Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Lo studio è stato sostenuto da fondi dell'Università della California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Gli autori vorrebbero riconoscere il Dr. Kevin Woolard per l'uso del microscopio a fluorescenza.

Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della California, Davis. Necropsie e biopsie dei tessuti sono state eseguite con il consenso dei proprietari.
1. Fissaggio, incorporamento e sezionamento dei tessuti
<ol><li>Dissezionare la biforcazione aortica, tra cui l'aorta discendente, l'arteria femorale e le arterie iliache comuni(Figura 1A), poc...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Descriviamo un protocollo per identificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi utilizzando un protocollo di doppia immunoetichettatura e la microscopia immunofluorescenza. Anche se solo i trombi arteriosi cardiogenici sono stati macchiati, in teoria questo protocollo potrebbe essere utilizzato per altri tipi di trombi e in altre specie veterinarie. L'identificazione di NET all'interno del trombbi arterioso felino suggerisce che i NET possono svolgere un ruolo nella trombosi nei gatti.
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I gatti con cardiomiopatia ipertrofica sono a rischio di complicazioni tromboemboliche pericolose per la vita1,2. Nonostante l'elevata morbilità e mortalità associata al trombboembolismo arterioso cardiogenico felino (CATE), la fisiopatologia sottostante di CATE nei gatti è poco compresa. Ci sono anche strumenti diagnostici e terapeutici limitati per trattare e identificare i gatti a rischio di questa condizione devastante3.
Oltre al suo ruolo nell'immunità innata, i neutrofili hanno dimostrato di svolgere un ruolo nella trombosi rilasciando trappole extracellulari neutrofiche (NET), che sono reti simili a reti di DNA privo di cellule (cfDNA) incrostate di istoni e proteine granulari come elastasi neutrofili (NE) e mieloperossia. Neutrofili sottoposti formazione NETs in risposta all'infiammazione sistemica, incontro diretto con gli agenti patogeni, e l'interazione con piastrine attivate4,5,6,7. Nei cani, il DNA derivato dal neutrofia ha dimostrato di inibire la lisi del coagulo, mentre le proteine NET accelerano la formazione di coaguli. La capacità dei NET di intrappolare le cellule circolanti e i componenti di coagulazione è anche fondamentale per le loro proprietà trombogene8,9,10,11,12.
I NET sono rilevati dalla co-localizzazione di proteine neutrofili extracellulari, istoni e cfDNA. Per questo motivo, l'identificazione e la quantificazione di NET nei tessuti fissi mediante immunofluorescenza dei tessuti deparaffinati è superiore alla tradizionale ematossia (H&E) macchia utilizzando la microscopia a campo luminoso4,5. Diversi studi umani che utilizzano la microscopia immunofluorescenza hanno identificato i NET come componenti strutturali dei trombi coronarici, dei trombi dell'ictus cerebrale, dell'atrombromosi e dei trombi venosi13,14,15,16,17. Ad oggi, non è stato descritto un metodo standardizzato per rilevare e quantificare i NET nei trombi felini. Poiché l'identificazione dei NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini può facilitare la futura ricerca traslazionale in NET e trombosi, descriviamo tecniche di identificazione e valutazione della rete nei trombi arteriosi incorporati nella paraffina nei gatti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Le trappole extracellulari neutrophil (NET), composte da DNA privo di cellule (cfDNA) e proteine come gli istoni e l'elastasi dei neutrofili (NE), vengono rilasciate dai neutrofili in risposta all'infiammazione sistemica o agli agenti patogeni. Anche se in precedenza i NET hanno dimostrato di aumentare la formazione di coaguli e inibire la fibrinolisi negli esseri umani e nei cani, il ruolo dei NET nei gatti con tromboembolismo arterioso cardiogenico (CATE), una complicazione pericolosa per la vita secondaria alla cardiomiopatia ipertrofica , non è noto. Un metodo standardizzato per identificare e quantificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici nei gatti farà progredire la nostra comprensione del loro ruolo patologico in CATE. Qui, descriviamo una tecnica per identificare i NET nei trombi di formaldeide-fissi e di paraffina-embedded all'interno della biforcazione aortica, estratta durante la necropsia. Dopo la deparaffinazione con lo xilene, le sezioni aortiche sono sottoposte al recupero indiretto dell'antigene indotto dal calore. Le sezioni sono state poi bloccate, permeabilizzate e i NET ex vivo sono stati identificati mediante la co-localizzazione del DNA privo di cellule (cfDNA), il citrullinato l'istone H3 (citH3) e l'elastasi neutrofila (NE) usando la microscopia immunofluoresce. Per ottimizzare l'immunorilevamento dei NET nei trombi, l'autofluorescenza degli elementi tissutali è stata limitata utilizzando un processo di spegnimento dell'autofluorescenza prima della microscopia. Questa tecnica potrebbe essere uno strumento utile per studiare NET e trombosi in altre specie e offre nuove intuizioni sulla fisiopatologia di questa complessa condizione.

