Name: exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells
Uploaded: 2020-05-07T12:30:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [grant no. 18K07544 aan Y.A.], Subsidies-in-Aid for Research on Nervous and Mental Disorders [grant no. 28-6 aan Y.A.], en het Japan Agency for Medical Research and Development [grant nos. 18ek0109239h0002, 18lm020306h0001, en 18lm0203069h0001 aan Y.A.].

De Ethische Commissie van het Nationaal Centrum voor Neurologie en Psychiatrie keurde deze studie goed (goedkeurings-ID: A2017-018, A2018-029). Alle individuen gaven geïnformeerde toestemming alvorens urine te verstrekken. Alle experimenten werden uitgevoerd onder de relevante richtlijnen en voorschriften.
1. Isolement en primaire cultuur van uDC's
OPMERKING: UDC's werden geïsoleerd volgens een eerder gepubliceerd protocol8,9,10 met enkele wijzigingen.
<ol><li>Verzamel urinemonsters tijdens spontane micturition in gesteriliseerde plastic flessen. OPMERKING: Sterilisatie van de externe urethrale opening is niet nodig. Midstreamurine is wenselijk om het risico op virale besmetting te verminderen. Als de voorraadtijd vóór de volgende procedure >1 uur is, moeten urinemonsters worden overgebracht naar 4 °C om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. Een temperatuur van <4 °C moet echter worden vermeden omdat er onoplosbare neerslagen kunnen verschijnen.</li>
	<li>Centrifugeer het hele urinemonster op 400 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Aanzuigen de supernatant, waardoor 1 mL in de buis.</li>
	<li>Resuspend de pellets individueel in de resterende 1 mL van de urine en vervolgens verzamelen die in een enkele 50 mL buis.</li>
	<li>Voeg 10 mL wasbuffer toe bestaande uit 99 mL PBS zonder calcium en magnesium, 1% penicilline/streptomycine (P/S), 0,5 μg/mL amphotericine B en centrifugeer de monsters op 200 x g voor 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Aanzuigen de supernatant, waardoor 0,2 mL in de buis.</li>
	<li>De celpellets opnieuw opschorten in 4,5 mL van primair medium dat bestaat uit een 1:1-mengsel van het gemodificeerde Eagle medium (DMEM) van hoge glucose Dulbecco zonder natriumpyruvaat en het F-12-voedingsmengsel van Ham, aangevuld met recombinant menselijke epidermale groeifactor (EFG), insuline, hydrocortison, adrenaline, T3, transferrine, 10% tetracyclinevrij foetaal runderserum (FBS), 1% P/S en 0,5 μg/mL amphotericine B.</li>
	<li>Zaad de cellen in drie putten van gelatine-gecoate zes goed platen (totaal volume van elke put, 1,5 mL). Cultuur bevochtigd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Voeg de komende 3 dagen dagelijks 1,5 mL van het primaire medium toe.</li>
	<li>Vervang op dag 4 het medium door 1,5 mL groeimedium aangevuld met recombinant menselijk EFG, insuline, hydrocortison, eadrenaline, T3, transferrine, 15% tetracycline-vrije FBS, 0,5% L-alanine-L-glutamine, 0,5% niet-essentiële aminozuren, en 2,5 ng/mLfibroblast growth factor-basic (bFGF), recombinant human platelet-derived growth factor (PDGF), EGF, and 1% P/S.</li>
	<li>Verander het groeimedium om de dag. OPMERKING: UDC-kolonies verschijnen binnen een week.</li>
	<li>Wanneer de UDC-cultuur 80−90% confluent wordt, verwijder dan het medium en wascellen met PBS, splits alle cellen met 0,25% trypsine-EDTA en zaad bij 3.000-5.000 cellen/cm2 op een nieuwe met gelatine bedekte 60 mm schaal (passage 1). LET OP: De UDC's kunnen worden opgeslagen in vloeibare stikstof. UDC's zijn meestal verdeeld bij 60 −70% samenvloeiing in 60 mm cultuurschotel in drie voorraadbuizen.</li>
</ol>2. Retrovirale constructie
