Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Studien ble støttet av midler fra University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Forfatterne ønsker å anerkjenne Dr. Kevin Woolard for bruk av fluorescensmikroskopet.

Alle metoder beskrevet her ble utført i samsvar med retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Davis. Necropsies og biopsier av vev ble utført med eiernes samtykke.
1. Vevfiksering, innebygging og snitting
<ol><li>Dissekere ut aortabifurcation, inkludert synkende aorta, lårarterien, og de vanlige iliac arteriene (Figur 1A), kort tid etter human eutanasi eller død. Sløv dissekere ut fascia (<strong class="xf...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+Thromboembolism+in+250+Cats+in+General+Practice:+2004-2012.">Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H+&amp;+E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H &amp; E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Li, R., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Review+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Sepsis.">A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).</li><li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state.">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li><li>Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+of+neutrophil+extracellular+traps+towards+atherosclerosis+and+thrombosis.">The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis.</a> Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia.">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+enhance+procoagulant+activity+in+patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma.">Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+substitute+fixatives:+effects+on+nucleic+acid+preservation.">Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation.</a> Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).</li><li>Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+formalin+fixation+and+antigen+retrieval+with+bovine+pancreatic+RNase+A+II.+Interrelationship+of+cross-linking,+immunoreactivity,+and+heat+treatment.">Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).</li><li>Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Vi beskriver en protokoll for å identifisere NETs i fast feline kardiogent arteriell trombi ved hjelp av en dobbel immunmerking protokoll og immunofluorescens mikroskopi. Selv om bare kardiogene arterielle trombi ble farget, kan denne protokollen i teorien brukes til andre typer trombi og i andre veterinærarter. Identifikasjon av NETs innenfor feline arteriell trombi antyder at NETs kan spille en rolle i trombose hos katter.
Påvisning av NETs ved immunofluorescens i fast og parafininnebygd ...

Katter med hypertrofisk kardiomyopati er i fare for livstruende tromboemboliske komplikasjoner1,2. Til tross for den høye sykelighet og dødelighet forbundet med feline kardiogent arteriell tromboembolisme (CATE), er den underliggende patofysiologien til CATE hos katter dårlig forstått. Det er også begrenset diagnostiske og terapeutiske verktøy for å behandle og identifisere katter i fare for denne ødeleggende tilstanden3.
I tillegg til sin rolle i medfødt immunitet, nøytrofiler har vist seg å spille en rolle i trombose ved å slippe nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), som er web-lignende nettverk av celle-fri DNA (cfDNA) encrusted med histoner og granulære proteiner som nøytrofile elastase (NE) og myeloperoxidase. Nøytrofiler gjennomgår NETs formasjon som svar på systemisk betennelse, direkte møte med patogener og interaksjon med aktiverte blodplater4,,5,,6,7. Hos hunder har nøytrofilavledet DNA vist seg å hemme koagulasjonslyse, mens NET-proteiner akselererer koagulasjonsdannelse. NeTs evne til å fange sirkulerende celler og koagulasjonskomponenter er også nøkkelen til deres trombogene egenskaper8,,9,,10,,11,,12.
NETs oppdages ved samlokalisering av ekstracellulære nøytrofile proteiner, histoner og cfDNA. På grunn av dette er identifisering og kvantifisering av NETs i faste vev ved immunofluorescens av deparaffinert vev bedre enn tradisjonell hematoksyslin og eosin (H&E) flekk ved hjelp av lyse feltmikroskopi4,5. Flere humane studier ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi identifisertNETer som strukturelle komponenter av koronararteriell trombi, cerebral hjerneslag trombi, attherothrombosis, og venøs trombi13,14,15,16,17. Hittil er det ikke beskrevet en standardisert metode for å oppdage og kvantifisere NETs i feline trombi. Fordi identifisering av NETs i feline kardiogene arterielle trombi kan lette fremtidig translasjonell forskning i NETs og trombose, beskriver vi teknikker for NETTO identifikasjon og vurdering i parafininnebygd arteriell trombi hos katter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Nøytrofile ekstracellulære feller (NETs), bestående av cellefritt DNA (cfDNA) og proteiner som histoner og nøytrofile elastase (NE), frigjøres av nøytrofiler som svar på systemisk betennelse eller patogener. Selv om NETs tidligere har vist seg å forsterke koagulasjonsdannelse og hemme fibrinolyse hos mennesker og hunder, har netenes rolle hos katter med kardiogen arteriell tromboembolisme (CATE), en livstruende komplikasjon sekundær truende til hypertrofisk kardiomyopati , er ukjent. En standardisert metode for å identifisere og kvantifisere NETs i kardiogene arterielle trombi hos katter vil fremme vår forståelse av deres patologiske rolle i CATE. Her beskriver vi en teknikk for å identifisere NETs i formaldehyd-fast og parafininnebygd trombi innenfor aortabifurcation, ekstrahert under necropsy. Etter deparaffinisering med xylen gjennomgikk aortaseksjoner indirekte varmeindusert antigengjenfinning. Seksjoner ble deretter blokkert, permeabilisert, og ex vivo NETs ble identifisert ved kolokalisering av cellefri DNA (cfDNA), citrullinert histone H3 (citH3) og nøytrofile elastase (NE) ved hjelp av immunofluorescensmikroskopi. For å optimalisere immundeteksjonen av NETs i trombi, ble autofluorescens av vevselementer begrenset ved hjelp av en autofluorescensssinfeksjonsprosess før mikroskopi. Denne teknikken kan være et nyttig verktøy for å studere NETs og trombose i andre arter og gir ny innsikt i patofysiologien til denne komplekse tilstanden.

