Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי קרנות מאוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, המרכז לבריאות בעלי חיים לוויה (CCAH 2018-30-F). המחברים רוצים להכיר בדוקטור קווין וולארד לשימוש במיקרוסקופ הזריחה.

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאם להנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ולשימוש באוניברסיטת קליפורניה, דיוויס. שמלות וביופסיות של רקמות בוצעו עם הסכמת הבעלים.
1. קיבוע רקמה, הטבעה ושיבוץ
<ol><li>לנתח את הבייון של אבי העורקים, כולל את אבי העורקים היורדים, עורק הירך והעור?...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי רשתות בתרובי העורקים הדו-קרדיוגנטיים הקבועים באמצעות פרוטוקול חיסוני כפול ומיקרוסקופ אימונולובורנציה. למרות שרק תרובי עורקי העורקים היו מוכתמים, בתאוריה זו ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עבור סוגים אחרים של התרובי ומינים וטרינריים אחרים. זיהוי רשתות בתוך תרופני חת...

חתולים עם יפרטרופית שריר הלב הם בסיכון של מסכנת חיים thromboembolic סיבוכים1,2. למרות התחלואה והתמותה הגבוהים הקשורים לידע העורקים (קייט), הפתופסולוגיה הבסיסית של קייט אצל חתולים מובנת בצורה גרועה. יש גם כלים מוגבלים אבחון וטיפולי לטפל ולזהות חתולים בסיכון זה מצב הרסני3.
בנוסף לתפקידה בחסינות מולדת, נויטרופילים הוכחו לשחק תפקיד פקקת על ידי שחרור מלכודות נויטרופילים מסחטות (רשתות), שהם רשתות כמו רשת של DNA ללא תא (cfDNA) מצופה עם האבנים וחלבונים בעלי כגון נויטרופילים elastase (NE) ו myeloperoxidase. נויטרופילים לעבור רשתות היווצרות בתגובה לדלקת מערכתית, מפגש ישיר עם פתוגנים, אינטראקציה עם טסיות מופעל4,5,6,7. אצל כלבים, נויטרופילים הנגזר DNA הוכח לעכב את הליזה קריש, בעוד חלבונים נטו להאיץ את היווצרות קריש. היכולת של רשתות להשמנה תאים מחזורי ורכיבי קרישת דם הוא גם מפתח למאפייני thrombogenic שלהם8,9,10,11,12.
הרשתות מזוהות על ידי לוקליזציה של חלבונים נויטרופילים, האבנים, ו cfDNA. בשל כך, הזיהוי והקוונפיקציה של רשתות ברקמות קבועות על-ידי immunofluorescence מרקמות של ממחטות הנייר מעולה למטאוקסילין המסורתי ולאאוזין (H & E) באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר4,5. מספר מחקרים אנושיים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence מזוהה רשתות כרכיבים מבניים של תרובי עורקים בעורק כלילי, שבץ מוחי התרובי, atherothrombosis, ו בורידים ורידים13,14,15,16,17. עד כה, לא תוארה שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בקריבי חתולים. מכיוון שזיהוי רשתות בתרופני העורקים הכאותית של חתולים עשוי להקל על מחקר הטרנסשלאני העתידי ברשתות ובפקקת, אנו מתארים טכניקות של זיהוי נטו והערכה ב-פרפין-התרובי העורקים המוטבעים אצל חתולים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

מלכודות מסחטות נויטרופילים (רשתות), מורכב של DNA ללא תא (cfdna) וחלבונים כמו יסטוניים ו נויטרופילים elastase (NE), משתחררים על ידי נויטרופילים בתגובה לדלקת מערכתית או פתוגנים. למרות רשתות הוכחו בעבר להגדיל את היווצרות קריש ולעכב fibrinolysis בבני אדם וכלבים, את התפקיד של רשתות אצל חתולים עם ידע העורקים הקרדיוגנטית (קייט), סיבוך מסכנת חיים משני כדי יפרטרופית מחלת שריר הלב , אינו ידוע. שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בתרובי העורקים הקרדיוגנטית אצל חתולים, תקדם את הבנתנו את תפקידם הפתולוגי בקייט. כאן, אנו מתארים טכניקה כדי לזהות רשתות ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע הטרובי בתוך הבייון אבי העורקים, שחולצו במהלך נקרופסי. בעקבות הסיכום עם קסילן, מקטעים של אבי העורקים עברו לאיחזור אנטיגן עקיף המושרה בחום. מקטעים נחסמו אז, החדיר, ו לשעבר vivo נטס זוהו על ידי לוקליזציה של ה-dna ללא תא (cfdna), מcitH3 היסטון מH3 ה, ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. כדי לייעל את גילוי החיסוני של רשתות בתרובי, הקרינה האוטומטית של רכיבי הרקמה הוגבלה באמצעות תהליך מקושה לפני מיקרוסקופ. טכניקה זו עשויה להיות כלי שימושי לחקר רשתות ופקקת במינים אחרים ומציעה תובנות חדשות לתוך הפתופסולוגיה של מצב מורכב זה.