<ol><li>Versterk het coderingsgebied van MYOD1 (NM_002478.4) plasmide door polymerasekettingreactie (PCR). OPMERKING: Het mengsel voor MYOD1-versterking en voorwaarden voor de thermische cycler worden weergegeven in tabel 1 en tabel 2.</li>
	<li>Detecteer een enkele band van ongeveer 1.000 bp grootte door 0,7% agarose gel elektroforese met behulp van 1 μL van de versterkte PCR product om te bevestigen dat de MYOD1 sequentie met succes wordt versterkt.</li>
	<li>Maak het PCR-product schoon met behulp van de clean-up kit en bepaal de concentratie ervan met een spectrofotometer.</li>
	<li>Het mengsel zoals aangegeven in tabel 3 bij 37 °C 's nachts om retrovirale vector te verteren met een Tet-on-systeem en puromycine resistent gen in beperking enzym-gerichte regio's in de meervoudige kloonplaats.</li>
	<li>Detecteer een enkele band met 0,7% agarose gel elektroforese met behulp van 1 μL van het verteerde product om te bevestigen dat de retrovirale vector met succes werd verteerd.</li>
	<li>Reinig het verteerde product met behulp van clean-up kit en bepaal de concentratie door spectrofotometer.</li>
	<li>Om het versterkte MYOD1-fragment (geproduceerd door stap 2.1−2.3) te klonen in de verteerde retrovirale vector (geproduceerd door stap 2.4−2.6), voert u een in-fusie klonende reactie uit. Stel de reactie in zoals afgebeeld in tabel 4,incubeer de reactie gedurende 15 min bij 50 °C en plaats vervolgens op het ijs.</li>
	<li>Uitvoeren van transformatie met behulp van E. coli bevoegde cellen volgens de instructies van de fabrikant (Tabel van materialen).</li>
	<li>Selecteer de getransformeerde competente cellen door te kweken op een LB-kweekplaat bestaande uit 10 g/L bacto trypton, 5 g/L bacto gistextract, 5 g/L NaCl, 15 g/L bacto agar en 50 mg/L ampicillin.</li>
	<li>Pak de geselecteerde kolonie en cultuur in LB cultuur medium zonder bacto agar bij 200 rpm bij 37 °C 's nachts.</li>
	<li>Zuiver de MYOD1-ingevoegderetrovirale vectoren met behulp van een plasmid zuiveringskit (Tabel van materialen) en kwantificeren met behulp van een spectrofotometer.</li>
	<li>Controleer of MYOD1 correct in de retrovirale vector is geplaatst door directe sequencing van het PCR-product dat wordt versterkt door de voorwaartse en omgekeerde primers die respectievelijk aan beide zijden aan beide zijden in de ingevoegde MYOD1-reeks zijn gericht. OPMERKING: De MYOD1-sequentie kan worden gedetecteerd ingeklemd tussen retrovirale vectorsequenties wanneer het klonen in fusie succesvol is.</li>
	<li>Zaad voor retrovirale productie de verpakkingscellen op 50.000 cellen/cm2 op 10 cm collageengecoate platen en cultuur in DMEM met 10% FBS bevochtigd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Wanneer de verpakkingscellen zich vermenigvuldigen tot 80% samenvloeiing, meng 30 μg MYOD1-ingevoegderetrovirale vectoren, 30 μg verpakkingsvectoren en transfection reagens met cel-penetrerende peptide(Tabel van materialen)door vortexing, en incubeer ze gedurende 10 min.</li>
	<li>Voeg het geïncubeerde mengsel toe aan het medium verpakkingscellen en de gekweekte cultuur bij 37 °C en 5% CO2. LET OP: Collageen coating is noodzakelijk. Transfection kan beter zijn op 24 uur of meer na het zaaien, omdat de verpakking cellen gemakkelijk los te maken van de cultuurplaat.</li>
	<li>Na 4 uur of 's nachts, verander het medium naar vers groeimedium.</li>
	<li>Verzamel de virale supernatant en vervang met vers medium op 24 en 48 uur na cotransfection en combineer de supernatant.</li>
