Name: exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells
Uploaded: 2020-05-07T12:30:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells at JoVE.com

وقد دعمت هذا العمل الجمعية اليابانية لتعزيز المنح العلمية في مجال البحث العلمي [المنحة رقم 18K07544 إلى Y.A.] منح في المعونة للبحوث المتعلقة بالاضطرابات العصبية والعقلية [منحة رقم 28-6 إلى Y.A.] ، والوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية [منح Nos. 18ek0109239h0002، 18lm03066h0001، و 18lm0203069h0001 إلى Y.A.].

<ol>
	<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Cirak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+skipping+and+dystrophin+restoration+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+after+systemic+phosphorodiamidate+morpholino+oligomer+treatment:+an+open-label,+phase+2,+dose-escalation+study.">Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study.</a> Lancet. 378, 595-605 (2011).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Antoury, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+mRNA+in+human+urine+reveals+splice+variant+biomarkers+of+muscular+dystrophies.">Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies.</a> Nature Communications. 9, 3906 (2018).</li><li>Rahmoune, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transporters+in+human+renal+proximal+tubular+cells+isolated+from+the+urine+of+patients+with+non-insulin-dependent+diabetes.">Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes.</a> Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction.">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9, 3807 (2019).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples.">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+myogenic+differentiation+of+human+urine-derived+cells+as+a+potential+source+for+skeletal+muscle+regeneration.">Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).</li><li>Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+urine-derived+cells+with+inducible+MyoD+for+modeling+human+muscle+disease.">Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease.</a> Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).</li></ol>

المركز الوطني لعلم الأعصاب والطب النفسي الآن تطوير NS-065/NCNP-01، وهو exon 53 تخطي المخدرات لDMD، مع نيبون شينياكو المحدودة.

هنا ، ونحن نصف بروتوكول مفصل من تخطي exon في MYOD1تحويلUDCs التي تم الحصول عليها من مرضى DMD. باستخدام نظام الفحص ، قمنا بفحص تسلسلات antisense المثلى بكفاءة. نفترض أن MYOD1-تحويل UDCs يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للمرض.
لا غنى عن تقييم تخطي الطاردة الخاصة باستخدام الخلايا المشتقة من المريض على مستوى مرنا لفحص الأدوية الجديدة وتقييم أهلية المريض قبل إجراء التجارب السريرية. يمكن تقييم حساب كفاءة تخطي exon فقط على مستوى مرنا.
تقييم تخطي exon على مستوى البروتين مهم أيضا لأن استعادة dystrophin مهم كعلامة بيولوجية بديلة للتنبؤ بفوائد تخطي exon. حتى الآن، يتم إجراء فحص تسلسل القلة antisense غالباباستخدام خطوط الخلايا العضلية الأولية أو خلدت خطوط الخلية myoblast بما في ذلك خلايا rhabdomyosarcoma البشرية (RD)، ولكن لا يمكننا قياس انتعاش مستويات dystrophin باستخدام خطوط الخلايا العضلية أو خطوط الخلايا RD لأنها تعبر عن هذا البروتين داخليا. يمكننا الكشف بوضوح عن استعادة dystrophin في DMD المشتقة من MYOD1- UDCs بطريقة تعتمد على الجرعة. في المقالدينا الجديد، نعتبر أن تقييم البروتين المستعاد من قبل النشاف الغربي يتفوق في قابلية القياس الكمي. من ناحية أخرى ، يعد التقييم عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام 96 لوحة بئر مثاليًا لفحص العديد من المركبات المرشحة في وقت واحد.
في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل لكفاءة النمذجة DMD العضلات باستخدام MYOD1-تحويلUDCs جنبا إلى جنب مع RT-PCR، النشاف الغربي، والكيمياء المناعية لتقييم dystrophin المستعادة في mRNA ومستويات البروتين بعد تخطي exon. يمكن جمع UDCs بشكل غير جراحي وبسهولة. لذلك ، نفترض أنه يمكن تطبيق الإمكانية المختبرية الجديدة على مجموعة واسعة من الدراسات الأساسية والانتقالية بغض النظر عن نوع الاضطرابات العضلية.

