Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

अध्ययन कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस, साथी पशु स्वास्थ्य के लिए केंद्र (CCAH 2018-30-F) से धन द्वारा समर्थित था । लेखक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए डॉ केविन वूलार्ड को स्वीकार करना चाहते हैं ।

यहां वर्णित सभी तरीकों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था । नेक्रॉप्सी और ऊतकों की बायोप्सी मालिकों की सहमति से की गई ?...

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	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

हम एक डबल इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके निश्चित बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में NETs की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। य?...

हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी वाली बिल्लियों को जीवन के लिए खतरा थ्रोम्बोएम्बोलिक जटिलताओं का खतरा होता है1,2। बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म (CATE) से जुड़ी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के बावजूद, बिल्लियों में CATE के अंतर्निहित रोगविज्ञान को खराब समझा जाता है। इस विनाशकारीस्थितिके खतरे में बिल्लियों के इलाज और पहचानने के लिए सीमित नैदानिक और चिकित्सीय उपकरण भी हैं ।
सहज प्रतिरक्षा में अपनी भूमिका के अलावा, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोसिस में न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनआईटी) जारी करके भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जो कोशिका-मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए) के वेब-जैसे नेटवर्क हैं जो न्यूट्रोफिल इलास्टेस्टेस (एनई) और माएलोपेरोक्सिडा सों जैसे हिस्टोन और दानेदार प्रोटीन से घिरे हुए हैं। न्यूट्रोफिल प्रणालीगत सूजन, रोगजनकों के साथ सीधी मुठभेड़ और सक्रिय प्लेटलेट्स4,,5,,6,,7के साथ बातचीत के जवाब में NETs गठन से गुजरना पड़ता है। कुत्तों में, न्यूट्रोफिल-व्युत्पन्न डीएनए को थक्का लाइसिस को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि नेट प्रोटीन थक्के के गठन में तेजी लाते हैं । परिसंचारी कोशिकाओं और जमावट घटकों को ट्रैप करने के लिए एनईटीएस की क्षमता भी उनके थ्रोम्बोजेनिक गुणों8,9,10,11,12के लिए महत्वपूर्ण है ।
एनईटीएस का पता एक्स्ट्रासेलुलर न्यूट्रोफिल प्रोटीन, हिस्टोन और सीएफडीएनए के सहस्थानीयकरण द्वारा लगाया जाता है। इस वजह से, डिपर्फिनाइज्ड ऊतकों की प्रतिकार द्वारा निश्चित ऊतकों में एनईटीएस की पहचान और मात्राकाकरण उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी4,,5का उपयोग करके पारंपरिक हेमैटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग से बेहतर है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कई मानव अध्ययनों ने नेट्स को कोरोनरी धमनी थ्रोम्बी, सेरेब्रल स्ट्रोक थ्रोम्बी, एथेरोट्रोम्बोसिस, और वेनस थ्रोम्बी13,,14,15,,16,,17के संरचनात्मक घटकों के रूप में पहचाना।, आज तक, बिल्ली के समान थ्रोम्बी में एनईटीएस का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन नहीं किया गया है। क्योंकि बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में NETs की पहचान NETs और थ्रोम्बोसिस में भविष्य के अनुवाद अनुसंधान की सुविधा हो सकती है, हम बिल्लियों में पैराफिन-एम्बेडेड धमनी थ्रोम्बी में नेट पहचान और मूल्यांकन की तकनीकों का वर्णन करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस), सेल-फ्री डीएनए (सीएफडीएनए) से बना और हिस्टोन और न्यूट्रोफिल इलास्टेलेज (एनई) जैसे प्रोटीन, प्रणालीगत सूजन या रोगजनकों के जवाब में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किए जाते हैं। हालांकि नेट्स पहले थक्के गठन को बढ़ाने और मनुष्यों और कुत्तों में फाइब्रिनोलिसिस को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म (CATE), हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी के लिए एक जीवन के लिए खतरा जटिलता माध्यमिक के साथ बिल्लियों में NETs की भूमिका , अज्ञात है। बिल्लियों में कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में एनईटीएस की पहचान करने और उसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि CATE में उनकी रोग भूमिका के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाएगी। यहां, हम नेक्रॉप्सी के दौरान निकाले गए महाधमनी विभाजन के भीतर फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड थ्रोम्बी में एनईटीएस की पहचान करने की तकनीक का वर्णन करते हैं। जाइलीन के साथ अपपैरीकरण के बाद, महाधमनी वर्गों अप्रत्यक्ष गर्मी प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति से गुजरना पड़ा । इसके बाद खंडों को अवरुद्ध, परमीबिलाइज्ड, और पूर्व वीवो नेट्स की पहचान सेल-फ्री डीएनए (सीएफडीएनए), साइट्रलिनाइज्ड हिस्टोन एच 3 (सीआईटीएच3) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के सहस्थानीयकरण द्वारा की गई थी। थ्रोम्बी में एनईटीएस के इम्यूनोडिटेक्शन को अनुकूलित करने के लिए, माइक्रोस्कोपी से पहले ऑटोफ्लोरेसेंस शमन प्रक्रिया का उपयोग करके ऊतक तत्वों का ऑटोफ्लोरेसेंस सीमित था। यह तकनीक अन्य प्रजातियों में NETs और थ्रोम्बोसिस का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकती है और इस जटिल स्थिति के रोगविज्ञान में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