	<li>Om de virale supernatant te concentreren, meng het met het concentratorreagens en incubeer het bij 37 °C 's nachts en centrifugeer dan op 1.500 x g gedurende 45 min bij 4 °C.</li>
	<li>Filtreer de retrovirus supernatant door een PVDF-filter met 0,45 μm poriën.</li>
	<li>Controleer de titer van de retrovirale vector met behulp van een kwantitatieve PCR-kit en thermische cycler systeem volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Verdeel de virale supernatant in kleine aliquots en bewaar ze op -80 °C.</li>
</ol>3. Infectie met MYOD1-retrovirale vector in UDC's
<ol><li>Zaai de UDC's op 3.000-5.000 cellen/cm2 op een met gelatine bedekte schaal van 60 mm.</li>
	<li>Infecteer na 24 uur zaaien het ontdooide retrovirus (stap 2.21) bij een veelheid aan infectie van 200 door hexadimethrinebromide toe te voegen bij een concentratie van 8 μg/mL.</li>
	<li>Na een incubatietijd van 24 uur bij 37 °C en 5% CO2,vervang het kweekmedium door vers groeimedium met 1 μg/mL puromycine om de MYOD1-transducedcellen te selecteren. Verander het medium om de andere dag. OPMERKING: Bij het selecteren voor MYOD1-positieve cellen wordt 1 μg/mL puromycine meestal gebruikt voor selectie. De juiste dosis moet worden bepaald. Gebruik een plaat met ongetransfecteerde cellen en kies de dosis die alle cellen doodt in 3−5 dagen. MYOD1-positieve cellen moeten worden geselecteerd binnen 7−10 dagen na het toevoegen van puromycine. De MYOD1-transducedUDC's kunnen worden opgeslagen in vloeibare stikstof.</li>
</ol>4. Myogene differentiatie van MYOD1-transduced UDC's behandeld met 3-deazaneplanocinaa A hydrochloride (DZNep)
OPMERKING: Onlangs is gemeld dat DZNep, een histone methyltransferase remmer, aanzienlijk zou kunnen bevorderen de expressie van MYOGENIN, een van de late spier regulerende factoren, en ook leiden tot myotube differentiatie7.
<ol><li>Plaat MYOD1-transduced UDC's in de collageen-gecoate putten met een dichtheid van 3,5 x 104 cellen/cm2. Cultuur bevochtigd bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Na 24 uur, verander het groeimedium naar differentiatiemedium bestaande uit hoge glucose DMEM met L-alanine-L-glutamine, 5% paardenserum, ITS-supplement, 1 μg/mL doxycycline en 5 μM DZNep. LET OP: De 10 mM DZNep oplossing kan 3 maanden lang bij -80 °C worden bewaard. Gebruik een ontdooivriezer en vermijd herhaalde vriesdooicycli. Zowel MYOD1 geactiveerd door doxycycline en DZNep onderdrukken proliferatie en bevorderen de myogene differentiatie van UDC's. Daarom wordt aanbevolen dat doxycycline en DZNep worden toegevoegd na de inductie van myogene differentiatie. DZNep bevordert myogene differentiatie van de MYOD1-UDC's op een dosisafhankelijke manier. Aan de andere kant vertoont het cytotoxiciteit bij een hoge concentratie. Bepaal daarom de juiste concentratie van DZNep, variërend van 1−10 μM, afhankelijk van de effecten op myogene differentiatie en cellulaire biologische beschikbaarheid.</li>
	<li>Verander na 3 dagen het differentiatiemedium naar het verse differentiatiemedium zonder DZNep. Verander vervolgens het medium om de 3 dagen. OPMERKING: Umc's smelten op elkaar en vormen myotubes binnen 1−2 weken na differentiatie.</li>
</ol>5. Exon overslaan in MYOD1-geconverteerdeUDC's
OPMERKING: Hier worden drie protocollen beschreven om exon-overslaan in patiëntcellen te evalueren: 1) omgekeerde transcriptase polymerase kettingreactie (RT-PCR) van dystrofine mRNA; 2) semiquantificatie van herstelde dystrofine eiwit signaal door westerse vlek; en 3) semiquantificatie van herstelde dystrofinefluorescentiesignaal door immunocytochemie. Alle methoden kunnen exon overslaan op een dosis-afhankelijke manier detecteren.
