Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

De studie werd ondersteund door fondsen van de University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). De auteurs willen Dr. Kevin Woolard erkennen voor het gebruik van de fluorescentiemicroscoop.

Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California, Davis. Necropsies en biopten van weefsels werden uitgevoerd met toestemming van de eigenaars.
1. Weefselfixatie, inbedding en doorsnede
<ol><li>Ontleed de aortabifurcatie, met inbegrip van de dalende aorta, dijbeenslagader, en de gemeenschappelijke iliacale slagaders (Figuur 1A), kort na humane...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

We beschrijven een protocol om NET's te identificeren in vaste katachtige cardiogene arteriële trombi met behulp van een dubbel immunolabelingprotocol en immunofluorescentiemicroscopie. Hoewel alleen cardiogene arteriële tromiale trombi werd gekleurd, in theorie dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten trombi en in andere diersoorten. Identificatie van NET's binnen katachtige arteriële trombi suggereert dat NET's een rol kunnen spelen bij trombose bij katten.
Detectie van NET's ...

Katten met hypertrofische cardiomyopathie lopen het risico op levensbedreigende trombo-embolie complicaties1,2. Ondanks de hoge morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met katachtige cardiogene arteriële trombo-embolie (CATE), wordt de onderliggende pathofysiologie van CATE bij katten slecht begrepen. Er zijn ook beperkte diagnostische en therapeutische instrumenten om katten te behandelen en te identificeren die het risico lopen op deze verwoestende aandoening3.
Naast zijn rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen is aangetoond dat een rol spelen in trombose door het vrijgeven van neutrofiele extracellulaire vallen (NETs), die web-achtige netwerken van cel-vrij DNA (cfDNA) ingelegd met histonen en korrelige eiwitten zoals neutrofiele elastase (NE) en myeloperoxidase. Neutrofielen ondergaan NETs vorming in reactie op systemische ontsteking, directe ontmoeting met ziekteverwekkers, en interactie met geactiveerde bloedplaatjes4,5,6,7. Bij honden is aangetoond dat neutrofie-afgeleid DNA stolsellyse remt, terwijl NET-eiwitten de stolselvorming versnellen. Het vermogen van NET's om circulerende cellen en stollingscomponenten te vangen is ook de sleutel tot hun trombogene eigenschappen8,9,10,11,12.
NET's worden gedetecteerd door colokalisatie van extracellulaire neutrofiele eiwitten, histonen en cfDNA. Hierdoor is de identificatie en kwantificering van NET's in vaste weefsels door immunofluorescentie van gedeparafeerde weefsels superieur aan traditionele hematoxyline en eosine (H&E) vlek met behulp van heldere veldmicroscopie4,5. Verschillende menselijke studies met behulp van immunofluorescentie microscopie geïdentificeerd NETs als structurele componenten van coronaire arteriële trombi, cerebrale beroerte trombi, atherothrombosis, en veneuze trombi13,14,15,16,17. Tot op heden is een gestandaardiseerde methode om NET's in katachtige trombi op te sporen en te kwantificeren niet beschreven. Omdat de identificatie van NET's in katachtige cardiogene arteriële trombi toekomstig translationeel onderzoek in NET's en trombose kan vergemakkelijken, beschrijven we technieken van NET-identificatie en -beoordeling in paraffine-ingebedde arteriële trombi bij katten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), samengesteld uit celvrij DNA (cfDNA) en eiwitten zoals histonen en neutrofiele elastase (NE), worden vrijgegeven door neutrofielen in reactie op systemische ontsteking of ziekteverwekkers. Hoewel eerder is aangetoond dat NETs de stolselvorming vergroten en fibrinolyse remmen bij mensen en honden, is de rol van NET's bij katten met cardiogene arterial trombo-embolie (CATE), een levensbedreigende complicatie secundair aan hypertrofische cardiomyopathie , is onbekend. Een gestandaardiseerde methode om NET's te identificeren en te kwantificeren bij cardiogene arteriële trombi bij katten zal ons begrip van hun pathologische rol in CATE bevorderen. Hier beschrijven we een techniek om NET's te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde trombi binnen de aortabifurcatie, geëxtraheerd tijdens obductie. Na deparaffinisatie met xyleen ondergingen aortasecties indirect warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning. Secties werden vervolgens geblokkeerd, permeabilized, en ex vivo NETs werden geïdentificeerd door colocalisatie van cel-vrij DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), en neutrophil elastase (NE) met behulp van immunofluorescentie microscopie. Om de immunodetectie van NET's in trombi te optimaliseren, werd autofluorescentie van weefselelementen beperkt door een autofluorescentieblusproces voorafgaand aan microscopie te gebruiken. Deze techniek kan een nuttig hulpmiddel zijn om NET's en trombose bij andere soorten te bestuderen en biedt nieuwe inzichten in de pathofysiologie van deze complexe aandoening.