डिपरफिनाइजेशन, हीट-प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल, और पैराफिन-एम्बेडेड थ्रोम्बी के डबल इम्यूनोलेबलिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने पहली बार बिल्ली के समान CATE में NETs की पहचान की। महाधमनी विभाजन ?...

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Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

हम हीट-प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल और डबल इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनआईआईटी) की पहचान करने की विधि का वर्णन करते हैं।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन धमनी थ्रोम्बी में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप की पहचान

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

पैराफिनिक-एम्बेडेड महाधमनी वर्गों के एंटीजन पुनर्प्राप्ति के बाद पैराफिनाइजेशन का यह प्रोटोकॉल फेलिन थ्रोम्बोसिस में न्यूट्रोफिलिक ट्राइसेलुलर जाल की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। फिक्स्ड और पैराफिन एम्बेडेड ऊतक में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा न्यूट्रोफिलिक ट्राइसेलुलर जाल का पता लगाना, एचएनई जैसे पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल स्टेंट से बेहतर है, क्योंकि यह सुरक्षित डीएनए और बाह्य प्रोटीन का एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य प्रकार के थ्रोम्बी और अन्य पशु चिकित्सा प्रजातियों में किया जा सकता है।फेलिन धमनी थ्रोम्बी के भीतर न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप की पहचान से पता चलता है कि वे बिल्लियों में थ्रोम्बोसिस में भूमिका निभा सकते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल दिशानिर्देश हैं । हम जांचकर्ताओं को एक संतोषजनक संकेत देने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया की अवधि और शर्तों को समायोजित करने के लिए दृढ़ता से प्रोत्साहित करते हैं ।ग्लास स्लाइड पर वर्गों के डिपैराफिनाइजेशन और री-हाइड्रेशन करने के लिए एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग करने के लिए, ग्लास स्लाइड को रैक में रखें। तीन मिनट के लिए १०० प्रतिशत खारा में पूरी तरह से जलमग्न । इस स्टेप को दो बार दोहराएं।बीच-बीच में न कुल्ला करें। कमरे के तापमान पर इथेनॉल की सांद्रता कम करने में पूरी तरह से तीन मिनट के लिए तीन बार जलमग्न । दो मिनट के लिए पूरी तरह से डिओनाइज्ड पानी में डूबे रहें और एक और बार दोहराएं।टीबीएसटी के साथ उपचार के बाद, जलाशय को 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी से भरें। स्टीमर चैंबर को 20 मिनट के लिए बराबरी करने की अनुमति दें। एक गर्मी की थाली पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान पीएच 9.0 से 95 से 97 डिग्री सेल्सियस पर Tris और EDTA युक्त गर्मी।सुनिश्चित करें कि यह उबलता नहीं है। गर्म एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान में पूरी तरह से स्लाइड को सुकर्ज करें और स्टीमर के माध्यम से बाहरी हीटिंग के आवेदन को 20 मिनट तक जारी रखें। आगे की स्लाइड्स में पढ़िए टीबीसेंट से तीन बार पांच मिनट तक धोएं।अब, बफर 1 को अवरुद्ध करने में अनुभाग रखें। 30 और 50 आरपीएम के बीच कोमल कमाल के तहत कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट। धोने के बिना, तुरंत पतला खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-ह्यूमन सिट्रुलिनेटेड हिस्टोन एच3 एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर सीधे स्लाइड पर लागू करें।एंटीबॉडी मिश्रण के वितरण की अनुमति देने के लिए प्रत्येक अनुभाग पर एक कवर स्लिप रखें। कोमल कमाल के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर 12 से 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट । इसके बाद हर बार पांच मिनट के लिए टीबीएसटी से तीन बार स्लाइड्स धोएं।