Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

연구 결과는 캘리포니아 대학, 데이비스, 반려동물 건강을 위한 센터 (CCAH 2018-30-F)에서 기금에 의해 지원되었습니다. 저자는 형광 현미경의 사용에 대한 케빈 울라드 박사를 인정하고 싶습니다.

여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 대학교 데이비스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 조직의 부검 및 생검은 소유자의 동의하에 수행되었습니다.
1. 조직 고정, 포함 및 단면화
<ol><li>내림차순 대동맥, 대퇴 동맥 및 일반적인 선장동맥(그림1A)을포함한 대동맥 분기를 해부하고, 인도적인 안락사 또는 사망 직후에 해?...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. 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H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. 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F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

우리는 이중 면역 표지 프로토콜 및 면역 형광 현미경 검사법을 사용하여 고정 된 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하는 프로토콜을 설명합니다. 비록 심인성 동맥 혈전만 얼룩이 있었지만, 이론적으로이 프로토콜은 다른 유형의 트롬비와 다른 수의종에 사용될 수 있습니다. 고양이 동맥 혈전 내의 NET를 식별하는 것은 NET가 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
<p class="jov...

비대성 심근병증을 가진 고양이는 생명을 위협하는 혈전색전성 합병증1,,2의위험이 있습니다. 고양이 심인성 동맥 혈전 색전증 (CATE)과 관련된 높은 사망률및 사망률에도 불구하고 고양이의 CATE의 근본적인 병리학은 제대로 이해되지 않습니다. 이 치명적인 상태의 위험에 고양이를 치료하고 식별하는 제한된 진단 및 치료 도구도 있습니다3.
선천성 면역에 있는 그것의 역할 이외에, 호중구는 호중구 세포 외 트랩 (NETs)를 풀어 놓음으로써 혈전증에 있는 역할을 하기 위하여 보였습니다, 이는 호중구 엘라스타제 (NE) 및 골수로파소와 같은 히스톤과 과립 단백질로 둘러싸인 무세포 DNA (cfDNA)의 웹 같은 네트워크인. 호중구는 전신 염증, 병원균과의 직접적인 만남 및 활성화 된 혈소판과의 상호 작용에 대한 응답으로 NETs 형성을 겪습니다4,,5,6,,7. 개에서 호중구 유래 DNA는 응고 용해를 억제하는 것으로 나타났으며 NET 단백질은 혈전 형성을 가속화합니다. 순환 세포 및 응고 성분을 트랩하는 NET의 능력은 또한 혈전 특성8,,9,10,,11,,12의핵심입니다.,
NET는 세포외 호중구 단백질, 히스톤 및 cfDNA의 동국화에 의해 검출됩니다. 이 때문에, 탈파라핀화된 조직의 면역형광에 의한 고정된 조직에서 의한 NET의 식별 및 정량화는 밝은 필드 현미경 을 사용하여 기존의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 얼룩보다 우수하다4,,5. 면역형광 현미경을 이용한 여러 인간 연구는 관상동맥 혈전, 대뇌 뇌졸중 혈전, 아테로스롬보증 및 정맥혈전13,,14,,15,,16,,17의구조적 성분으로 NETs를 확인하였다. 현재까지, 고양이 혈전에서 NET를 검출하고 정량화하는 표준화된 방법은 기술되지 않았다. 고양이 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하면 NET및 혈전증의 향후 번역 연구를 촉진 할 수 있기 때문에, 우리는 고양이의 파라핀 내장 동맥 혈전에서 NET 식별 및 평가의 기술을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

무세포 DNA(cfDNA)와 히스톤 및 호중구 엘라스타아제(NE)와 같은 단백질로 구성된 호중구 세포외 트랩(NETs)은 전신 염증이나 병원체에 반응하여 호중구에 의해 방출됩니다. NET는 이전에 인간과 개에서 혈전 형성을 증가시키고 섬유소 용해를 억제하는 것으로 나타났지만, 비대성 심근증에 이차적인 생명을 위협하는 합병증인 심인성 동맥 혈전색전증 (CATE)을 가진 고양이의 NET의 역할 을 참조하십시오. 고양이의 심인성 동맥 혈전에서 NET를 식별하고 정량화하는 표준화된 방법은 CATE에서의 병리학적 역할에 대한 이해를 증진시킬 것입니다. 여기에서, 우리는 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 혈전에서 NET를 식별하는 기술을 설명합니다 대동맥 분기 내에서, 부검 중에 추출. 자일렌으로 탈파화 한 후, 대동맥 절은 간접 열 유발 항원 검색을 시행했다. 단면도는 그 때, 투과되고, ex vivo NETs는 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 무세포 DNA (cfDNA), 시트룰린화된 히스톤 H3(citH3), 및 호중구 엘라스타제(NE)의 공동 국소화에 의해 확인되었다. 혈전에서 NET의 면역 검출을 최적화하기 위해, 조직 원소의 자가형광은 현미경 검사법 전에 자가형광 담금질 과정을 사용하여 제한되었다. 이 기술은 그밖 종에 있는 NETs 그리고 혈전증을 공부하는 유용한 공구일 수 있고 이 복잡한 조건의 병리생리학에 새로운 통찰력을 제안합니다.