<ol><li>Evaluatie van exon overslaan efficiëntie door RT-PCR<ol>
<li>Om antisense oligonucleotide (ASO) om te zetten in MYOD1-omgezetteUDC's verkregen van DMD-patiënten op dag 7 na differentiatie, meng ASO, transfection reagens (Tabel van materialen) en differentiatie medium tot een definitieve concentratie van 1−10 μM. Cultuur bevochtigd bij 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Na 72 uur incubatie met ASO, verander het medium naar vers differentiatiemedium zonder ASO.</li>
		<li>Verwijder vanaf 3−7 dagen na ASO-transfection het differentiatiemedium en was 1x met PBS. Voeg cellyse buffer, lyse de UDC's en oogst het totale RNA met behulp van een RNA extractie kit.</li>
		<li>Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer.</li>
		<li>Combineer de vereiste reagentia voor rt-pcr-reactie in één stap in PCR-buizen volgens tabel 5.</li>
		<li>Plaats de PCR-buizen met het mengsel in een thermocycler. Voer de thermocycler, volgens tabel 6.</li>
		<li>Voer microchip elektroforese uit en bereken de exon overslaan efficiëntie met behulp van de kiesconcentratie zoals hieronder. Exon overslaan efficiëntie (%) = overgeslagen band / (overgeslagen band + niet-overgeslagen band) x 100 OPMERKING: Bewaar het PCR-product in een koelkast bij 4 °C voor opslag op korte termijn of -20 °C voor langdurige opslag.</li>
	</ol></li>
	<li>Detectie van dystrophin na exon overslaan door westerse blotting<ol>
<li>Transfect ASO en cultuur MYOD1-UDC's volgens stappen 5.1.1 en 5.1.2.</li>
		<li>Verander het medium om de 3 dagen.</li>
		<li>Na 2 weken van differentiatie, haal het totale eiwit uit de gekweekte cellen met behulp van radioimmunoprecipitatie test (RIPA) buffer met proteaseremmers.</li>
		<li>Sonicate de lysaten op ijs en centrifugeer op 14.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
		<li>Verzamel de supernatant en bepaal eiwitconcentraties met behulp van een BCA eiwit testkit.</li>
		<li>Voeg 15 μg totaal eiwit toe in een buis van 0,5 mL en verdun door de RIPA-buffer met proteaseremmers toe te voegen aan een totaal volume van 10 μL. Voer 15 μg totaal eiwit per rijstrook uit.</li>
		<li>Voeg monsterbuffer, reductiemiddel en gedeïoniseerd water toe zoals weergegeven in tabel 7. Denatureeren van de cel lysaten op 70 °C gedurende 10 min.</li>
		<li>Bereid de tris-acetaatloopbuffer voor met 8,95 g/L tricine, 6,06 g/L tris base, 1.0 g/L natriumdodecylsulfaat (SDS).</li>
		<li>Laad het monster (20 μL) op tris-acetaat 3−8% gel en voer elektroforese uit bij 150 V gedurende 75 min.</li>
		<li>Bereid de blottingbuffer voor zonder methanol.</li>
		<li>Week het PVDF-membraan voor 20 s in methanol en vervolgens in de blottingbuffer tot het gebruik (ten minste 10 min). Snijd het PVDF-membraan op een grootte van 6 x 8 cm met minigels en 8 x 12 cm met midigels.</li>
		<li>Snijd de blotting papier op dezelfde grootte als die van de PVDF membraan en weken die in de blotting buffer tot gebruik.</li>
		<li>Na elektroforese, snijd de gel op dezelfde grootte als die van het PVDF membraan en week de gel in gedestilleerd water.</li>
		<li>Plaats de vloeipapier, het PVDF-membraan en de gel op het droge transferapparaat (figuur 1). Overdracht op 4 mA/cm2 voor 30 min.</li>
		<li>Spoel het membraan 2x af met gedestilleerd water.</li>
		<li>Bereid anti-dystrofine (1:500) en anti-α-tubulin (1:1.200) antilichaam als de primaire antilichamen.</li>
		<li>Bereid HRP-geconjugeerde anti-muisantilichaam (1:100) voor als secundair antilichaam.</li>
		<li>Incubeer de membranen met de primaire antilichamen, was met wasbuffer en incubeer met het secundaire antilichaam met behulp van een geautomatiseerd westers verwerkingsapparaat (Tabel van materialen) bij kamertemperatuur. OPMERKING: Anti-α-tubulin antilichaam wordt meestal gebruikt als een lading controle. De gemengde primaire antilichaamoplossingen, waaronder 1:500 anti-dystrofine en 1:1.200 anti-α-tubulinantilichamen werken goed wanneer de antilichaamreactie gelijktijdig wordt uitgevoerd.</li>