השימוש בפרוטוקול זה לאיתור מיקוד, לאחזור אנטיגן מושרה בחום, והחיסונית כפולה של הטרובי מוטבע, זיהינו רשתות בפעם הראשונה של החתול קייט. התרובי בתוך הבייון אבי העורקים נמצאו על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות כתמים סטנדרטיים של H & E ומיקרוסקופ ניגודיות פאזה. ע?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

אנו מתארים את השיטה כדי לזהות השמנות נויטרופילים מסחטות (רשתות) ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע העורקים בעורק העורקי באמצעות החום המושרה אנטיגן ופרוטוקול immunolabeling כפול.

זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

פרוטוקול זה של parafinization ואחריו אחזור אנטיגן של מקטעי aortic מוטבע פרפין יכול להיות כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של מלכודות תלת תאיות נויטרופילית פקקת חתולים. זיהוי של מלכודות תלת-תאיות נויטרופיליות על ידי שפעת חיסונית ברקמה קבועה ומוטמעת בפרפין, עדיף על סטנטים היסטולוגיים קונבנציונליים כמו HNE, מכיוון שהוא מאפשר זיהוי בו זמני של דנ"א בטוח יותר וחלבונים חוץ-תאיים. פרוטוקול זה יכול לשמש בסוג אחר של טרומבי ובמין וטרינרי אחר.זיהוי של מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים בתוך פקקת עורקים חתוליים להציע כי הם עשויים לשחק תפקיד פקקת בחתולים. הפרוטוקולים המוצגים כאן הם קווים מנחים. אנו ממליצים בחום לחוקרים להתאים את משך התנאים של תהליך אחזור אנטיגן להניב אות משביע רצון.כדי להשתמש במערכת אוטומטית כדי לבצע deparaffinization ו הידרציה מחדש של החלקים על מגלשות זכוכית, למקם את שקופיות הזכוכית במדפים. להיכנס לחלוטין ב 100 אחוז מלוחים במשך שלוש דקות. חזור על שלב זה פעמיים.אין לשטוף בין השלבים. שקועים לחלוטין בהפחתת ריכוזי אתנול בטמפרטורת החדר שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחד. טביעה לחלוטין במים deionized במשך שתי דקות ולחזור על פעם אחת יותר.לאחר הטיפול ב- TBST, מלאו את המאגר במים שעברו דה-יונון המחוממים ל-100 מעלות צלזיוס. אפשר לתא הקיטור לצייד במשך 20 דקות. על צלחת חום, מחממים את פתרון אחזור האנטיגן הזמין מסחרית המכיל את טריס ו- EDTA ב- pH 9.0 עד 95 עד 97 מעלות צלזיוס.ודא כי הוא לא רותח. לתסיר את השקופיות לחלוטין בתתור אחזור אנטיגן מחומם ולהמשיך את היישום של חימום חיצוני באמצעות ספינת הקיטור במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם TBST במשך חמש דקות.כעת, מקם את המקטעים במאגר חסימה 1. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר תחת נדנדה עדינה בין 30 ל 50 סל"ד. ללא שטיפה, יש למרוח מיד 100 מיקרוליטרים של נוגדן histone H3 מרובל ארנבים מדולל, היסטון H3, ישירות על המגלשה.מניחים תלוש כיסוי על כל קטע כדי לאפשר חלוקה שווה של תערובת הנוגדנים. דגירה במשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם TBST במשך חמש דקות בכל פעם.כדי להחיל נוגדן, השתמש בצינור והפץ באופן שווה 100 מיקרוליטרים של נוגדן נגד ארנב עזים גדום לאלקסה פלואור 488. מכסים את השקופיות בנייר כסף ומדרגים את השקופיות במשך שעה בטמפרטורת החדר תחת נדנדה עדינה. לאחר שטיפה עם TBST על פי כתב היד, דגירה את החלקים בחסימת חיץ 2 לילה בארבע מעלות צלזיוס תחת נדנדה עדינה.הגן מפני האור. לשטוף עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם. חסום את המקטעים בחסימת חיץ 3 כפי שנעשה בעבר בטמפרטורת החדר במשך שעתיים תחת נדנדה עדינה.