Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

この研究は、カリフォルニア大学デービスコンパニオンアニマルヘルスセンター(CCAH 2018-30-F)からの資金によって支えられました。著者らは、ケビン・ウーラード博士が蛍光顕微鏡を使用することを認めたい。

ここで説明するすべての方法は、カリフォルニア大学デービス校の制度的動物管理および使用委員会のガイドラインに従って行われました。組織の壊死と生検は、所有者の同意を得て行われました。
1. 組織固定、埋め込み、切除
<ol><li>大動脈分岐を解剖し、下降大動脈、大腿動脈、および一般的な腸骨動脈(図1A)を含む、人道的安楽死または死亡?...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

我々は、二重免疫標識プロトコルおよび免疫蛍光顕微鏡を用いて、固定ネコ心原性動脈血栓におけるNETを同定するためのプロトコルを記述する。心原性動脈血栓のみが染色されたが、理論的には、このプロトコルは他のタイプの血栓および他の獣医種に使用することができる。ネコの動脈血栓内のNETの同定は、NETが猫の血栓症に役割を果たす可能性があることを示唆している。
<p class="jove...

肥大性心筋症の猫は、生命を脅かす血栓塞栓性合併症のリスクがある 1,,2.猫の心原性動脈血栓塞栓症(CATE)に関連する高い罹患率と死亡率にもかかわらず、猫におけるCATEの基礎となる病態生理は十分に理解されていない。この壊滅的な状態の危険にさらされている猫を治療し、識別するための限られた診断および治療ツールもあります 3.
自然免疫におけるその役割に加えて、好中球は、ヒストンと好中球エラスターゼ(NE)および骨髄ペロペロキシダーゼのような顆粒タンパク質で覆われた無細胞DNA(cfDNA)のウェブのようなネットワークである好中球細胞外トラップ(NETs)を放出することによって血栓症に役割を果たすることが示されている。好中球は、全身性炎症、病原体との直接の遭遇、および活性化された血小板44、5、6、75,6との相互作用に応答してNETs形成を受ける。犬では、好中球由来のDNAが血栓溶血を阻害し、NETタンパク質が血栓形成を加速することが示されている。NETsが循環細胞および凝固成分をトラップする能力は、血栓原性特性88、9、10、11、12の鍵でもあります。,9,10,11,12
NETは細胞外好中球タンパク質、ヒストン、およびcfDNAの共局在化によって検出される。このため、脱パラフィン組織の免疫蛍光による固定組織におけるNETの同定および定量は、明視野顕微鏡44,55を用いた伝統的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色よりも優れている。免疫蛍光顕微鏡を用いたいくつかのヒト研究では、NETsを冠状動脈血栓、脳卒中血栓、アテローム血栓症、静脈血栓13、14、15、16、17の構造成分として同定した。13,14,15,16,17現在までに、ネコ血栓中のNETを検出および定量する標準化された方法は説明されていない。ネコの心原性動脈血栓におけるNETの同定は、NETsおよび血栓症における将来の翻訳研究を促進する可能性があるため、猫におけるパラフィン埋め込まれた動脈血栓におけるNET同定および評価の技術について述べている。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

細胞外トラップ(NET)は、細胞を含まないDNA(cfDNA)とヒストンや好中球エラスターゼ(NE)などのタンパク質から構成され、全身性炎症や病原体に応答して好中球によって放出される。NETsは以前、ヒトや犬の血栓形成を増強し、線維化症を阻害することが示されているが、肥大性心筋症に続く生命を脅かす合併症である心原性動脈血栓塞栓症(CATE)を有する猫におけるNETsの役割は不明です。猫の心原性動脈血栓におけるNETを同定し、定量化する標準化された方法は、CATEにおける病理学的役割の理解を進める。ここでは、壊死中に抽出された大動脈分岐内のホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みトロンビ中のNETを同定する技術について述べている。キシレンとの脱パラフィン後、大動脈切片は間接的に熱誘導抗原の検索を受けた。その後、切片を遮断、透過、およびex vivo NETsを、無細胞DNA(cfDNA)、ヒストンH3(citH3)、および免疫蛍光顕微鏡を用いた好中球エラスターゼ(NE)の共局在化によって同定された。血栓中のNETの免疫検出を最適化するために、組織元素の自己蛍光は顕微鏡検査の前に自己蛍光消光プロセスを用いて制限された。この技術は、他の種のNETおよび血栓症を研究するのに有用なツールとなり、この複雑な状態の病態生理学に関する新しい洞察を提供する可能性がある。

