase antistof ved fire grader Celsius i 12 til 16 timer som beskrevet tidligere. Efter vask med TBST inkubere dias med Alexa Fluor 594 Streptavidin Konjugat i en time ved stuetemperatur. Derefter vaskes med TBST én gang i fem minutter.Påfør 100 mikroliter autofluorescense quenching opløsning blanding direkte på sektionerne i et minut som anvist af producenten. Vask straks objektglassene med TBST seks gange i 10 minutter hver gang. Dæk hvert dias med 100 mikroliter på 300 nanomolar DAPI i fem minutter i mørke.Derefter vaskes med TBST fem gange i tre minutter hver gang. Påfør en dråbe antifademonteringsmedium direkte på glasrutsjebanen omkring sektionen. Placer et dæksel forsigtigt på sektionen uden at skabe bobler.Lad prøverne helbrede natten over i mørket ved fire grader Celsius. For at finde thrombi, scan kranielt til caudally langs længden af aorta, aorta bifurcation og hver femeral arterie ved hjælp af fase kontrast mikroskopi med en 10x mål. Først undersøge sektioner for celle-fri DNA ved hjælp af DAPI kanal med excitation på 357 og 44 nanometer.Identificer ekstracellulære neutrofil elastase og citrullinated histone H3 på Texas røde og grønne fluorescerende protein kanaler hhv. Bevar ensartet eksponeringstid og gevinster for hver kanal i hele erhvervelsen af billeder for at undgå mætning i pixelintensitet. Neutrofil ekstracellulære fælder identificeres baseret co-lokalisering af neutrofil elastase, citrullinated histone H3 og cellefri DNA.Ved hjælp af hæmatoxylin og eosin pletten, og brightfield mikroskopi, felin arteriel trombi består af røde blodlegemer, leukocytter, fibrin og blodplader. NETs optrådte som netværk af dybe lilla tråde af forskellige længder omkring nærliggende erythrocytter og leukocytter. Ved hjælp af denne protokol, immunofluorescens mikroskopi afslørede store aggregater af NETs består af celle-fri DNA, ekstracellulære citrullinated histone H3 og neutrofil elastase.Under fase kontrast i immunmikroskopi, en trombe var karakteriseret som en velafgrænset struktur inden for det vaskulære rum. Der blev dog ikke påvist trombi i nogen af kontrolprøverne. Dette tal viser dyb autofluorest af blodprop elementer som erythrocytter når afbildet på 488 nanometer bølgelængde.Kort autofluoresens dæmpning efter immunterapi betydeligt øget følsomheden af protein co-lokalisering og NET detektion selv i områder med en overflod af erythrocytter. Varigheden af fikseringen påvirker immunoraktiviteten af visse antigener. Vi anbefaler fiksering i højst 24 timer par dehydrering og paraffin indlejring.Alternativt kan methanolfri paraformaldehyd bruges til at begrænse artefakt ved myresyre og ketoner fra oxidation af formaldehyd. For at forhindre interferens ved brug af primære antistoffer fra samme art inkluderede vi yderligere blokerende trin for at mætte eventuelle resterende bindingssteder på de sekundære antistoffer. Investigatorerne skal omfatte negativ kontrol bestående af isotypeantistoffer, udelukkelse af enten primære antistoffer og immunmærkningstrin og biologisk kontrol fra katte uden trombose.Autofluoresens af væv grænser trombi kan hamre den mikroskopiske identifikation af neutrofil ekstracellulære fælder. Investigator kan minimere fluorescens ved hjælp af langt røde fluorophores. Denne teknik kan være et værdifuldt redskab til undersøgelse af neutrofil ekstracellulære fælder i andre veterinære arter.Dette kan give en bedre forståelse af patofysiologi af trombose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklet human neutrofil Ekstracellulære Fælder (NET) Isolering og Håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In situ påvisning af bakterier i paraffinindlejrede Væv Brug en Digoxin-mærket DNA Probe Målretning 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere makrofag ekstracellulære fælder ved hjælp af konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofile ekstracellulære fælde dannelse: Dynamisk og kvantitativ analyse af Fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiseret billedbaseret kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologisk og sammensætningsanalyse af neutrofile ekstracellulære fælder induceret af mikrobielle og kemiske stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kvantificering af myeloperoxidase-DNA og neutrofile elastase-DNA-komplekser fra neutrofile ekstracellulære fælder ved hjælp af en modificeret sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunofluorescensbilleddannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i væv fra mennesker og mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...