Name: identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2020-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

O estudo foi apoiado por fundos da Universidade da Califórnia, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Os autores gostariam de reconhecer o Dr. Kevin Woolard pelo uso do microscópio de fluorescência.

Todos os métodos descritos aqui foram executados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Califórnia, Davis. Necropsias e biópsias de tecidos foram realizadas com o consentimento dos proprietários.
1. Fixação de tecidos, incorporação e secção
<ol><li>Dissecar a bifurcação aórtica, incluindo a aorta descendente, a artéria femoral e as artérias ilíacas comuns(Figura 1A),logo após a eutan?...

<ol>
	<li>Maron, B. J., Fox, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy+in+man+and+cats.">Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats.</a> Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).</li><li>Payne, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+indicators+in+cats+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).</li><li>Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-extracellular+traps,+cell-free+DNA+and+immunothrombosis+in+companion+animals:+A+review.">Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review.</a> Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. 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H. L., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Formation:+Dynamic+and+Quantitative+Analysis+by+Fluorescence+Microscopy.">In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).</li><li>de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+smears+observed+in+H&amp;E-stained+thrombus+sections+are+neutrophil+extracellular+traps.">Nuclear smears observed in H&amp;E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).</li><li>Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+thrombi+retrieved+during+interventional+treatment+of+ischemic+arterial+diseases.">Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases.</a> Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).</li><li>Qi, H., Yang, S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+and+Endothelial+Dysfunction+in+Atherosclerosis+and+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).</li><li>Laridan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+ischemic+stroke+thrombi.">Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi.</a> Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).</li><li>Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Arterial+and+Venous+Thrombosis.">Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li><li>Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+identifying+and+quantifying+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+septic+dogs+using+immunofluorescence+microscopy.">A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+Paraffin-Embedded+Tissue.">Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+fixation-processing+method+for+preembedding+ultrastructural+immunocytochemistry+of+cytoplasmic+antigens:+the+GBS+(glutaraldehyde-borohydride-saponin)+procedure.">An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).</li><li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Diminishing+Autofluorescence+in+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Human+Respiratory+Tissue.">Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).</li><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon.">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).</li><li>Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+fluorescence+emission+of+intact+oxy+hemoglobins.">Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).</li><li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li><li>Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+cellular+autofluorescence+in+flow+cytometry:+an+in-situ+method.">Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method.</a> Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).</li><li>Ducroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombus+Neutrophil+Extracellular+Traps+Content+Impair+tPA-Induced+Thrombolysis+in+Acute+Ischemic+Stroke.">Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke.</a> Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).</li></ol>

Descrevemos um protocolo para identificar NETs em trombos arteriais cardiogênicos felinos fixos usando um protocolo de imunorotulagem dupla e microscopia de imunofluorescência. Embora apenas trombos arterials cardiogênicos estivessem manchados, em teoria este protocolo poderia ser usado para outros tipos de trombos e em outras espécies veterinárias. A identificação de NETs dentro do trombo arterial felino sugere que os NETs podem desempenhar um papel na trombose em gatos.
A detecção d...