Ved hjelp av denne protokollen for deparaffinisering, varmeindusert antigengjenfinning og dobbel immunmerking av parafininnebygd trombi, identifiserte vi NETs i feline CATE for første gang. Trombi innenfor aortabifurcation ble plassert ved fluorescens mikroskopi og lyse feltmikroskopi ved hjelp av standard H & E farging og fase kontrast mikroskopi. På lyse feltmikroskopi besto feline arteriell trombi av røde blodlegemer, leukocytter, fibrin og blodplater (Figur 3A). Selv om H & E ikke kan...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Vi beskriver en metode for å identifisere nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) i formaldehyd-fast og parafin-innebygd feline kardiogent arteriell trombe ved hjelp av varmeindusert antigen gjenfinning og en dobbel immunmerking protokoll.

Identifikasjon av nøytrofile ekstracellulære feller i parafininnebygd feline arteriell trombi ved hjelp av immunofluorescens mikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Denne protokollen for parafinisering etterfulgt av antigenhenting av parafin-innebygde aortaksjoner kan være et nyttig verktøy for å studere rollen som nøytrofile tricellulære feller i feline trombose. Påvisning av nøytrofile tricellulære feller ved immunofluorescence i fast og parafin-innebygd vev, er bedre enn konvensjonelle histologiske stenter som HNE, da det tillater samtidig påvisning av sikrere DNA og ekstracellulære proteiner. Denne protokollen kan brukes i andre typer trombi og i andre veterinærarter.Identifisering av nøytrofile ekstracellulære feller i feline arteriell trombi tyder på at de kan spille en rolle i trombose hos katter. Protokoller som presenteres her er retningslinjer. Vi oppfordrer på det sterkeste etterforskerne til å justere varigheten og betingelsene for antigenhentingsprosessen for å gi et tilfredsstillende signal.Hvis du vil bruke et automatisert system til å utføre deparaffinisering og rehydrering av seksjonene på glasssklier, plasserer du glassskliene i stativer. Senk helt ned i 100 prosent saltvann i tre minutter. Gjenta dette trinnet to ganger.Ikke skyll mellom trinnene. Senk helt ned i synkende konsentrasjoner av etanol ved romtemperatur tre ganger i tre minutter hver. Senk helt ned i deionisert vann i to minutter og gjenta en gang til.Etter behandling med TBST, fyll reservoaret med deionisert vann oppvarmet til 100 grader Celsius. La dampkammeret likevekt i 20 minutter. På en varmeplate, varme den kommersielt tilgjengelige antigen gjenfinningsløsningen som inneholder Tris og EDTA ved pH 9,0 til 95 til 97 grader Celsius.Sørg for at det ikke koker. Del lysbildene helt i den oppvarmede antigenhentingsløsningen og fortsett påføringen av ekstern oppvarming via dampbåten i 20 minutter. Deretter vasker du lysbildene tre ganger med TBST i fem minutter.Plasser nå delene i blokkeringsbuffer 1. Inkuber i to timer ved romtemperatur under mild gynge mellom 30 og 50 omdr./min. Uten vask, umiddelbart bruke 100 mikroliter av fortynnet kanin polyklonal anti-menneskelig citrullinated histone H3 antistoff direkte på lysbildet.Plasser en dekselslipp på hver seksjon for å tillate jevn fordeling av antistoffblandingen. Inkuber i 12 til 16 timer ved fire grader Celsius med mild gynge. Deretter vasker du lysbildene tre ganger med TBST i fem minutter hver gang.For å bruke antistoff, bruk en pipet og jevnt fordel 100 mikroliter geit anti-kanin antistoff konjugert til Alexa Fluor 488. Dekk lysbildene med tinnfolie og inkuber lysbildene i en time ved romtemperatur under mild gynge. Etter vask med TBST i henhold til manuskriptet, inkuber seksjonene i blokkering av buffer 2 over natten på fire grader celsius under mild gynge.Beskytt mot lyset. Vask med TBST tre ganger i fem minutter hver gang. Blokker seksjonene i blokkeringsbuffer 3 som gjort tidligere ved romtemperatur i to timer under skånsom gynge.Inkuber seksjonene med biotin laded ployclonal kanin anti-humant nøytrofilt elase antistoff ved fire grader Celsius i 12 til 16 timer som beskrevet tidligere. Etter vask med TBST inkubere lysbildene med Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate i en time ved romtemperatur. Deretter vasker du med TBST en gang i fem minutter.Påfør 100 mikroliter autofluorescense quenching løsning blanding direkte på seksjonene i ett minutt som instruert av produsenten. Vask