Utilizzando questo protocollo per la deparaffinizzazione, il recupero di antigeni indotti dal calore e la doppia immunoetichettatura dei trombi incorporati nella paraffina, abbiamo identificato per la prima volta i NET in felino CATE. I trombi all'interno della biforcazione aortica sono stati localizzati mediante microscopia a fluorescenza e microscopia a campo luminoso utilizzando la colorazione H&E standard e la microscopia a contrasto di fase. Sulla microscopia a campo luminoso, i trombi arteriosi felini consistevano ...

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Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.

Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Questo protocollo della parafinizzazione seguito dal recupero dell'antigene delle sezioni aortiche incorporate nella paraffina può essere uno strumento utile per studiare il ruolo delle trappole tricellulari neutrofile nella trombosi felina. Il rilevamento di trappole tricellulari neutrofile mediante immunofluorescenza nel tessuto fisso e incorporato nella paraffina, è superiore agli stent istologici convenzionali come l'HNE, in quanto consente il rilevamento simultaneo di DNA più sicuro e proteine extracellulari. Questo protocollo può essere utilizzato in altri tipi di trombi e in altre specie veterinarie.L'identificazione di trappole extracellulari neutrofile all'interno di trombi arteriosi felini suggerisce che possano svolgere un ruolo nella trombosi nei gatti. I protocolli qui presentati sono linee guida. Incoraggiamo vivamente gli investigatori ad regolare la durata e le condizioni del processo di recupero dell'antigene per fornire un segnale soddisfacente.Per utilizzare un sistema automatizzato per eseguire la deparaffinizzazione e la reidratazione delle sezioni su vetrini, posizionare gli scivoli di vetro in rack. Immergersi completamente in salina al 100% per tre minuti. Ripetere questo passaggio due volte.Non risciacquare tra un passo e l'altro. Immergersi completamente in concentrazioni decrescenti di etanolo a temperatura ambiente tre volte per tre minuti ciascuna. Immergersi completamente in acqua deionizzata per due minuti e ripetere ancora una volta.Dopo il trattamento con TBST, riempire il serbatoio con acqua deionizzata riscaldata a 100 gradi Celsius. Lasciare equilibrare la camera del piroscafo per 20 minuti. Su una piastra termica, riscaldare la soluzione di recupero dell'antigene disponibile in commercio contenente Tris ed EDTA a pH da 9,0 a 95-97 gradi Celsius.Assicurarsi che non bolle. Suberge gli scivoli completamente nella soluzione di recupero dell'antigene riscaldato e continuare l'applicazione del riscaldamento esterno tramite il piroscafo per 20 minuti. Quindi, lavare le diapositive tre volte con TBST per cinque minuti.Ora, posizionare le sezioni nel buffer di blocco 1. Incubare per due ore a temperatura ambiente a dondolo delicato tra i 30 e i 50 giri/min. Senza lavaggio, applicare immediatamente 100 microlitri di anticorpo istone H3 citrullinato policlonale di coniglio diluito direttamente sullo scivolo.Posizionare un foglietto di copertura su ogni sezione per consentire una distribuzione uniforme della miscela di anticorpi. Incubare per 12-16 ore a quattro gradi Celsius con un dolce dondolo. Successivamente, lavare gli scivoli tre volte con TBST per cinque minuti ogni volta.Per applicare anticorpi, utilizzare una pipetta e distribuire uniformemente 100 microlitri di anticorpi anti-coniglio di capra coniugati ad Alexa Fluor 488. Coprire i vetrini con un foglio di latta e incubare gli scivoli per un'ora a temperatura ambiente sotto un leggero dondolo. Dopo il lavaggio con TBST secondo il manoscritto, incubare le sezioni nel tampone di blocco 2 durante la notte a quattro gradi celsius sotto un dolce dondolo.Proteggiti dalla luce. Lavare con TBST tre volte per cinque minuti ogni volta. Bloccare le sezioni nel buffer di blocco 3 come fatto in precedenza a temperatura ambiente per due ore sotto un leggero dondolo.Incubare le sezioni con anticorpo dell'elastasi neutrofila anti-umano del coniglio ploiclonale biotina a quattro gradi