Met behulp van dit protocol voor deparaffinisatie, warmte-geïnduceerde antigen retrieval, en dubbele immunolabeling van paraffine-ingebedde trombi, identificeerden we NETs in katachtige CATE voor de eerste keer. Thrombi binnen de aortabifurcatie werden gelokaliseerd door fluorescentiemicroscopie en heldere veldmicroscopie met behulp van standaard H&E-kleuring en fasecontrastmicroscopie. Op heldere veldmicroscopie bestond katachtige arteriële trombi uit rode bloedcellen, leukocyten, fibrine en bloedplaatjes (<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

We beschrijven een methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde katachtige cardiogene trombi met behulp van warmte-geïnduceerde antigen retrieval en een dubbele immunolabeling protocol.

Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Dit protocol van de parafinisatie gevolgd door antigeneraal ophalen van paraffine-ingebedde aortasecties kan een nuttig hulpmiddel zijn om de rol van neutrofiele driehoekige vallen bij katachtige trombose te bestuderen. Detectie van neutrofiele driehoekige vallen door immunofluorescentie in vast en paraffine-ingebed weefsel, is superieur aan conventionele histologische stents zoals HNE, omdat het gelijktijdige detectie van veiliger DNA en extracellulaire eiwitten mogelijk maakt. Dit protocol kan worden gebruikt in andere soorten trombi en bij andere veterinaire soorten.Identificatie van neutrofiele extracellulaire vallen binnen katachtige arteriële trombi suggereren dat ze een rol kunnen spelen bij trombose bij katten. Protocollen die hier worden gepresenteerd zijn richtlijnen. We raden onderzoekers ten zeerste aan om de duur en voorwaarden van het antigeenophaalproces aan te passen om een bevredigend signaal af te geven.Om een geautomatiseerd systeem te gebruiken om deparaffinisatie en re-hydratatie van de secties op glazen platen uit te voeren, plaatst u de glazen glijbanen in rekken. Dompel volledig onder in 100 procent zout gedurende drie minuten. Herhaal deze stap twee keer.Spoel niet tussen de stappen door. Dompel volledig onder in afnemende concentraties ethanol bij kamertemperatuur drie keer gedurende drie minuten per stuk. Dompel volledig in gedeïmiseerd water gedurende twee minuten en herhaal nog een keer.Na behandeling met TBST, vul het reservoir met gedeïsiseerd water verwarmd tot 100 graden Celsius. Laat de stoommachinekamer gedurende 20 minuten in evenwicht brengen. Verwarm op een warmteplaat de commercieel verkrijgbare antigeenophaaloplossing met Tris en EDTA bij pH 9,0 tot 95 tot 97 graden Celsius.Zorg ervoor dat het niet kookt. Onderbezet de dia's volledig in de verwarmde antigeenophaaloplossing en zet de toepassing van externe verwarming via de stoomboot gedurende 20 minuten voort. Was vervolgens de dia's drie keer met TBST gedurende vijf minuten.Plaats nu de secties in het blokkeren van buffer 1. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder zacht schommelen tussen 30 en 50 rpm. Breng zonder wassen onmiddellijk 100 microliter verdunde konijnpolylonale anti-menselijke citrullinated histone H3-antilichaam rechtstreeks op de dia aan.Plaats een afdeksel op elke sectie om een gelijkmatige verdeling van het antilichaammengsel mogelijk te maken. Incubeer voor 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius met zacht schommelen. Daarna, was de dia's drie keer met TBST voor vijf minuten per keer.Gebruik een pipet om antilichamen aan te brengen en verdeel gelijkmatig 100 microliter geitenanti-konijnantilichaam geconjugeerd naar Alexa Fluor 488. Bedek de glijbanen met aluminiumfolie en broed de glijbanen gedurende een uur bij kamertemperatuur onder zacht schommelen. Na het wassen met TBST volgens het manuscript, broeden de secties in het blokkeren van buffer 2 's nachts op vier graden Celsius onder zachte schommelen.Bescherm tegen het licht. Was met TBST drie keer gedurende vijf minuten per keer. Blokkeer de secties in het blokkeren van buffer 3 zoals eerder gedaan bij kamertemperatuur gedurende twee