Gatos com cardiomiopatia hipertrófica correm o risco de complicações tromboembólicas com risco de vida1,2. Apesar da alta morbidade e mortalidade associada ao tromboembolismo arterial cardiogênico felino (CATE), a fisiopatologia subjacente da CATE em gatos é mal compreendida. Existem também ferramentas diagnósticas e terapêuticas limitadas para tratar e identificar gatos em risco desta condição devastadora3.
Além de seu papel na imunidade inata, os neutrófilos têm mostrado desempenhar um papel na trombose, liberando armadilhas extracelulares de neutrófilos (NE), que são redes semelhantes à web de DNA livre de células (CFDNA) incrustadas com histones e proteínas granulares como elastase neutrófilo (NE) e mieloperoxidase. Os neutrófilos são submetidos à formação de NETs em resposta à inflamação sistêmica, encontro direto com patógenos e interação com plaquetas ativadas4,5,6,7. Em cães, o DNA derivado de neutrófilos tem sido mostrado para inibir a lise do coágulo, enquanto as proteínas NET aceleram a formação de coágulos. A capacidade dos NETs de prender células circulantes e componentes de coagulação também é fundamental para suas propriedades trombogênicas8,,9,,10,,11,,12.
Os NETs são detectados pela colocalização de proteínas neutrófilos extracelulares, histonas e cfDNA. Por isso, a identificação e quantificação de NETs em tecidos fixos por imunofluorescência de tecidos desparafinados é superior à hematoxilina tradicional e eosina (H&E) usando microscopia de campo brilhante4,5. Vários estudos em humanos utilizando microscopia de imunofluorescência identificaram os NETs como componentes estruturais do trombo arterial coronário, trombos de derrame cerebral, atherothrombose e trombosve venoso13,14,15,16,17. Até o momento, não foi descrito um método padronizado para detectar e quantificar OS TNS no trombo felino. Como a identificação de NETs no trombo arterial cardiogênico felino pode facilitar futuras pesquisas translacionais em NETs e trombose, descrevemos técnicas de identificação e avaliação de NET em trombos arterial sinuosa embutida em parafina em gatos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # S11227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEFC4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4681</td>
			<td>NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 20x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4682</td>
			<td>NA 0.40, WD 6.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Imaging System Objective 40x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMEP4699</td>
			<td>NA 0.75, WD 0.72 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Catalog # A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immuno Research Labs</td>
			<td>Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase antibody</td>
			<td>Bioss Antibodies</td>
			<td>Bs-6982R-Biotin</td>
			<td>Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Product # 28324. Lot # EJ64292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive charged microscope slides</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Manufacturer No. 1354W-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>Catalog # 10510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>TRIS/EDTA, pH 9 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), compostas de DNA livre de células (cfDNA) e proteínas como histonas e elastase de neutrófilos (NE), são liberadas por neutrófilos em resposta a inflamações sistêmicas ou patógenos. Embora os NETs tenham sido mostrados anteriormente para aumentar a formação de coágulos e inibir a fibrinolise em humanos e cães, o papel dos NETs em gatos com tromboembolismo arterial cardiogênico (CATE), uma complicação de risco de vida secundária à cardiomiopatia hipertrófica , é desconhecido. Um método padronizado para identificar e quantificar os NETs em trombos arteriais cardiogênicos em gatos avançará nossa compreensão de seu papel patológico no CATE. Aqui, descrevemos uma técnica para identificar NETs em trombos fixados em formaldeído e parafina dentro da bifurcação aórtica, extraídos durante a necropsia. Após a deparafinação com xileno, as seções aórticas foram submetidas à recuperação indireta de antígenos induzidos pelo calor. As seções foram então bloqueadas, permeabilizadas e ex-vivo NETs foram identificadas por colocalização de DNA livre de células (cfDNA), histona citrubilada H3 (citH3) e elastase neutrófilo (NE) utilizando microscopia de imunofluorescência. Para otimizar a imunodetecção de NETs em trombos, a autofluorescência dos elementos teciduais foi limitada por meio de um processo de saciedade de autofluorescência antes da microscopia. Essa técnica pode ser uma ferramenta útil para estudar NETs e trombose em outras espécies e oferece novas percepções sobre a fisiopatologia dessa condição complexa.

Usando este protocolo para deparafinação, recuperação de antígenos induzidos pelo calor e dupla imunorotulagem de trombos embutidos em parafina, identificamos NETs em CATE felino pela primeira vez. O trombo dentro da bifurcação aórtica foi localizado por microscopia de fluorescência e microscopia de campo brilhante utilizando a coloração padrão de H&E e microscopia de contraste de fase. Na microscopia de campo brilhante, o trombo arterial felino consistia de glóbulos vermelhos, leucócitos, fibrina e plaquet...

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Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Descrevemos um método para identificar armadilhas extracelulares (NETs) em trombo cardiogênico felino fixo e parafinado de parafina usando recuperação de antígeno induzido pelo calor e um protocolo de rotulagem de dupla imunorotulagem.

Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Este protocolo de parafinização seguido de recuperação de antígeno de seções aórticas incorporadas à parafina pode ser uma ferramenta útil para estudar o papel das armadilhas tricelulares neutrófilas na trombose felina. A detecção de armadilhas tricelulares neutrófilas por imunofluorescência em tecido fixo e incorporado à parafina, é superior aos stents histológicos convencionais como o HNE, pois permite a detecção simultânea de DNA mais seguro e proteínas extracelulares. Este protocolo pode ser usado em outros tipos de trombos e em outras espécies veterinárias.A identificação de armadilhas extracelulares de neutrófilos dentro do trombo arterial felino sugerem que eles podem desempenhar um papel na trombose em gatos. Protocolos apresentados aqui são diretrizes. Encorajamos fortemente os investigadores a ajustar a duração e as condições do processo de recuperação de antígenos para produzir um sinal satisfatório.Para usar um sistema automatizado para realizar a desparafinação e a re-hidratação das seções em lâminas de vidro, coloque os slides de vidro em racks. Submergir completamente em 100% salino por três minutos. Repita este passo duas vezes.Não enxágue entre as etapas. Submergir completamente na diminuição das concentrações de etanol à temperatura ambiente três vezes por três minutos cada. Submerse completamente em água desionizada por dois minutos e repita mais uma vez.Após o tratamento com TBST, encha o reservatório com água deionizada aquecida a 100 graus Celsius. Deixe a câmara de vapor equilibrar por 20 minutos. Em uma placa de calor, aqueça a solução de recuperação de antígeno comercialmente disponível contendo Tris e EDTA em pH 9,0 a 95 a 97 graus Celsius.Certifique-se de que não ferva. Suberge completamente os slides na solução de recuperação de antígenos aquecidos e continue a aplicação de aquecimento externo através do vapor por 20 minutos. Em seguida, lave os slides três vezes com TBST por cinco minutos.Agora, coloque as seções no bloqueio do buffer 1. Incubar por duas horas em temperatura ambiente sob balanço suave entre 30 e 50 rpm. Sem lavar, aplique imediatamente 100 microlitadores de coelhinhos diluídos anti-humanos anticorpos de histona H3 diretamente no slide.Coloque um deslizamento de cobertura em cada seção para permitir a distribuição uniforme da mistura de anticorpos. Incubar por 12 a 16 horas a quatro graus Celsius com balanço suave. Depois disso, lave os slides três vezes com TBST por cinco minutos cada vez.Para aplicar anticorpos, use uma pipeta e distribua uniformemente 100 microliters de anticorpo anti-coelho de cabra conjugado à Alexa Fluor 488. Cubra os slides com papel alumínio e incuba os slides por uma hora em temperatura ambiente sob balanço suave. Depois de lavar com TBST de acordo com o manuscrito, incubar as seções no bloqueio tampão 2 durante a noite a quatro graus celsius sob balanço suave.Proteja-se da luz. Lave com TBST três vezes por cinco minutos cada vez. Bloqueie as seções no bloqueio do buffer 3, como feito anteriormente à temperatura ambiente por duas horas sob balanço suave.Incubar as seções com biotina esployclonal coelho anti-humano anticorpo elastase de 4 graus Celsius por 12 a 16 horas, como descrito anteriormente. Depois de lavar com TBST incubar os slides com Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate por uma hora em temperatura ambiente. Depois disso, lave com TBST uma vez por cinco minutos.Aplique 100 microliters de autofluorescense Quenching mistura de solução diretamente nas seções durante um minuto, conforme instruído pelo fabricante. Lave imediatamente os slides com TBST seis vezes por 10 minutos cada vez. Cubra cada slide com 100 microliters de 300 DAPI nanomolar por cinco minutos no escuro.Em seguida, lave com TBST cinco vezes por três minutos cada vez. Aplique uma gota de meio de montagem antifato diretamente na lâmina de vidro ao redor da seção. Coloque um deslizamento de cobertura suavemente na seção sem criar bolhas.Permita que as amostras curem durante a noite no escuro a quatro graus Celsius. Para localizar trombo, escaneie cranialmente para caudal ao longo do comprimento da aorta, bifurcação aórtica e cada artéria femeral usando microscopia de contraste de fase com um objetivo de 10x. Primeiro examine as seções de DNA livre de células usando o canal DAPI com a excitação em 357 e 44 nanômetros.Identifique elastase de neutrófilo extracelular e histítono citrulliado H3 nos canais de proteína fluorescente vermelha e verde do Texas, respectivamente. Mantenha um tempo de exposição consistente e ganhos de cada canal durante a aquisição de imagens para evitar saturação na intensidade dos pixels. Armadilhas extracelulares de neutrófilos são identificadas com base na co-localização de elastase neutrófilo, histona citrulliada H3 e DNA livre de células.Usando hematoxilalina e eosina, e microscopia de campo brilhante, o trombo arterial felino consiste em glóbulos vermelhos, leucócitos, fibrina e plaquetas. Os NETs apareceram como redes de fios roxos profundos de vários comprimentos ao redor de eritrócitos e leucócitos próximos. Usando este protocolo, a microscopia de imunofluorescência revelou grandes agregados de NETs compostos de DNA livre de células, histona h3 citrulliada extracelular e elastase neutrófila.Em contraste de fase na microscopia imunológica, um trombo foi caracterizado como uma estrutura bem demarcada dentro do espaço vascular. No entanto, o trombo não foi detectado em nenhuma das amostras de controle. Esta figura demonstra uma autofluoresência profunda de elementos de coágulos como eritrócitos quando imagens no comprimento de onda de 488 nanômetros.Breve saciamento de autofluoresência após a imunolabellação aumentou significativamente a sensibilidade da co-localização de proteínas e detecção de REDE mesmo em áreas com abundância de eritrócitos. A duração da fixação afeta a imunoreatividade de certos antígenos. Recomendamos fixação por não mais do que 24 horas por igual à desidratação e incorporação de parafina.Alternativamente, o paraformaldeído sem metanol pode ser usado para limitar o artefato por ácido fórmico e cetonas da oxidação de formaldeído. Para evitar interferências ao usar anticorpos primários originários da mesma espécie, incluímos etapa de bloqueio adicional para saturar quaisquer locais de ligação restantes nos anticorpos secundários. Os investigadores devem incluir controles negativos que consistem em anticorpos isótipos, exclusão de anticorpos primários e medidas de rotulagem imuno-rotulagem e controles biológicos de gatos sem trombose.A autofluoresência dos limites teciduais do trombo pode martelar a identificação microscópica de armadilhas extracelulares de neutrófilos. O investigador pode minimizar a fluorescência pelo uso de fluoroforos vermelhos distantes. Esta técnica pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo de armadilhas extracelulares de neutrófilos em outras espécies veterinárias.Isso pode proporcionar uma melhor compreensão da fisiopatologia da trombose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

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