Celsius per 12-16 ore come descritto in precedenza. Dopo il lavaggio con TBST incubare gli scivoli con Alexa Fluor 594 Streptavidin Coniugato per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare con TBST una volta per cinque minuti.Applicare 100 microlitri di miscela di soluzione di tempra autofluorescenza direttamente sulle sezioni per un minuto, come indicato dal produttore. Lavare immediatamente gli scivoli con TBST sei volte per 10 minuti ogni volta. Coprire ogni diapositiva con 100 microlitri di 300 DAPI nanomolare per cinque minuti al buio.Quindi lavare con TBST cinque volte per tre minuti ogni volta. Applicare una goccia di mezzo di montaggio antifade direttamente sullo scivolo di vetro che circonda la sezione. Posizionare delicatamente un coperchio sulla sezione senza creare bolle.Lasciare che i campioni si curino durante la notte al buio a quattro gradi Celsius. Per localizzare trombi, scansionare cranicamente per caudally lungo la lunghezza dell'aorta, della biforcazione aortica e di ogni arteria femerale usando la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 10x. Esaminare innanzitutto le sezioni per il DNA privo di cellule utilizzando il canale DAPI con l'eccitazione a 357 e 44 nanometri.Identificare l'elastasi neutrofila extracellulare e l'istono citrullinato H3 rispettivamente sui canali delle proteine fluorescenti rosse e verdi del Texas. Mantieni un tempo di esposizione costante e guadagni di ogni canale durante l'acquisizione delle immagini per evitare la saturazione dell'intensità dei pixel. Le trappole extracellulari neutrofile sono identificate sulla co-localizzazione basata sull'elastasi neutrofila, sull'istono citrullinato H3 e sul DNA privo di cellule.Usando la macchia di ematossilina ed eosina e la microscopia a campo luminoso, i trombi arteriosi felini sono costituiti da globuli rossi, leucociti, fibrina e piastrine. I NET apparivano come reti di fili viola intenso di varie lunghezze che circondavano gli erytrociti e i leucociti vicini. Utilizzando questo protocollo, la microscopia ad immunofluorescenza ha rivelato grandi aggregati di NET composti da DNA privo di cellule, istono extracellulare citrullinato H3 ed elastasi neutrofila.Sotto il contrasto di fase nella microscopia immunitaria, un trombo era caratterizzato come una struttura ben delimitata all'interno dello spazio vascolare. Tuttavia, gli trombi non sono stati rilevati in nessuno dei campioni di controllo. Questa figura dimostra una profonda autofluorescenza di elementi coaguli come gli eriociti quando vengono imageati alla lunghezza d'onda di 488 nanometri.Una breve tempra ad autofluorescenza dopo l'immunoetichettatura ha aumentato significativamente la sensibilità della co-localizzazione proteica e del rilevamento della RETE anche in aree con abbondanza di erillociti. La durata della fissazione in effetti sull'immunoreattività di alcuni antigeni. Si consiglia la fissazione per non più di 24 ore alla pari della disidratazione e dell'incorporamento della paraffina.In alternativa, la paraformaldeide priva di metanolo può essere usata per limitare l'artefatto da acido formico e chetoni dall'ossidazione della formaldeide. Per prevenire interferenze quando si utilizzano anticorpi primari provenienti dalla stessa specie, abbiamo incluso un ulteriore passaggio di blocco per saturare tutti i siti di legame rimanenti sugli anticorpi secondari. Gli investigatori devono includere controlli negativi costituiti da anticorpi dell'isotipo, esclusione di anticorpi primari e fase di immunoeli etichettatura e controlli biologici da parte di gatti senza trombosi.L'autofluorescenza dei limiti tissutali dei trombi può martellare l'identificazione microscopica delle trappole extracellulari neutrofile. Lo sperimentatore può ridurre al minimo la fluorescenza con l'uso di fluorofori rosso lontano. Questa tecnica può essere uno strumento prezioso per lo studio delle trappole extracellulari neutrofile in altre specie veterinarie.Ciò può fornire una migliore comprensione della fisiopatologia della trombosi.

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