uur onder zachte schommelen.Incubeer de secties met biotine laded ployclonal konijn anti-menselijke neutrophil elastase antilichaam op vier graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur zoals eerder beschreven. Na het wassen met TBST de glijbanen met Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate gedurende een uur bij kamertemperatuur. Daarna, wassen met TBST een keer gedurende vijf minuten.Breng 100 microliter van Autofluorescense Quenching oplossing mengsel direct op de secties voor een minuut, zoals geïnstrueerd door de fabrikant. Was onmiddellijk de glijbanen met TBST zes keer gedurende 10 minuten per keer. Bedek elke dia met 100 microliter van 300 nanomolar DAPI gedurende vijf minuten in het donker.Dan wassen met TBST vijf keer gedurende drie minuten elke keer. Breng een druppel antifade montagemedium direct aan op de glazen schuif rond de sectie. Plaats een deksel slip zachtjes op de sectie zonder het creëren van bubbels.Laat de monsters 's nachts genezen in het donker op vier graden Celsius. Om trombi te lokaliseren, scan cranially te caudally langs de lengte van de aorta, aorta bifurcatie en elke femerale slagader met behulp van fase contrast microscopie met een 10x doelstelling. Bestudeer eerst de secties voor celvrij DNA met behulp van het DAPI-kanaal met de excitatie op 357 en 44 nanometer.Identificeer extracellulaire neutrofiele elastase en citrullinated histone H3 op de Texas rode en groene fluorescerende eiwitkanalen respectievelijk. Behoud consistente belichtingstijd en winsten van elk kanaal tijdens de verwerving van afbeeldingen om verzadiging in pixelintensiteit te voorkomen. Neutrofiele extracellulaire vallen zijn geïdentificeerd op basis van co-lokalisatie van neutrofiele elastase, citrullinated histone H3 en cel-vrij DNA.Met behulp van hematoxyline en eosine vlek, en helderveld microscopie, katachtige arteriële trombi bestaan uit rode bloedcellen, leukocyten, fibrin en bloedplaatjes. NETs verscheen als netwerken van diepe paarse draden van verschillende lengtes rond de nabijgelegen erythrocyten en leukocyten. Met behulp van dit protocol, immunofluorescentie microscopie bleek grote aggregaten van NETs samengesteld uit cel-vrij DNA, extracellulaire citrullinated histone H3 en neutrofiele elastase.Onder fasecontrast in immuunmicroscopie, werd een trombus gekenmerkt als goed-afgebakende structuur binnen de vasculaire ruimte. In geen van de controlemonsters werden echter trombi gedetecteerd. Deze figuur toont diepgaande autofluoresence van stolselelementen zoals erytrocyten wanneer afgebeeld op de 488 nanometer golflengte.Korte autofluoresence quenching na immunolabelling aanzienlijk verhoogd de gevoeligheid van eiwit co-lokalisatie en NET detectie, zelfs in gebieden met een overvloed aan erythrocyten. De duur van fixatie heeft gevolgen voor de immunoreactiviteit van bepaalde antigenen. Wij raden fixatie niet langer dan 24 uur par de uitdroging en paraffine inbedding.Als alternatief kan methanol-vrij paraformaldehyde worden gebruikt om artefact te beperken door mierenzuur en ketonen van oxidatie van formaldehyde. Om interferentie te voorkomen bij het gebruik van primaire antilichamen van dezelfde soort, hebben we extra blokkeringsstap toegevoegd om eventuele resterende bindingsplaatsen op de secundaire antilichamen te verzadigen. Onderzoekers moeten negatieve controles omvatten die bestaan uit isotypeantilichamen, uitsluiting van primaire antilichamen en immuno-etiketteringsstap en biologische controles van katten zonder trombose.Autofluoresence van weefselgrenzen van trombi kan de microscopische identificatie van neutrofiele extracellulaire vallen hameren. De onderzoeker kan de fluorescentie door het gebruik van verre rode fluoroforen minimaliseren. Deze techniek kan een waardevol hulpmiddel zijn voor de studie van neutrofiele extracellulaire vallen bij andere veterinaire soorten.Dit kan een beter begrip geven van de pathofysiologie van trombose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...