파라핀화, 열 유발 항원 회수 및 파라핀 내장 트롬비의 이중 면역 라벨링을 위해 이 프로토콜을 사용하여 고양이 CATE에서 처음으로 NET를 확인했습니다. 대동맥 분기 내의 Thrombi는 표준 H&E 염색 및 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 형광 현미경 검사법 및 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 위치했습니다. 밝은 필드 현미경 검사법에, 고양이 동맥 혈전은 적혈구, 백혈구, 피브린 및 혈소판으로 이루...

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Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

우리는 열 유도 항원 회수 및 이중 면역 표지 프로토콜을 사용하여 포름알데히드 고정 및 파라핀 내장 고양이 심원 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩 (NETs)을 식별하는 방법을 설명합니다.

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

파라핀 에베디드 대동맥 섹션의 항원 회수에 이어 파라핀 삽입 대동맥 절제물의 이러한 프로토콜은 고양이 혈전증에서 호중구 삼세포 트랩의 역할을 연구하는 유용한 도구가 될 수 있다. 고정 및 파라핀 임베디드 조직에서 면역 형광에 의한 호중구 삼세포 트랩의 검출은 HNE와 같은 기존의 조직학적 스텐트보다 우수하며, 안전한 DNA 및 세포 외 단백질의 동시 검출을 허용합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 혈전 및 기타 수의종에서 사용할 수 있습니다.고양이 동맥 혈전 내에서 호중구 세포 외 트랩의 식별은 고양이의 혈전증에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 여기에 제시된 프로토콜은 지침입니다. 우리는 연구원이 만족스러운 신호를 산출하기 위해 항원 검색 과정의 지속 시간과 조건을 조정하는 것을 강력히 권장합니다.자동화된 시스템을 사용하여 유리 슬라이드의 섹션의 분리 및 재수화를 수행하려면 유리 슬라이드를 랙에 배치합니다. 3 분 동안 100 % 식염수에 완전히 잠급. 이 단계를 두 번 반복합니다.단계 사이에 헹지 마십시오. 실온에서 에탄올 농도를 3분씩 3회 감소시키는 데 완전히 잠급한다. 2 분 동안 탈이온 된 물에 완전히 잠그고 한 번 더 반복하십시오.TBST로 처리 한 후, 100섭씨까지 가열 된 탈이온 된 물로 저수지를 채웁니다. 증기선이 20분 동안 평형화되도록 합니다. 열판에서 트리스와 EDTA를 포함하는 시판가능한 항원 검색 용액을 pH 9.0 ~ 95 ~97도에서 가열합니다.끓지 않도록 하십시오. 가열된 항원 검색 용액에서 슬라이드를 완전히 구부리고 증기선을 통해 외부 가열을 20 분 동안 계속합니다. 다음으로 TBST로 슬라이드를 3번 세척하여 5분간 세척합니다.이제 섹션을 차단 버퍼 1에 배치합니다. 30~50rpm 사이의 부드러운 흔들림 아래 실온에서 2시간 동안 배양하세요. 세척없이 즉시 희석 된 토끼 폴리클론 항인간 시트룰러 히스톤 H3 항체100 마이크로 리터를 슬라이드에 직접 적용하십시오.항체 혼합물의 균일한 분포를 허용하기 위해 각 섹션에 커버 슬립을 놓습니다. 부드러운 흔들림으로 섭씨 4도에서 12~16시간 동안 배양하세요. 그 후, 매번 TBST로 슬라이드를 세 번 씻습니다.항체를 적용하려면 파이펫을 사용하고 알렉사 플루어(488)에 공주된 염소 항토끼 항체 100마이크로리터를 고르게 분배한다. 주석 호일로 슬라이드를 덮고 부드러운 흔들림 아래 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 배양하십시오. 