يحدث ضمور العضلات دوشين (DMD), وهو مرض العضلات التدريجي, قاتلة, بسبب الطفرات الإطار التحول في الجين DMD التي تؤدي إلى عدم وجود بروتين dystrophin1. Antisense oligonucleotide القائم على exon تخطي العلاج ويعتقد أن تكون واعدة لDMD. ويستند هذا العلاج على تحويل النمط الظاهري DMD أكثر شدة إلى أكثر اعتدالا بيكر ضمور العضلات مثل النمط الظاهري عن طريق تغيير ما قبل mRNA الربط لاستعادة إطار القراءة DMD 2. لقد أكملنا مؤخرًا دراسة أولى في الإنسان تستند إلى الإدارة الوريدية المتكررة لـ phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) viltolarsen ، والتي يمكن أن تحفز exon 53 تخطي في DMD ، وأظهرت ملف أمان ممتاز ، وفعالية واعدة ، ومعلمات3الدوائية المقبولة (مسجلة باسم UMIN: 000010964 ClinicalTrials.gov: NCT02081625)
ومع ذلك ، لتطوير علاجات فعالة من حيث التكلفة وفعالة للمرض ، في المختبر باستخدام خلايا العضلات الأولية التي تم الحصول عليها من مرضى DMD ضرورية لفحص الدواء والتحقق من أهلية المريض قبل إجراء التجارب السريرية ، وكذلك المؤشرات الحيوية التي تعكس فعالية العلاجات تخطي الطاردة البرية خلال التجارب البشرية4. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن تقنية جديدة لتطوير خلايا MYOD1- محولة للبول (UDCs)5،6 كنموذج أولي للـ DMD7. وهكذا ، لتوليد myoblasts ، مطلوب فقط جمع البول من المرضى وليس هناك حاجة إلى إجراء الغازية. في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل للنمذجة كفاءة من العضلات DMD باستخدام MYOD1-تحويلUDCs تعامل مع 3-deazaneplanocin هيدروكلوريد لتقييم mRNA dystrophin المستعادة والبروتين بعد تخطي exon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% P/S Solution Stabilized</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td>Western blot (WB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-DYS1</td>
			<td>Immunocytochemistry(ICC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, Dylight 488</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>DK-2488</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Western bot and ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-X800</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-800</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLBANKER</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>CB011</td>
			<td>Cell stock in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8280J1</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639298</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>Protein extraction for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5 &#945; Competent Cells</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td>ASO transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzFastBlot HMW</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2-293 packaging cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631458</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM with GlutaMAX-I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12643</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>NICHIREI BIOSCIENCE INC.</td>
			<td>424151</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PDGF-AB</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-00AB-10UG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2020</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Western Device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2000</td>
			<td>WB (Automated mestern-processing device)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD cloning Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639648</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILTEX HV 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOD1 (GFP-tagged)</td>
			<td>ORIGENE</td>
			<td>RG209108</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740986.20</td>
			<td>PCR clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR066A</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td>Retroviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRetroX-TetOne-Puro Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634307</td>
			<td>Retroviral vecor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631305</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3190</td>
			<td>Material for growth medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM SingleQuots</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4127</td>
			<td>Material for primary medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus Titer Set</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>6166</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-X Concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631455</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline-free foetal bovine serum</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect transfection reagent</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631317</td>
			<td>Transfection of plasmids into packaging cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells

يحدث ضمور العضلات دوشين (DMD)، وهو مرض العضلات التدريجي والقاتل، بسبب الطفرات في جين DMD التي تؤدي إلى عدم وجود بروتين dystrophin. حتى الآن، أكملنا دراسة أول في الإنسان بدأها المحقق في المركز الوطني لطب الأعصاب والطب النفسي على أساس الحقن الجهازي للأوليغونوكليوتيدات مورفولينو التي هي عرضة لتخطي exon-53. من أجل العلاج الفعال DMD ، في الاختبار المختبري مع myoblasts المشتقة من مرضى DMD لفحص الأدوية وتقييم أهلية المريض قبل إجراء التجارب السريرية ويعتقد أن تكون ضرورية. في الآونة الأخيرة، أبلغنا عن خلية جديدة مشتقة من البول من طراز MYOD1تم تحويلها (UDC) عولجت بمثبط ميثيل ترانسياز الهستون (3-deazaneplanocin A hydrochloride)، كنموذج خلوي لـ DMD. قد يظهر UDC autologous الجديد تنظيرًا للأنماط الظاهرية الخاصة بالأمراض في DMD ، مما يؤدي إلى تطبيق الطب الدقيق في مجموعة متنوعة من الأمراض المتعلقة بالعضلات. في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل للنمذجة كفاءة من خلايا العضلات DMD باستخدام MYOD1-تحويلUDCs جنبا إلى جنب مع عكس transcriptase البوليميراز سلسلة التفاعل (RT-PCR)، النشاف الغربي، والمناعيالكيمياء لتقييم استعادة mRNA dystrophin ومستويات البروتين بعد تخطي إكسون.