straks lysbildene med TBST seks ganger i 10 minutter hver gang. Dekk hvert lysbilde med 100 mikroliter på 300 nanomolar DAPI i fem minutter i mørket.Vask deretter med TBST fem ganger i tre minutter hver gang. Påfør en dråpe antifademonteringsmedium direkte på glasssklien rundt seksjonen. Plasser et deksel forsiktig på seksjonen uten å lage bobler.La prøvene kurere over natten i mørket ved fire grader Celsius. For å finne trombi, skann kranialt til caudally langs lengden av aorta, aorta bifurcation og hver femeral arterie ved hjelp av fasekontrastmikroskopi med et 10x mål. Først undersøke seksjonene for cellefritt DNA ved hjelp av DAPI-kanalen med eksitasjon på 357 og 44 nanometer.Identifiser ekstracellulær nøytrofil elaastase og citrullinated histone H3 på henholdsvis Texas røde og grønne fluorescerende proteinkanaler. Oppretthold konsekvent eksponeringstid og gevinster for hver kanal gjennom hele oppkjøpet av bilder for å unngå metning i pikselintensitet. Nøytrofile ekstracellulære feller identifiseres basert samtidig lokalisering av nøytrofil elaastase, citrullinated histone H3 og cellefritt DNA.Ved hjelp av hematoksylin og eosinflekk, og brightfield mikroskopi, består feline arteriell trombi av røde blodlegemer, leukocytter, fibrin og blodplater. NETs dukket opp som nettverk av dype lilla tråder av ulike lengder rundt nærliggende erytrocytter og leukocytter. Ved hjelp av denne protokollen avslørte immunofluorescence mikroskopi store aggregater av NETs bestående av cellefritt DNA, ekstracellulær citrullinated histone H3 og nøytrofil elaastase.Under fasekontrast i immunmikroskopi ble en trombe karakterisert som en godt avgrenset struktur i det vaskulære rommet. Trombi ble imidlertid ikke påvist i noen av kontrollprøvene. Denne figuren viser dyp autofluoresens av blodproppelementer som erytrocytter når de bildes på 488 nanometer bølgelengde.Kort autofluoresence slukke etter immunolabelling betydelig økt følsomheten av protein co-lokalisering og NET deteksjon selv i områder med en overflod av erytrocytter. Varigheten av fiksering påvirker immunoraktiviteten til visse antigener. Vi anbefaler fiksering for ikke mer enn 24 timer par dehydrering og parafin innebygging.Alternativt kan metanolfri paraformaldehyd brukes til å begrense artefakt av maursyre og ketoner fra oksidasjon av formaldehyd. For å forhindre forstyrrelser ved bruk av primære antistoffer som stammer fra samme art, inkluderte vi ytterligere blokkeringstrinn for å mette eventuelle gjenværende bindingssteder på de sekundære antistoffene. Etterforskerne må inkludere negative kontroller bestående av isotypeantistoffer, utelukkelse av enten primære antistoffer og immunmerkingstrinn og biologiske kontroller fra katter uten trombose.Autofluoresens av vevsgrenser av trombi kan hamre den mikroskopiske identifikasjonen av nøytrofile ekstracellulære feller. Utprøver kan minimere fluorescens ved bruk av fjernrøde fluoroforer. Denne teknikken kan være et verdifullt verktøy for studiet av nøytrofile ekstracellulære feller i andre veterinærarter.Dette kan gi en bedre forståelse av tromboseens patofysiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklede menneske Nøytrofile Ekstracellulære Traps (NET) Isolasjon og håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ påvisning av bakterier innenfor parafininnleiret Vev Bruke en digoksin-merket DNA Probe målretting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder for å studere Lipidendringer av nøytrofile granulocytter og etterfølgende dannelse av Neutrofil Ekstracellulær feller

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere Macrophage ekstracellulære feller bruker AC Confocal mikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisert image-basert kvantifisering av nøytrofile ekstracellulære feller bruke NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologisk og kompositorisk analyse av nøytrofile ekstracellulære feller indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kvantifisering av myeloperoksidase-DNA og nøytrofile elastase-DNA-komplekser fra nøytrofile ekstracellulære feller ved hjelp av en modifisert Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunfluorescensavbildning av nøytrofile ekstracellulære feller i vev fra mennesker og mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...