Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

L’étude a été soutenue par des fonds de l’Université de Californie, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Les auteurs aimeraient remercier le Dr Kevin Woolard pour l’utilisation du microscope à fluorescence.

Toutes les méthodes décrites ici ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Davis. Des nécropsies et des biopsies des tissus ont été effectuées avec le consentement des propriétaires.
1. Fixation des tissus, intégration et sectionnement
<ol><li>Disséquer la bifurcation aortique, y compris l’aorte descendante, l’artère fémorale, et les artères iliaques communes...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Nous décrivons un protocole pour identifier des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins fixes utilisant un protocole d’immunolabeling double et la microscopie d’immunofluorescence. Bien que seulement les thrombi artérogènes cardiogéniques aient été tachés, en théorie ce protocole pourrait être employé pour d’autres types de thrombi et dans d’autres espèces vétérinaires. L’identification des NET dans les thrombi artériels félins suggère que les TN peuvent jouer un rôle dans la...

Les chats atteints de cardiomyopathie hypertrophique sont à risque de complications thromboemboliques potentiellement mortelles1,2. En dépit de la morbidité et de la mortalité élevées liées au thromboembolism artériel cardiogénique félin (CATE), la pathophysiologie sous-jacente de CATE chez les chats est mal comprise. Il existe également des outils diagnostiques et thérapeutiques limités pour traiter et identifier les chats à risque de cette condition dévastatrice3.
En plus de son rôle dans l’immunité innée, il a été démontré que les neutrophiles jouent un rôle dans la thrombose en libérant des pièges extracellulaires neutrophiles (NET), qui sont des réseaux web d’ADN sans cellules (CFDNA) incrustés d’histones et de protéines granulaires comme le neutrophile elastase (NE) et le myeloperoxidase. Les neutrophiles subissent la formation de NETs en réponse à l’inflammation systémique, la rencontre directe avec des agents pathogènes, et l’interaction avec les plaquettes activées4,5,6,7. Chez les chiens, l’ADN dérivé du neutrophile a été montré pour inhiber la lyse de caillot, tandis que les protéines NET accélèrent la formation de caillots. La capacité des NET à piéger les cellules circulantes et les composants de coagulation est également la clé de leurs propriétés thrombogéniques8,9,10,11,12.
Les NET sont détectés par colocalisation des protéines neutrophiles extracellulaires, des histones, et de l’ADNC. Pour cette raison, l’identification et la quantification des NET dans les tissus fixes par immunofluorescence des tissus déparaffinisés est supérieure à l’hématoxyline traditionnelle et la tache d’éosine (H et E) utilisant la microscopie de champ lumineux4,5. Plusieurs études humaines utilisant la microscopie d’immunofluorescence ont identifié des NET comme composants structurels de thrombi coronaires, thrombi de course cérébrale, atherothrombose, et thrombi veineux13,14,15,16,17. À ce jour, aucune méthode normalisée permettant de détecter et de quantifier les TNN dans les thrombi félins n’a pas été décrite. Puisque l’identification des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins peut faciliter la recherche translationnelle future dans les NET et la thrombose, nous décrivons des techniques d’identification et d’évaluation de NET dans les thrombi artériels paraffine-embeddeds chez les chats.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Les pièges extracellulaires neutrophiles (NET), composés d’ADN sans cellules (CFDNA) et de protéines comme les histones et l’élastase neutrophile (NE), sont libérés par les neutrophiles en réponse à une inflammation systémique ou à des agents pathogènes. Bien qu’il ait déjà été démontré que les TTRO augmentent la formation de caillots et inhibent la fibrinolyse chez l’homme et les chiens, le rôle des NET chez les chats atteints de thromboembolisme artériel cardiogénique (CATE), une complication potentiellement mortelle secondaire à la cardiomyopathie hypertrophique , est inconnu. Une méthode normalisée pour identifier et quantifier les NET dans les thrombi artéraux cardiogéniques chez les chats fera progresser notre compréhension de leur rôle pathologique dans CATE. Ici, nous décrivons une technique pour identifier des NET dans les thrombi formaldéhyde-fixes et paraffin-incorporés dans la bifurcation aortique, extraite pendant l’autopsie. Après la deparaffinisation avec le xylène, les sections aortiques ont subi la récupération indirecte d’antigène thermique-induite. Les sections ont ensuite été bloquées, perméabilisées, et les NET ex vivo ont été identifiés par la colocalisation de l’ADN sans cellule (CFDNA), de l’histone H3 (citH3) et de l’élastase neutrophile (NE) utilisant la microscopie d’immunofluorescence. Pour optimiser l’immunodétection des NET dans thrombi, l’autofluorescence des éléments tissulaires a été limitée en utilisant un processus d’étanchéité de l’autofluorescence avant la microscopie. Cette technique pourrait être un outil utile pour étudier les TNI et la thrombose chez d’autres espèces et offre de nouvelles perspectives sur la pathophysiologie de cette condition complexe.