		<li>Spoel het membraan af in gedestilleerd water.</li>
		<li>Detecteer de eiwitten met behulp van chemiluminescente detectie reagens en een charge-coupled device (CCD) camera-gebaseerde imager.</li>
		<li>Analyseer de gegevens met behulp van de juiste software.</li>
	</ol></li>
	<li>Detectie van dystrofine na exon overslaan door immunocytochemie<ol>
<li>Herprogrammeer de UDC's rechtstreeks in de myotubes in collageengecoate 96 putplaat volgens stappen 4.1−4.3.</li>
		<li>Transfect de ASO en cultuur MYOD1-UDC's volgens stappen 5.1.2 en 5.1.3.</li>
		<li>Na 2 weken differentiatie, was de cellen met PBS en bevestig ze in 4% paraformaldehyde gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
		<li>Permeabilize MYOD1-UDC's in 0,1% niet-ionisch wasmiddel gedurende 10 min bij kamertemperatuur en blokkeer die met 10% geitenserum gedurende 15 min bij 37 °C.</li>
		<li>Incubeer de cellen met een primair antilichaam 's nachts bij 4 °C.</li>
		<li>Was de cellen met PBS en incubeer die met het secundaire antilichaam gedurende 30 min bij kamertemperatuur. OPMERKING: Hier wordt muisanti-dystrofine (1:30) gebruikt als het primaire antilichaam, anti-muis IgG wordt gebruikt als secundair antilichaam en Hoechst (1:10.000) wordt gebruikt voor kernen vlekken.</li>
		<li>Beeld de platen met behulp van een fluorescerende microscoop en gebruik een analyzer om het fluorescentiesignaal automatisch in elke put onder dezelfde conditie te kwantificeren.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Cirak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+skipping+and+dystrophin+restoration+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+after+systemic+phosphorodiamidate+morpholino+oligomer+treatment:+an+open-label,+phase+2,+dose-escalation+study.">Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study.</a> Lancet. 378, 595-605 (2011).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Antoury, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+mRNA+in+human+urine+reveals+splice+variant+biomarkers+of+muscular+dystrophies.">Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies.</a> Nature Communications. 9, 3906 (2018).</li><li>Rahmoune, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transporters+in+human+renal+proximal+tubular+cells+isolated+from+the+urine+of+patients+with+non-insulin-dependent+diabetes.">Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes.</a> Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction.">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9, 3807 (2019).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples.">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+myogenic+differentiation+of+human+urine-derived+cells+as+a+potential+source+for+skeletal+muscle+regeneration.">Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).</li><li>Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+urine-derived+cells+with+inducible+MyoD+for+modeling+human+muscle+disease.">Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease.</a> Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).</li></ol>

Het National Center of Neurology and Psychiatry is nu de ontwikkeling van NS-065/NCNP-01, een exon 53 overslaan drug voor DMD, met Nippon Shinyaku Co, Ltd.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol van exon overslaan in MYOD1-geconverteerdeUDC's verkregen van DMD-patiënten. Met behulp van het testsysteem hebben we optimale antisense sequenties efficiënt gescreend. We gaan ervan uit dat MYOD1-omgezetteUDC's nuttig kunnen zijn voor het onderzoek naar de pathofysiologie van de ziekte.
Evaluatie van exon overslaan met behulp van patiënt-afgeleide cellen op mRNA-niveau is onmisbaar voor het screenen van nieuwe geneesmiddelen en het beoordelen van de geschiktheid van de patiënt voordat het uitvoeren van klinische proeven. De berekening van exon skipping efficiency kan alleen op mRNA-niveau worden geëvalueerd.