एंटीबॉडी लागू करने के लिए, एक पिपेट का उपयोग करें और समान रूप से एलेक्सा फ्लोर 488 को संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर वितरित करें। टिन पन्नी के साथ स्लाइड कवर और कोमल कमाल के तहत कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए स्लाइड इनक्यूबेट । पांडुलिपि के अनुसार टीबीएसटी के साथ धोने के बाद, कोमल कमाल के तहत चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर बफर 2 को अवरुद्ध करने में वर्गों को इनक्यूबेट करें।रोशनी से रक्षा करें। हर बार पांच मिनट के लिए तीन बार टीबीस्ट से धोएं। बफर 3 को अवरुद्ध करने में अनुभागों को ब्लॉक करें जैसा कि कोमल कमाल के तहत दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पहले किया गया था।बायोटिन लैड प्लोइक्लोनल खरगोश एंटी-ह्यूमन न्यूट्रोफिल एलास्टेज एंटीबॉडी के साथ 12 से 16 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर वर्गों को इनक्यूबेट करें जैसा कि पहले वर्णित है । टीबीटीएसटी से धोने के बाद एलेक्सा फ्लोर 594 स्ट्रेप्टाविडिन को कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए संजुगेट करते हैं। उसके बाद पांच मिनट तक एक बार टीबीसेंट से धो लें।निर्माता द्वारा निर्देश के अनुसार एक मिनट के लिए सीधे वर्गों पर ऑटोफ्लोरेसेंस शमन समाधान मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर लागू करें। हर बार 10 मिनट के लिए छह बार टीबीटीटी के साथ स्लाइड्स को तुरंत धोएं। अंधेरे में पांच मिनट के लिए 300 नैनोमोलर DAPI के 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक स्लाइड को कवर करें।फिर हर बार तीन मिनट के लिए पांच बार टीबीस्ट से धोएं। सेक्शन के आसपास के ग्लास स्लाइड पर सीधे एंटीफैड माउंटिंग मीडियम की एक बूंद लगाएं। किसी भी बुलबुले बनाने के बिना अनुभाग पर धीरे से एक कवर पर्ची रखें।नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रात भर ठीक करने की अनुमति दें। थ्रोम्बी का पता लगाने के लिए, महाधमनी, महाधमनी विभाजन और प्रत्येक फेमेरियल धमनी की लंबाई के साथ कपाल ढंग से स्कैन करें, जो 10x उद्देश्य के साथ चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके है। पहले ३५७ और ४४ नैनोमीटर पर उत्तेजन के साथ DAPI चैनल का उपयोग कर सेल मुक्त डीएनए के लिए वर्गों की जांच करें ।क्रमशः टेक्सास लाल और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन चैनलों पर एक्सेसेलर न्यूट्रोफिल इलास्टेस और सिट्रुलिनेटेड हिस्टोन एच 3 की पहचान करें। पिक्सेल तीव्रता में संतृप्ति से बचने के लिए छवियों के अधिग्रहण के दौरान प्रत्येक चैनल के लगातार जोखिम समय और लाभ बनाए रखें। न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप की पहचान न्यूट्रोफिल इलास्टेज, सिट्रुलिनेटेड हिस्टोन एच 3 और सेल-फ्री डीएनए के सह-स्थानीयकरण के आधार पर की जाती है।हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन दाग, और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, फेलिन धमनी थ्रोम्बी में लाल रक्त कोशिकाएं, ल्यूकोसाइट्स, फाइब्रिन और प्लेटलेट्स शामिल हैं। एनईटी पास के एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स के आसपास के विभिन्न लंबाई के गहरे बैंगनी धागे के नेटवर्क के रूप में दिखाई दिया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ने सेल-मुक्त डीएनए, बाह्य रूप से सिलेक्कुलर सिट्रुलन्ड हिस्टोन एच 3 और न्यूट्रोफिल इलास्टेज से बने एनईटी के बड़े समुच्चय का खुलासा किया।