Utilisant ce protocole pour la deparaffinisation, la récupération d’antigène induite par la chaleur, et le double immunolabeling des thrombi paraffines-incorporées, nous avons identifié des NET dans le CATE félin pour la première fois. Thrombi dans la bifurcation aortique ont été localisés par microscopie de fluorescence et microscopie de champ lumineux utilisant la coloration standard de H et E et la microscopie de contraste de phase. Sur la microscopie de champ lumineux, les thrombi artériels félins se co...

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Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Nous décrivons une méthode pour identifier les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans le formaldéhyde-fixe et paraffin-intégré thrombi cardiogénique félin utilisant la récupération d’antigène induite par la chaleur et un protocole d’immunolabeling double.

Identification des pièges extracellulaires Neutrophil dans paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi à l’aide de la microscopie à l’immunofluorescence

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Ce protocole de parafinisation suivi de la récupération d’antigène des sections aortiques paraffin-incorporées peut être un outil utile pour étudier le rôle des pièges tricellulaires neutrophiles dans la thrombose féline. La détection des pièges tricellulaires neutrophiles par immunofluorescence dans les tissus fixes et paraffin-incorporés, est supérieure aux en-temps histologiques conventionnels comme HNE, car elle permet la détection simultanée de l’ADN plus sûr et des protéines extracellulaires. Ce protocole peut être utilisé dans d’autres types de thrombi et chez d’autres espèces vétérinaires.L’identification des pièges extracellulaires de neutrophile dans le thrombi artélien félin suggère qu’ils puissent jouer un rôle dans la thrombose chez les chats. Les protocoles présentés ici sont des lignes directrices. Nous encourageons fortement les investigateurs à ajuster la durée et les conditions du processus de récupération d’antigène pour donner un signal satisfaisant.Pour utiliser un système automatisé pour effectuer la déparaffinisation et la réhydratation des sections sur des glissières en verre, placez les glissières en verre dans des supports. Submerger complètement dans 100 pour cent salin pendant trois minutes. Répétez cette étape deux fois.Ne pas rincer entre les étapes. Submergez complètement dans des concentrations décroissantes d’éthanol à température ambiante trois fois pendant trois minutes chacune. Submerger complètement dans l’eau déionisée pendant deux minutes et répéter une fois de plus.Après le traitement par TBST, remplissez le réservoir d’eau déionisée chauffée à 100 degrés Celsius. Laisser la chambre du vapeur s’équilibrer pendant 20 minutes. Sur une plaque chauffante, chauffer la solution de récupération d’antigène disponible dans le commerce contenant tris et EDTA au pH 9,0 à 95 à 97 degrés Celsius.Assurez-vous qu’il ne bout pas. Suberge les glissières complètement dans la solution de récupération d’antigène chauffé et continuer l’application de chauffage externe via le vapeur pendant 20 minutes. Ensuite, lavez les diapositives trois fois avec tbst pendant cinq minutes.Maintenant, placez les sections dans le tampon bloquant 1. Incuber pendant deux heures à température ambiante sous un basculement doux entre 30 et 50 rpm. Sans lavage, appliquez immédiatement 100 microlitres d’anticorps polyclonal de lapin dilué anti-humain citrullinated histone H3 directement sur la glissière.Placez un bordereau de couverture sur chaque section pour permettre une distribution uniforme du mélange d’anticorps. Incuber de 12 à 16 heures à quatre degrés Celsius avec un basculement doux. Après cela, laver les diapositives trois fois avec tbst pendant cinq minutes à chaque fois.Pour appliquer des anticorps, utilisez un pipet et distribuez uniformément 100 microlitres d’anticorps anti lapin de chèvre conjugués à Alexa Fluor 488. Couvrir les toboggans de papier d’aluminium et incuber les glissières pendant une heure à température ambiante sous un basculement doux. Après le lavage avec TBST selon le manuscrit, couver les sections en bloquant tampon 2 nuit à quatre degrés Celsius sous basculement doux.Protégez-vous de la lumière. Laver avec tbst trois fois pendant cinq minutes à chaque fois. Bloquez les sections en bloquant le tampon 3 comme cela a été fait précédemment à température