このプロトコルを用いて、パラフィン埋め込み血栓の脱パラフィン化、熱誘導抗原検索、および二重免疫標識を行い、ネコのCATE中のNETを初めて同定した。大動脈分岐内のトロンビは、標準的なH&E染色および位相コントラスト顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡検査によって位置付けられていた。明るいフィールド顕微鏡では、ネコ動脈血栓は赤血球、白血球、フィブリン、および血小...

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Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

熱誘導抗原検索と二重免疫標識プロトコルを用いてホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みネコの心原性動脈血栓中の好中球外細胞トラップ(NET)を同定する方法について述べた。

蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

パラフィン化のこのプロトコルは、パラフィンに続いてパラフィン化し、パラフィン埋め込まれた大動脈切片の抗原検索を行い、ネコ血栓症における好中球三細胞トラップの役割を研究するのに有用なツールであり得る。固定およびパラフィン埋め込み組織における免疫蛍光による好中球三細胞トラップの検出は、HNEのような従来の組織学的ステントより優れているため、より安全なDNAと細胞外タンパク質の同時検出が可能である。このプロトコルは、他のタイプの血栓および他の獣医種で使用することができる。ネコの動脈血栓中の好中球外細胞トラップの同定は、猫の血栓症に役割を果たす可能性があることを示唆している。ここで示すプロトコルはガイドラインです。我々は、研究者が抗原検索プロセスの持続時間及び条件を調整し、満足のいくシグナルを生み出すことを強く推奨する。自動システムを使用して、ガラススライド上のセクションの脱パラフィン化と再水和を実行するには、ガラススライドをラックに配置します。3分間100パーセント生理文で完全に水没します。この手順を 2 回繰り返します。ステップ間でリンスしないでください。室温で3回、3分間、エタノール濃度を減少させて完全に沈水します。2分間脱イオン水に完全に沈み、もう一度繰り返します。TBSTで処理した後、100°Cに加熱脱イオン水で貯水池を充填します。蒸気室を20分間平衡させます。ヒートプレート上で、TrisとEDTAを含む市販の抗原検索溶液をpH 9.0〜95〜97°Cで加熱します。沸騰しないようにしてください。熱い抗原の検索の解決のスライドを完全にスベルジュし、20分間、蒸し器を介して外部加熱の適用を続ける。次に、スライドをTBSTで3回5分間洗います。次に、ブロックバッファ1にセクションを配置します。30~50rpmの穏やかな揺れ下で室温で2時間インキュベートします。洗浄せずに、すぐに100マイクロリットルの希釈ウサギポリクローナル抗ヒトシトルリン化ヒストンH3抗体をスライドに直接塗布する。各セクションにカバースリップを置き、抗体混合物の均等な分布を可能にする。穏やかな揺れで摂氏4度で12〜16時間インキュベートします。その後、スライドをTBSTで3回洗い、毎回5分間洗います。抗体を適用するには、ピペットを使用し、アレクサFluor 488に結合したヤギ抗ウサギ抗体の100マイクロリットルを均等に配布します。スズ箔でスライドを覆い、穏やかな揺れの下で室温で1時間スライドをインキュベートします。原稿によるとTBSTで洗浄した後、緩やかな揺れ下で摂氏4度で一晩ブロッキングバッファ2にセクションをインキュベートする。