يمكننا جمع UDCs بسهولة وغير الغازية. شكلت UDCs مستعمرات في غضون أسبوع بعد بدء ثقافة الخلايا الأولية لاحظنا قدرة تكاثرملحوظ. كانت ثقافة UDCs واضحة ، وكان التلوث البكتيري أو الفطري نادرًا عندما تم إجراء الإجراء بشكل صحيح.
ويبين الشكل 2 صور تباين المرحلة التمثيلية لمستعمرة UDC بعد أسبوع من الثقافة الأولية(الشكل 2A)و MYOD1-UDCsبعد أسبوع من التمايز(الشكل 2B). ويبين الشكل 3 الكشف الناجح عن تخطي الأجسام الطاردة في البلدان النامية التي تم الحصول عليها من مرضى DMD بواسطة RT-PCR. الشكل 3A يظهر تحليل RT-PCR من dystrophin بعد العلاج oligonucleotide antisense في DZNep معالجة MYOD1-UDCs المستمدة من ذكر يبلغ من العمر 6 سنوات مع حذف exon 45-54 في الجين DMD. تم استعادة إطار القراءة المفتوحة بواسطة exon 44 تخطي. في اليوم 14 بعد التمايز، أكدنا تحريض تخطي exon بطريقة تعتمد على الجرعة(الشكل 3B). تشير النطاقات العليا إلى المنتجات الأصلية، وتشير النطاقات السفلية إلى المنتجات التي تم تخطيها من exon 44 التي استعادت إطار القراءة المفتوح.
ويبين الشكل 4 الكشف الناجح عن الديستروفين بعد تخطي الإكسون في البلدان النامية التي تم الحصول عليها من مرضى DMD بواسطة النشاف الغربي بطريقة تعتمد على الجرعة. كما اكتشفنا التعبير dystrophin المستعادة باستخدام الكيمياء المناعية(الشكل 5). قمنا بقياس شدة dystrophin مع المجهر الفلورسنت 1 أسبوع بعد التضد oligonucleotide (ASO) التطفل على لوحة بئر 96(الشكل 5A). لوحظت إشارات فلورية أعلى بشكل ملحوظ في MYOD1-UDCs تعامل مع ASO مما كانت عليه في MYOD1-UDCs تعامل مع التحكم ASO(الشكل 5B).
تشير هذه النتائج إلى أن لدينا فحص جديد يمكن تقييم exon تخطي بكفاءة في MYOD1-UDCs التي تم الحصول عليها من المرضى DMD على مستوى مرنا والبروتين.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig1.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي لكومة النقل لللطخة الغربية شبه الجافة. تم وضع ورقتين غارقتين في المخزن المؤقت النشاف في المحطة السلبية ، وتم تكديس ورقتين غارقتين في المخزن المؤقت فوق هذا. تم وضع الجل ، الذي تم نقعه في المخزن المؤقت ، بلطف فوق غشاء PVDF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig1large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig2.jpg"> الشكل 2: صور تمثيلية للبلدان الأمريكية الموحدة. (أ)صورة تباين المرحلة من UDCs بعد أسبوع من الثقافة الأولية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. Inset: صورة مكبرة للمنطقة في المستطيل الأبيض. (ب)صورة تباين المرحلة من MYOD1-UDCs بعد أسبوع من التمايز. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig2large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig3.jpg"> الشكل 3: التقييم الناجح لتخطي الإكسون في الخلايا المشتقة من البول (UDCs) التي تم الحصول عليها من مرضى DMD بواسطة RT-PCR. (A)تحليل RT-PCR من dystrophin بعد علاج oligonucleotide المضاد للمعنى في 3-deazaneplanocin A هيدروكلوريد (DZNep) معالجة MYOD1-UDCsالمستمدة من ضمور العضلات دوشين (DMD) المريض مع حذف exon 45-54. كما عولجت MYOD1-UDCs المعالجة بـ DZNep بمعنى التحكم بتركيز 1-10 ميكرومتر كعناصر تحكم. وكانت النطاقات العليا المنتجات غير تخطي (السابقين 45-54 الحذف) التي ظلت خارج إطار القراءة. وكانت النطاقات السفلى المنتجات exon 44 تخطي (السابقين 44-54 حذف والسابق 44 تخطي) التي استعادت إطار القراءة المفتوحة. (ب)تم حساب تخطي الكفاءة على النحو (exon 44 تخطي نص molarity)/(الأصلي + exon 44 تخطي نص molarity [ملحوظ مع الأسهم]) × 100٪ باستخدام نظام الكهربوفوريس رقاقة. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعاً باختبار Bonferroni المخصص لمقارنة كفاءات تخطي (n = 3 لكل مجموعة ، ****P < 0.0001). يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± SEM. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig3large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig4.jpg"> الشكل 4: التقييم الناجح للتخطي exon في الخلايا المشتقة من البول (UDCs) من مرضى DMD بواسطة لطخة الغربية. (A)لطخة الغربية التمثيلية لdystrophin في DZNep معالجة MYOD1-UDCs من مريض DMD مع حذف exon 45-54 بعد exon 44 تخطي. للكشف عن dystrophin، تم استخدام مكافحة dystrophin (ضد محطة C). (ب)تمت مقارنة الكثافة النسبية للعصابات التي تم تطبيعها إلى تعبير α-tubulin في الخلايا المشتقة من المريض مع وبدون علاج oligonucleotide المضادة للمعنى من خلال إجراء ANOVA في اتجاه واحد تليها اختبار بونفيروني للمخصص (n = 3 لكل مجموعة، ** P < 0.01، **P < 0.001، HI = فرد صحي). وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig5.jpg"> الشكل 5: خرائط الحرارة من الكيمياء المناعية لdystrophin بعد العلاج oligonucleotide antisense في DZNep معالجة MYOD1- UDCs التي تم الحصول عليها من مريض DMD مع حذف exon 45-54. (أ)حذف exon 45-54 استعادة إطار القراءة المفتوحة على أساس تخطي exon من exon 44. (ب)تم قياس شدة الإشارة باستخدام مجهر الفلورسنت بعد أسبوع واحد من الانحاء المناوئ الأوليغونوكليوتيد اتلافيعلى لوحة بئر 96. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه تليها اختبار Bonferroni post hoc للمقارنة (n = 3-4 لكل مجموعة ، ****P < 0.0001). وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكيزاوا وآخرون7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig5large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>حجم</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x PCR premix</td>