ambiante pendant deux heures sous un basculement doux.Incuber les sections avec biotine laded ployclonal lapin anti-humain elastase anticorps à quatre degrés Celsius pendant 12 à 16 heures comme décrit précédemment. Après le lavage avec TBST couver les diapositives avec Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugué pendant une heure à température ambiante. Après cela, laver avec TBST une fois pendant cinq minutes.Appliquer 100 microlitres de mélange de solution d’étanchéisation Autofluorescense directement sur les sections pendant une minute, selon les instructions du fabricant. Lavez immédiatement les glissières avec tbst six fois pendant 10 minutes à chaque fois. Couvrir chaque diapositive de 100 microlitres de 300 nanomolaires DAPI pendant cinq minutes dans l’obscurité.Ensuite, laver avec TBST cinq fois pendant trois minutes à chaque fois. Appliquez une goutte de milieu de montage antifade directement sur la glissière de verre entourant la section. Placez doucement un couvercle sur la section sans créer de bulles.Laissez les échantillons guérir toute la nuit dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Pour localiser le thrombi, numérisez cranially à caudally le long de la longueur de l’aorte, bifurcation aortique et chaque artère fébrale utilisant la microscopie de contraste de phase avec un objectif de 10x. Examinez d’abord les sections pour l’ADN sans cellules en utilisant le canal DAPI avec l’excitation à 357 et 44 nanomètres.Identifiez l’élastase extracellulaire de neutrophile et l’histone H3 citrullinated sur les canaux fluorescents rouges et verts de protéine du Texas respectivement. Maintenez un temps d’exposition et des gains constants de chaque canal tout au long de l’acquisition d’images afin d’éviter la saturation de l’intensité des pixels. Les pièges extracellulaires de Neutrophile sont identifiés co-localisation basée de l’élastase de neutrophile, de l’histone H3 citrullinated et de l’ADN cellulaire-libre.Utilisant la tache d’hématoxyline et d’éosine, et la microscopie de brightfield, le thrombi artériial félin se composent des globules rouges, des leucocytes, de la fibrine et des plaquettes. Les NETs sont apparus comme des réseaux de fils violets profonds de différentes longueurs entourant les érythrocytes et les leucocytes voisins. Utilisant ce protocole, la microscopie d’immunofluorescence a indiqué de grands agrégats des NETs composés de l’ADN cell-free, de l’histone H3 citrullinated extracellulaire et de l’élastase de neutrophile.Sous le contraste de phase dans la microscopie immunisée, un thrombus a été caractérisé comme une structure bien-délimitée dans l’espace vasculaire. Cependant, le thrombi n’a été détecté dans aucun des échantillons de contrôle. Cette figure démontre l’autofluoration profonde des éléments de caillot comme les érythrocytes lorsqu’ils sont photographiés à la longueur d’onde de 488 nanomètres.L’autofluorésence brève qui s’étanche après l’immunolabelling a considérablement augmenté la sensibilité de la co-localisation des protéines et de la détection de l’EN, même dans les régions où les érythrocytes sont abondants. La durée de la fixation a des effets sur l’immunoréactivité de certains antigènes. Nous recommandons la fixation pour pas plus de 24 heures par la déshydratation et l’intégration de paraffine.Alternativement, le paraformaldéhyde sans méthanol peut être employé pour limiter l’artefact par l’acide formic et les cétones de l’oxydation du formaldéhyde. Pour prévenir les interférences lors de l’utilisation d’anticorps primaires provenant de la même espèce, nous avons inclus une étape de blocage supplémentaire pour saturer tous les sites de liaison restants sur les anticorps secondaires. Les investigateurs doivent inclure des contrôles négatifs se composant des anticorps d’isotype, de l’exclusion des anticorps primaires et de l’étape d’immuno-étiquetage et des contrôles biologiques des chats sans thrombose.L’autofluorésence des limites tissulaires du thrombi peut marteler l’identification microscopique des pièges extracellulaires neutrophiles. L’investigateur peut réduire au minimum la fluorescence par l’utilisation des fluorophores far-rouge. Cette technique peut être un outil précieux pour l’étude des pièges extracellulaires neutrophiles chez d’autres espèces vétérinaires.Ceci peut fournir une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la thrombose.

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