Evaluatie van exon overslaan op het eiwitniveau is ook belangrijk omdat dystrofine restauratie is belangrijk als een surrogaat biomarker om de voordelen van exon overslaan voorspellen. Tot op heden wordt screening van antisense oligonucleotide sequenties vaak uitgevoerd met behulp van primaire spiercellijnen of vereeuwigde myoblastcellijnen, waaronder menselijke rhabdoosarcoom (RD) cellen, maar we kunnen het herstel van dystrofineniveaus niet meten met behulp van spiercellijnen of RD-cellijnen omdat ze dit eiwit endogeen uitdrukken. We kunnen het herstel van dystrofine in DMD-patiënt-afgeleide MYOD1-UDC'sduidelijk detecteren op een dosisafhankelijke manier. In onze nieuwe test, zijn wij van mening dat de evaluatie van herstelde eiwit door Westelijke blotting superieur in kwantificeerbaarheid is. Aan de andere kant, evaluatie door immunocytochemie met behulp van 96 goed platen is ideaal voor het screenen van veel kandidaat-verbindingen tegelijk.
In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een efficiënte modellering van DMD-spieren met MYOD1-geconverteerdeUDC's, samen met RT-PCR, Western blotting en immunocytochemie om de herstelde dystrophin te evalueren op het mRNA- en eiwitgehalte na het overslaan van exon. UDC's kunnen niet-invasief en gemakkelijk worden verzameld. Daarom gaan we ervan uit dat de gloednieuwe in vitro test kan worden toegepast op een breed scala van fundamentele en translationele studies, ongeacht het type spieraandoeningen.

Duchenne spierdystrofie (DMD), een progressieve, fatale spierziekte, wordt veroorzaakt door frame-shift mutaties in het DMD gen die resulteren in de afwezigheid van dystrofine eiwit1. Antisense oligonucleotide-gebaseerde exon overslaan therapie wordt gedacht veelbelovend voor DMD. Deze therapie is gebaseerd op de omzetting van het severer DMD fenotype naar het mildere Becker spierdystrofie-achtig fenotype door pre-mRNA splicing te veranderen om het DMD leesframe2 te herstellen. We hebben onlangs een eerste-in-menselijke studie op basis van herhaalde intraveneuze toediening van de foodiamd morfolino oligomer (PMO) viltolarsen, die exon 53 overslaan in DMD kan induceren, en toonde een uitstekend veiligheidsprofiel, veelbelovende werkzaamheid, en aanvaardbare farmacologische parameters (geregistreerd als UMIN: 000010964 en ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
Voor de ontwikkeling van kosteneffectieve en efficiënte behandelingen voor de ziekte zijn in vitro tests met primaire spiercellen van DMD-patiënten echter essentieel voor medicijnscreening en geschiktheidsverificatie voor patiënten voordat klinische studies worden uitgevoerd, evenals biomarkers die de werkzaamheid weerspiegelen van exon skipping-therapieën tijdens menselijke proeven4. Zeer recent rapporteerden we een nieuwe technologie om patiëntspecifieke MYOD1-geconverteerdeurine-afgeleide cellen (UDC's)5te ontwikkelen,6 als een primair myoblastmodel van DMD7. Om de myoblasten te genereren, is dus alleen het verzamelen van urine van patiënten vereist en is er geen invasieve procedure nodig. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt modelleren van DMD-spieren met MYOD1-geconverteerdeUDC's die zijn behandeld met 3-deazaneplanocine A hydrochloride om de herstelde dystrofine mRNA en eiwit na het overslaan van exon te evalueren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% P/S Solution Stabilized</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td>Western blot (WB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-DYS1</td>
			<td>Immunocytochemistry(ICC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, Dylight 488</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>DK-2488</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Western bot and ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-X800</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-800</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLBANKER</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>CB011</td>
			<td>Cell stock in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8280J1</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639298</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>Protein extraction for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5 &#945; Competent Cells</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td>ASO transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzFastBlot HMW</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2-293 packaging cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631458</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM with GlutaMAX-I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12643</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>NICHIREI BIOSCIENCE INC.</td>