			<td>12.5 ميكرولتر</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي إلى الأمام</td>
			<td>5 pmol</td>
			<td>0.2 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>عكس التمهيدي</td>
			<td>5 pmol</td>
			<td>0.2 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>قالب</td>
			<td>80 نانوغرام</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الماء المقطر المعقم</td>
			<td>ما يصل إلى 25 ميكرولتر</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>إجمالي الحجم لكل رد فعل</td>
			<td>25 ميكرولتر</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: خليط لتضخيم MYOD1 بواسطة RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>98 درجة مئوية</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>55 درجة مئوية</td>
			<td>10 s</td>
			<td>} 35 دورة</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 درجة مئوية</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: ظروف الدور الحراري لتضخيم MYOD1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>حجم</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x K المخزن المؤقت</td>
			<td>2 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناقل مضاد للفيروسات الرجعية (500 نانوغرام/ميكرولتر)</td>
			<td>2 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>إنزيم تقييد 1 (2-15 U)</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>إنزيم تقييد 2 (2-15 U)</td>
			<td>1 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الماء المقطر المعقم</td>
			<td>14 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>إجمالي الحجم</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: خليط لأنبوب لهضم ناقلات الفيروس الرجعي.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>حجم</td>
		</tr>
<tr>
<td>جزء MYOD1 منقى</td>
			<td>100 نانوغرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناقل فيروس الرجعية المهضوم</td>
			<td>100 نانوغرام</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x إنزيم premix</td>
			<td>4 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الماء المقطر المعقم</td>
			<td>ما يصل إلى 20 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>إجمالي الحجم</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4: خليط لتفاعل الاستنساخ في الانصهار.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>حل</td>
			<td>حجم / رد فعل (μL)</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>مياه خالية من RNase</td>
			<td>متغير</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>المخزن المؤقت RT-PCR من خطوة واحدة</td>
			<td>4</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>مزيج dNTP (يحتوي على 10 mM من كل dNTP)</td>
			<td>0.8</td>
			<td>400 mM من كل dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي إلى الأمام (10 mM)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.6 متر متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>التمهيدي العكسي (10 mM)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0.6 متر متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>مزيج إنزيم RT-PCR من خطوة واحدة</td>
			<td>0.8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>مثبط RNase (اختياري)</td>
			<td>متغير</td>
			<td>5-10 وحدات/رد فعل</td>
		</tr>
<tr>
<td>قالب الحمض النووي الريبي</td>
			<td>50-400 نانوغرام</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>إجمالي الحجم</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 5: المركبات اللازمة لرد فعل واحد من RT-PCR من خطوة واحدة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>دورة واحدة</td>
			<td>النسخ العكسي</td>
			<td>30 دقيقة</td>
			<td>50 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>دورة واحدة</td>
			<td>الخطوة الأولية لتنشيط PCR</td>
			<td>15 دقيقة</td>
			<td>95 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">دورة واحدة</td>
			<td>التسخ</td>
			<td>دقيقة واحدة</td>
			<td>94 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>الصلب</td>
			<td>دقيقة واحدة</td>
			<td>60 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>ملحق</td>
			<td>دقيقة واحدة</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>دورة واحدة</td>
			<td>التمديد النهائي</td>
			<td>7 دقيقة</td>
			<td>72 درجة مئوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>عقد</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 درجات مئوية</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 6: حالة الدراجات الحرارية لـ RT-PCR من خطوة واحدة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>حجم</td>
		</tr>
<tr>
<td>البروتين (15 ميكروغرام)</td>
			<td>10 ميكرون لتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>نموذج المخزن المؤقت (4x)</td>
			<td>5 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>تقليل عامل (10x)</td>
			<td>2 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه المنزوعة المؤنة</td>
			<td>3 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>إجمالي الحجم</td>
			<td>20 ميكرولتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 7: إعداد عينات لكبريتات الصوديوم dodecyl polyacrylamide هلام electrophoresis (SDS-PAGE).