光から保護します。TBSTで3回5分間洗います。緩やかな揺れ下で2時間室温で行われたようにブロッキングバッファ3のセクションをブロックします。先に説明した4°Cの抗ヒト好中球エラスターゼ抗体をビオチン・ラッド・プロイクローナル・エラスターゼ抗体で12〜16時間インキュベートする。TBSTで洗浄した後、室温で1時間アレクサフルーオール594ストレプトアビジンコンジュゲートでスライドをインキュベートします。その後、TBSTで1回5分間洗います。100マイクロリットルのオートフルオレセンスクエンチン化溶液混合物を、メーカーの指示に従って1分間、セクションに直接塗布します。すぐにTBSTでスライドを6回、毎回10分間洗います。各スライドを300ナノモルDAPIの100マイクロリットルで暗い5分間覆います。その後、TBSTで3分間5回洗います。アンチフェード実装メディアのドロップを、セクションの周囲のガラススライドに直接塗布します。気泡を作成せずに、カバースリップをセクションにそっと置きます。サンプルが摂氏4度で暗闇の中で一晩治るようにします。血栓を見つけるには、10倍の目的を持つ位相コントラスト顕微鏡を用いて、大動脈、大動脈分岐および各女性動脈の長さに沿って頸部にスキャンする。まず、357ナノメートルと44ナノメートルの励起を用いてDAPIチャネルを使用して無細胞DNAのセクションを調べる。テキサス州の赤および緑色蛍光タンパク質チャネル上で、細胞外好中球エラスターゼとシトルリン化ヒストンH3をそれぞれ同定します。ピクセルの輝度の飽和を避けるために、画像の取得を通じて各チャンネルの一貫した露出時間とゲインを維持します。好中球外細胞トラップは、好中球エラスターゼの共局在化、ヒストンH3および無細胞DNAの同局化に基づいて同定される。ヘマトキシリンとエオシン染色、および明視野顕微鏡を使用して、ネコ動脈血栓は赤血球、白血球、フィブリンおよび血小板で構成される。NETsは、近くの赤血球と白血球を取り巻く様々な長さの深い紫色の糸のネットワークとして現れました。このプロトコルを用いて、免疫蛍光顕微鏡は、無細胞DNA、細胞外シトルリン化ヒストンH3および好中球エラスターゼからなるNETの大規模な凝集体を明らかにした。免疫顕微鏡における位相コントラストの下で、血栓は血管空間内の十分に区分された構造として特徴付けられていた。しかし、いずれの対照試料でも血栓は検出されなかった。この図は、488ナノメートルの波長で画像化した赤血球のような血栓元素の深遠な自己蛍光を示しています。免疫標識後の簡単な自己蛍光の急な消光は、赤血球が豊富な領域でもタンパク質共局在化およびNET検出の感度を有意に増加させた。固定の持続時間は、特定の抗原の免疫反応性に影響を及ぼす。脱水とパラフィンの埋め込み24時間以下の固定をお勧めします。あるいは、メタノールフリーパラホルムアルデヒドを用いることで、ホルムアルデヒドの酸化によるギ酸およびケトンによる加工品を制限することができる。同じ種から発生した一次抗体を使用する際の干渉を防ぐために、我々は二次抗体上の残りの結合部位を飽和させる追加のブロッキングステップを含む。研究者は、アイソタイプ抗体、一次抗体および免疫標識ステップの排除、血栓症のない猫からの生物学的制御からなる陰性対照を含まなければならない。血栓の組織限界の自己蛍光は、好中球の細胞外トラップの顕微鏡的同定を打ち負かすことができる。研究者は、遠赤色蛍光体を使用することにより蛍光を最小限に抑えることができます。この技術は、他の獣医種における好中球細胞外トラップの研究に貴重なツールであり得る。これは、血栓症の病態生理学のより良い理解を提供することができます.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...