			<td>424151</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PDGF-AB</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-00AB-10UG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2020</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Western Device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2000</td>
			<td>WB (Automated mestern-processing device)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD cloning Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639648</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILTEX HV 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOD1 (GFP-tagged)</td>
			<td>ORIGENE</td>
			<td>RG209108</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740986.20</td>
			<td>PCR clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR066A</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td>Retroviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRetroX-TetOne-Puro Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634307</td>
			<td>Retroviral vecor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631305</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3190</td>
			<td>Material for growth medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM SingleQuots</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4127</td>
			<td>Material for primary medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus Titer Set</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>6166</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-X Concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631455</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline-free foetal bovine serum</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect transfection reagent</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631317</td>
			<td>Transfection of plasmids into packaging cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells

Duchenne spierdystrofie (DMD), een progressieve en fatale spierziekte, wordt veroorzaakt door mutaties in het DMD-gen die resulteren in de afwezigheid van dystrofineeiwit. Tot op heden hebben we een door onderzoekers geïnitieerde eerste-in-menselijke studie afgerond aan het National Center of Neurology and Psychiatry op basis van de systemische injectie van de morfolino oligonucleotiden die vatbaar zijn voor exon-53 overslaan. Voor de effectieve behandeling van DMD wordt in vitro testen met myoblasten afkomstig van DMD-patiënten om geneesmiddelen te screenen en de geschiktheid van patiënten te beoordelen voordat klinische proeven worden uitgevoerd, als essentieel beschouwd. Zeer recent meldden we een nieuwe MYOD1-geconverteerdeurine-afgeleide cel (UDC) behandeld met de histone methyltransferase remmer (3-deazaneplanocine A hydrochloride), als een cellulair model van DMD. De nieuwe autologe UDC zou kunnen tonen fenocopie van de ziekte-specifieke fenotypes van DMD, wat leidt tot de toepassing van precisiegeneeskunde in een verscheidenheid van spier-gerelateerde ziekten. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor efficiënte modellering van DMD-spiercellen met MYOD1-omgezetteUDC's, samen met omgekeerde transcriptase polymerasekettingreactie (RT-PCR), westerse blotting en immunocytochemie om het herstel van dystrofinemRNA en eiwitniveaus na exon overslaan te evalueren.

We kunnen de UMC's gemakkelijk en niet-invasief verzamelen. UDC's gevormd kolonies binnen een week na het starten van primaire cel cultuur waargenomen we een duidelijke proliferative vermogen. De cultuur van UDC's was eenvoudig, en bacteriële of schimmelbesmetting was zeldzaam toen de procedure correct werd uitgevoerd.
Figuur 2 toont representatieve fasecontrastbeelden van de UDC-kolonie een week na de primaire cultuur (figuur 2A) en MYOD1-UDC's een week na differentiatie (Figuur 2B). Figuur 3 toont de succesvolle detectie van exon overslaan in UDC's verkregen van DMD-patiënten door RT-PCR. Figuur 3A toont RT-PCR-analyse van dystrofine na antisense oligonucleotidebehandeling in DZNep-behandelde MYOD1-UDC's afgeleid van een 6-jarig mannetje met een exon 45-54 deletie in het DMD-gen. Het open leesframe werd gerestaureerd door exon 44 overslaan. Op dag 14 na differentiatie bevestigden we de inductie van exon overslaan op een dosis-afhankelijke manier(figuur 3B). De bovenste banden duiden inheemse producten aan en de onderste banden geven 44-overgeslagen producten aan die het open leeskader herstelden.
Figuur 4 toont de succesvolle detectie van dystrofine na exon overslaan in de UDC's verkregen van DMD-patiënten door westerse blotting op een dosis-afhankelijke manier. We ontdekten ook de herstelde dystrofineexpressie met behulp van immunocytochemie (Figuur 5). We maten de intensiteit van dystrofine met een fluorescerende microscoop 1 week na de antisense oligonucleotide (ASO) transfection op een 96 putplaat(figuur 5A). Aanzienlijk hogere tl-signalen werden waargenomen in MYOD1-UDC's behandeld met ASO dan in MYOD1-UDC's behandeld met controle ASO (Figuur 5B).