Watch this Scientific Journal Video about Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells at JoVE.com

Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells

في هذه المقالة، ونحن نصف بروتوكول مفصل للنمذجة كفاءة من العضلات ضمور العضلات دوشين باستخدام MYOD1-تحويلالخلايا المشتقة من البول لتقييم استعادة mRNA dystrophin ومستويات البروتين بعد تخطي exon.

Exon تخطي في الأنابيب الليووية المبرمجة مباشرة التي تم الحصول عليها من الخلايا المشتقة من البول البشري

Duchenne muscular dystrophy (DMD), a progressive and fatal muscle disease, is caused by mutations in the DMD gene that result in the absence of dystrophin ...

لقد وضعنا بروتوكول جديد لإعادة برمجة الخلايا المشتقة من البول البشري مباشرة إلى ميوتوب. هذا في المختبر النمذجة تمكننا من تقييم exon تخطي في myotubes المستمدة من المريض مع ضمور العضلات دوشين. اكتشفنا أن 3-deazaneplanocin A هيدروكلوريد, DZnep, هيستون ميثيل ترانسفيراز المانع يمكن أن تعزز بشكل كبير الفحص المباشر ل UDCs في myotube في فترة قصيرة من الزمن.هذا جديدة autologous UDC القائم على النمذجة المرض يمكن أن يؤدي إلى الطب الدقيق تطبيق لمختلف الأمراض العضلية. للبدء، الطرد المركزي عينة البول بأكملها في 400 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. المقبل، يُشعّر المُندفع الذي يترك مليلتراً واحداً في الأنبوب.resuspend الكريات بشكل فردي في المليلتر واحد المتبقية من البول. جمع تلك في أنبوب واحد 50 ملليلتر وإضافة 10 ملليلتر من الغسيل العازلة إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي العينات في 200 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.استلهمت المُنطّع ترك 0.2 ملليلتر في الأنبوب. resuspend الكريات الخلية في 4.5 ملليلتر من المتوسطة الأولية. بذور الخلايا في ثلاثة آبار من الجيلاتين المغلفة ستة جيدا لوحة، 1.5 ملليلتر من تعليق الخلية في بئر.الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لمدة ثلاثة أيام إضافة 1.5 ملليلتر من المتوسط الابتدائي كل يوم. في اليوم الرابع، استبدل الوسيط بـ 1.5 ملليلتر من متوسط النمو المكمل كما هو موضح في المخطوطة.بعد اليوم الرابع، استبدال متوسط النمو المكمل كل يومين حتى ثقافة UDC هو 80 إلى 90٪ التقاء. ثم إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. تقسيم الخلايا باستخدام 0.25٪ تبسين-EDTA.بذور الخلايا في كثافة من 3، 000 إلى 5، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع على طبق جديد المغلفة الجيلاتين 60 ملليمتر. بذور UDCs في 3، 000 إلى 5، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع على طبق 60 ملليمتر المغلفة الجيلاتين ووضع الطبق في الحاضنة. بعد 24 ساعة من البذر ، تصيب الخلايا بفيروس رجعي مذاب في عدد كبير من العدوى من 200.