प्रतिरक्षा माइक्रोस्कोपी में चरण विपरीत के तहत, एक थ्रोम्बस को संवहनी अंतरिक्ष के भीतर एक अच्छी तरह से सीमांकित संरचना के रूप में चिह्नित किया गया था। हालांकि किसी भी कंट्रोल सैंपल में थ्रोम्बी का पता नहीं चला। यह आंकड़ा 488 नैनोमीटर तरंगदैर्ध्य पर इमेज किए जाने पर एरिथ्रोसाइट्स जैसे थक्के तत्वों के गहन ऑटोफ्लोरेसेंस को दर्शाता है।इम्यूनोलेबलिंग के बाद संक्षिप्त ऑटोफ्लोरेसेंस शमन ने एरिथ्रोसाइट्स की बहुतायत वाले क्षेत्रों में भी प्रोटीन सह-स्थानीयकरण और नेट डिटेक्शन की संवेदनशीलता को काफी बढ़ा दिया। निर्धारण की अवधि कुछ एंटीजन की इम्यूनोएक्टिविटी को प्रभाव देती है। हम डिहाइड्रेशन और पैराफिन एम्बेडिंग के बराबर 24 घंटे से अधिक समय तक फिक्सेशन की सलाह देते हैं।वैकल्पिक रूप से, मेथनॉल-मुक्त पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग फॉर्मेल्डिहाइड के ऑक्सीकरण से फॉर्मिक एसिड और कीटोन्स द्वारा विरूपण साक्ष्य को सीमित करने के लिए किया जा सकता है। एक ही प्रजाति से निकलने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय हस्तक्षेप को रोकने के लिए, हमने माध्यमिक एंटीबॉडी पर किसी भी शेष बाध्यकारी साइटों को तर करने के लिए अतिरिक्त अवरुद्ध कदम शामिल किया। जांचकर्ताओं को आइसोटाइप एंटीबॉडी से मिलकर नकारात्मक नियंत्रण, या तो प्राथमिक एंटीबॉडी और इम्यूनो-लेबलिंग कदम और थ्रोम्बोसिस के बिना बिल्लियों से जैविक नियंत्रण का बहिष्कार शामिल होना चाहिए ।थ्रोम्बी की ऊतक सीमाओं की ऑटोफ्लोरेसेंस न्यूट्रोफिल बाह्य जाल की सूक्ष्म पहचान को हथौड़ा कर सकती है। अन्वेषक दूर-लाल फ्लोरोफोरस के उपयोग से फ्लोरेसेंस को कम कर सकता है। यह तकनीक अन्य पशु चिकित्सा प्रजातियों में न्यूट्रोफिल बाहेल जाल के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकती है।इससे थ्रोम्बोसिस के पैथोफिजियोलॉजी की बेहतर समझ मिल सकती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

न्युट्रोफिल कोशिकी जाल: कैसे उत्पन्न करने के लिए और उन्हें कल्पना

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सरलीकृत मानव न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) अलगाव और हैंडलिंग

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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-16 RRNA लक्ष्य निर्धारण एक Digoxin लेबल डीएनए जांच का उपयोग आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर जीवाणुओं की सीटू का पता लगाने में

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

विधियों का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल में लिपिड बदलाव और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के बाद के गठन

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

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A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

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इन विट्रो में कुत्ते न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

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नेटक्वांट का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप का स्वचालित छवि-आधारित क्वांटिफिकेशन

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

माइक्रोबियल और रासायनिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप का रूपात्मक और रचनात्मक विश्लेषण

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

एक संशोधित सैंडविच एलिसा का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप से मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए कॉम्प्लेक्स की मात्रा निर्धारित करना

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

मानव और माउस ऊतकों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...