원고에 따르면 TBST로 세척 한 후 완충2를 막는 섹션을 부드러운 흔들림 아래 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.빛으로부터 보호하십시오. TBST로 매번 5분간 세 번 씻으시면 됩니다. 완충제 3을 차단하는 섹션을 부드러운 흔들림 아래에서 2시간 동안 실온에서 했던 것처럼 차단합니다.이전에 설명한 바와 같이 12~16시간 동안 4도에서 비오틴 래드 계포계종 토끼 항인간 호중구 엘라스타제 항체로 섹션을 배양한다. TBST로 세척한 후 알렉사 플루어 594 스트렙타비딘 컨쥬게이트와 함께 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 그 후, TBST로 5 분 동안 한 번 씻으시면 됩니다.제조업체의 지시에 따라 1분 동안 1분 동안 100마이크로리터의 오토플루오레스향 담금질 용액 혼합물을 섹션에 직접 적용합니다. TBST로 슬라이드를 매번 10분 동안 6회 즉시 세척합니다. 각 슬라이드를 300 나노몰러 DAPI의 100마이크로리터로 5분간 덮습니다.그런 다음 TBST로 매번 3분간 5회 세척합니다. 단면을 둘러싼 유리 슬라이드에 직접 페이드 장착 매체한방울을 발라주세요. 거품을 만들지 않고 커버 슬립을 섹션에 부드럽게 놓습니다.샘플이 섭씨 4도에서 어둠 속에서 하룻밤 동안 치료하도록 허용하십시오. 혈전을 찾으려면 대동맥, 대동맥 분비화 및 각 태아 동맥의 길이를 따라 10배 의 목표를 가진 위상 대비 현미경 검사를 사용하여 소생하여 스캔합니다. 먼저 357 및 44 나노미터에서 여기를 가진 DAPI 채널을 사용하여 세포없는 DNA에 대한 섹션을 검사합니다.텍사스 적색 및 녹색 형광 단백질 채널에서 세포외 호중구 엘라스테아제및 시트룰러 히스톤 H3를 각각 식별합니다. 픽셀 강도의 포화를 방지하기 위해 이미지 수집 기간 동안 각 채널의 일관된 노출 시간과 이득을 유지합니다. 호중구 세포 외 트랩은 호중구 엘라스테아제, 시트룰러 히스톤 H3 및 세포 없는 DNA의 기반 공동 국소화를 확인합니다.헤마톡시린과 에오신 얼룩, 그리고 브라이트필드 현미경검사를 사용하여 고양이 동맥 혈전은 적혈구, 백혈구, 피브린 및 혈소판으로 구성됩니다. NET는 근처의 적혈구와 백혈구를 둘러싼 다양한 길이의 깊은 보라색 스레드의 네트워크로 나타났습니다. 이 프로토콜을 사용하여 면역 형광 현미경 검사법은 세포없는 DNA, 세포 외 세포 세포 석회 분해 히스톤 H3 및 호중구 엘라스타아제로 구성된 NET의 큰 골재를 밝혀냈습니다.면역 현미경 검사법의 위상 대조하에서, 혈전은 혈관 공간 내의 잘 경계구조로 특징지어졌다. 그러나, 혈전은 어떤 대조군 샘플에서도 검출되지 않았다. 이 그림은 488 나노미터 파장에서 이미지될 때 적혈구와 같은 응고 원소의 심오한 자동 형광을 보여줍니다.면역 라벨링 후 간단한 자동 불발 담금질은 적혈구가 풍부한 지역에서도 단백질 공동 국소화 및 NET 검출의 감도를 크게 증가시켰습니다. 고정 의 지속 기간은 특정 항원의 면역 반응성. 24시간 이상 탈수와 파라핀 포함을 하지 않는 것이 좋습니다.또는 메탄올이 없는 파라포름알데히드는 포름알데히드산화로부터 포름산과 케톤에 의해 유물을 제한하는 데 사용될 수 있다. 동일한 종에서 유래된 1차 항체를 사용할 때 간섭을 방지하기 위해, 우리는 이차 항체에 남아있는 결합 부위를 포화시키는 추가 차단 단계를 포함했다. 조사원은 등류형 항체로 구성된 부정적인 통제, 1 차적인 항체 및 면역 라벨링 단계 및 혈전증없이 고양이의 생물학적 통제를 배제해야 합니다.혈전염의 조직 한계의 자동 불발성은 호중구 세포 외 트랩의 현미경 식별을 망치 수 있습니다. 조사자는 극한형형광을 사용하여 형광을 최소화할 수 있다. 이 기술은 그밖 수의학 종에 있는 호중구 세포 외 덫의 연구를 위한 귀중한 공구일 수 있습니다.이것은 혈전증의 병리생리학의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...