הדגירה את החלקים עם ביוטין נער ארנב תכסיס אנטי אדם נויטרופילים אלסטאז נוגדן בארבע מעלות צלזיוס במשך 12 עד 16 שעות כפי שתואר קודם לכן. לאחר שטיפה עם TBST דגירה את המגלשות עם אלקסה פלואור 594 סטרפטבידין Conjugate במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף עם TBST פעם אחת במשך חמש דקות.החל 100 microliters של תערובת פתרון מרווה Autofluorescense ישירות על החלקים במשך דקה אחת כפי שהורה על ידי היצרן. מיד לשטוף את השקופיות עם TBST שש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לכסות כל שקופית עם 100 microliters של 300 DAPI ננו-מולאר במשך חמש דקות בחושך.לאחר מכן לשטוף עם TBST חמש פעמים במשך שלוש דקות בכל פעם. החל טיפה של אמצעי הרכבה נגד חיטוי ישירות על מגלשת הזכוכית המקיפה את המקטע. מניחים חלק כיסוי בעדינות על החלק מבלי ליצור בועות.אפשר לדגימות לרפא בן לילה בחושך בארבע מעלות צלזיוס. כדי לאתר thrombi, לסרוק באופן cranially כדי caudally לאורך אבי העורקים, bifurcation אבי העורקים וכל עורק הירך באמצעות מיקרוסקופיה ניגוד פאזה עם מטרה 10x. תחילה לבחון את הסעיפים עבור DNA ללא תאים באמצעות ערוץ DAPI עם העירור ב 357 ו 44 ננומטר.זהה אלסטאז נויטרופילים חוץ-תאיים והיסטון H3 עם הדר בת תעלות החלבון הפלואורסצנטיות האדומות והירוקות של טקסס בהתאמה. שמרו על זמן חשיפה עקבי ורווחים של כל ערוץ לאורך כל רכישת התמונות כדי למנוע רוויה בעוצמת הפיקסלים. מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות מזוהות על בסיס לוקליזציה של אלסטאז נויטרופילים, היסטון H3 עם הדרים ודנ"א נטול תאים.באמצעות המטוקסילין וכתם אאוסין, ומיקרוסקופיה בהירה, טרומבי עורקי חתולי מורכב מתאים אדומים, לויקוציטים, פיברין וטסיות דם. NETs הופיעו כרשתות של חוטים סגולים עמוקים באורכים שונים המקיפים אריתרוציטים ולוקציטים סמוכים. באמצעות פרוטוקול זה, מיקרוסקופיה immunofluorescence גילה אגרגטים גדולים של NETs מורכב DNA ללא תאים, היסטון H3 הירולית חוץ תאית ואלסטאז נויטרופילים.תחת ניגודיות פאזה במיקרוסקופיה חיסונית, טרומבוס התאפיין כמבנה תיחום היטב בתוך מרחב כלי הדם. עם זאת, טרומבי לא זוהו באף אחת מדגימות הבקרה. נתון זה מדגים שפעת אוטומטית עמוקה של יסודות קריש כמו אריתרוציטים כאשר הם דימוי באורך הגל של 488 ננומטר.מרווה אוטופלואורסצנטיות קצרה לאחר אימונולאבלום הגבירה באופן משמעותי את הרגישות של לוקליזציה של חלבונים וזיהוי נטו אפילו באזורים עם שפע של אריתרוציטים. משך קיבעון משפיע על האימונואקטיביות של אנטיגנים מסוימים. אנו ממליצים על קיבעון לא יותר מ 24 שעות נקוב התייבשות הטבעה פרפין.לחלופין, ניתן להשתמש בפרפורמלדהיד ללא מתנול כדי להגביל את החפץ על ידי חומצה פורמית ו קטונים מחמצון של פורמלדהיד. כדי למנוע הפרעות בעת שימוש בנוגדנים ראשוניים שמקורם באותו מין, כללנו צעד חסימה נוסף כדי להרוות את כל אתרי הכריכה הנותרים בנוגדנים המשניים. החוקרים חייבים לכלול בקרות שליליות המורכבות מנוגדני isotype, הדרה של נוגדנים ראשוניים וצעד תיוג חיסוני ובקרות ביולוגיות של חתולים ללא פקקת.שפעת אוטומטית של מגבלות רקמות של טרומבי יכול פטיש זיהוי מיקרוסקופי של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים. החוקר יכול למזער את הפלואורסצנטיות על ידי שימוש בפליאורופורים אדומים רחוקים. טכניקה זו יכולה להיות כלי רב ערך לחקר מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיים במינים וטרינריים אחרים.זה יכול לספק הבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה של פקקת.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...