استخدم وسطاً جديداً بتركيز بروميد الهيكسادي ميثرين 8 ميكروغرام لكل ملليلتر. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحديد الخلايا التي يتم تحويلها MYOD1، استبدل الوسيط الثقافي بوسيط نمو جديد يحتوي على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من البورومايسين.استمر في تغيير الوسط كل يوم لمدة سبعة إلى 10 أيام. لوحة UDCs MYOD1 التي تم تحويلها في لوحة الكولاجين المغلفة متعددة جيدا. بعد احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة، قم بتغيير متوسط النمو إلى الوسط المتمايز الموصوف في المخطوطة.ثم بعد ثلاثة أيام، وتغيير التمايز المتوسطة إلى المتوسطة التمايز الطازجة دون DZNep. استمر في تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. لتحويل oligonucleotide antisense إلى UDCs MYOD1 التي تسببها, مزيج ASO transfection كاشف والتمايز المتوسطة إلى التركيز النهائي من واحد إلى 10 ميكرومولار.واستخدم هذا الخليط ليحل محل الوسيلة في الآبار. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية ورطوبة 5٪. بعد 72 ساعة حضانة مع ASO، تغيير المتوسطة إلى تمايز جديد المتوسطة دون ASO.بعد ثلاثة إلى سبعة أيام من نقل ASO ، قم بإزالة وسيط التمايز. اغسل UDCs مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة العازلة تحلل الخلية. حصاد الجيش الملكي النيبالي الكلي باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي.قياس تركيز الحمض النووي الريبي مع مقياس الطيف. وكما هو موضح في المخطوطة، قم بجمع الكواشف لـ RT-PCR من خطوة واحدة في أنابيب البوليميراز المتعدد الكلور. ضع أنابيب PCR في الدراجات الحرارية وتشغيل الدراجات الحرارية.تنفيذ electrophoresis رقاقة وحساب exon تخطي الكفاءة. 29- وتم جمع البلدان النامية الجزرية الموحدة بسهولة وبشكل غير تلقائي وشكلت مستعمرات في غضون أسبوع من الثقافة الأولية. MYOD1 عبر العدوى UDCs في المتوسط التمايز مع DZNep يمكن أن تصهر لبعضها البعض وشكلت ميوتوب متعددة النوى بكفاءة.RT-PCR اكتشفت بوضوح exon تخطي في MYOD1-UDCs المستمدة من المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات دوشين. وكان تخطي الكفاءة يعتمد على جرعة ASO. كما تم الكشف عن تخطي إكسون المعتمد على الجرعة بواسطة لطخة غربية.تم قياس شدة الديستروفين مع المجهر الفلورسنت بعد أسبوع واحد من نقل ASO. ولوحظت إشارات فلورية أعلى بشكل ملحوظ في MYOD1-UDCs تعامل مع ASO مما كانت عليه في عنصر التحكم. يمكننا نماثة أي مرض عضلي يؤدي إلى فهم الفيزيولوجيا المرضية لتلك الأمراض.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

اشتقاق الأورام والعلاج من الخلايا السرطانية الأولية المعزولة من الساركوما الروماتيزمية الماوس

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...