Deze resultaten suggereren dat onze nieuwe test exon overslaan efficiënt kan evalueren in MYOD1-UDC's verkregen van DMD-patiënten op mRNA- en eiwitniveau.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig1.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de overdrachtsstapel voor halfdroge westerse vlek. Twee papieren gedrenkt in de blotting buffer werden vastgesteld op de negatieve terminal, en twee papieren gedrenkt in de buffer werden gestapeld op de top van deze. De gel, die in de buffer is gedrenkt, werd voorzichtig over het PVDF-membraan gelegd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig2.jpg"> Figuur 2: Representatieve afbeeldingen van de UDC's. (A) Fasecontrastbeeld van UDC's een week na de primaire cultuur. Schaalbalk = 200 μm. Instel: een vergroot beeld van het gebied in de witte rechthoek. (B) Fasecontrastbeeld van MYOD1-UDC's een week na differentiatie. Schaalbalk = 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Takizawa et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig3.jpg"> Figuur 3: Succesvolle evaluatie van exon overslaan in urine-afgeleide cellen (UDC's) verkregen van DMD-patiënten door RT-PCR. (A) RT-PCR-analyse van dystrofine na antisense oligonucleotidebehandeling bij 3-deazaneplanocine A hydrochloride (DZNep)-behandelde MYOD1-UDC's afgeleid van Duchenne spierdystrofie (DMD) patiënt met een exon 45-54 deletie. DZNep-behandelde MYOD1-UDC's werden ook behandeld met de controle antisense bij 1-10 μM concentratie als controles. De bovenste banden waren onovergeslagen producten (Ex 45-54 schrapping) die uit het leesframe bleven. De onderste banden waren de exon 44-overgeslagen producten (Ex 44-54 verwijdering en Ex 44 overgeslagen) dat de open leeslijst hersteld. (B) Overslaan efficiëntie werd berekend als (exon 44-overgeslagen transcript molarity)/(native + exon 44-overgeslagen transcript molarity [gemarkeerd met pijlen]) x 100% met behulp van een microchip elektroforese systeem. One-way ANOVA gevolgd door Bonferroni's post hoc test werd gebruikt om de overslaan efficiëntie (n = 3 voor elke groep, **** P < 0,0001) te vergelijken. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd van Takizawa et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig4.jpg"> Figuur 4: Succesvolle evaluatie van exon overslaan in urine-afgeleide cellen (UDC's) van DMD-patiënten door westerse vlek. (A) Vertegenwoordiger Western blot voor dystrofine in DZNep-behandelde MYOD1-UDC's van DMD patiënt met een exon 45-54 schrapping na exon 44 overslaan. Voor dystrofinedetectie werd anti-dystrofine (tegen C-terminal) gebruikt. (B) De relatieve intensiteit van de banden genormaliseerd tot α-tubulinexpressie werden vergeleken in patiëntcellen met en zonder antisense oligonucleotidebehandeling door het uitvoeren van eenrichtingsANOVA gevolgd door Bonferroni's post hoc-test (n = 3 voor elke groep, **P < 0,01, ***P < 0,001, HI = gezond individu). Dit cijfer is gewijzigd van Takizawa et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig5.jpg"> Figuur 5: Heatmaps van immunocytochemie voor dystrofine na antisense oligonucleotidebehandeling bij DZNep-behandelde MYOD1-UDC's verkregen van DMD-patiënt met exon 45-54 deletie. (A) Schrapping van exon 45-54 herstelde de open leeslijst op basis van de exon overslaan van exon 44. (B) De signaalintensiteit werd gekwantificeerd met behulp van een fluorescerende microscoop na 1 week van antisense oligonucleotide transfection op een 96 put plaat. One-way ANOVA gevolgd door Bonferroni's post hoc test werd gebruikt voor de vergelijking (n = 3-4 voor elke groep, ****P < 0,0001). Dit cijfer is gewijzigd van Takizawa et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Definitieve concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x PCR premix</td>
			<td>12,5 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorwaartse primer</td>
			<td>5 pmol</td>
			<td>0,2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Omgekeerde primer</td>
			<td>5 pmol</td>
			<td>0,2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sjabloon</td>
			<td>80 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesteriliseerd gedestilleerd water</td>
			<td>tot 25 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal volume per reactie</td>
			<td>25 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Mengsel voor MYOD1 versterking door RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>55 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>} 35 cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Voorwaarden voor de thermische cycler voor MYOD1 versterking.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x K buffer</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Retrovirale vector (500 ng/μL)</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beperkingsenzym 1 (2−15 U)</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beperkingsenzym 2 (2−15 U)</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesteriliseerd gedestilleerd water</td>
			<td>14 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal volume</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Mengsel voor een buis om retrovirale vector te verteren.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gezuiverd MYOD1 fragment</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verteerd retrovirale vector</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x Enzym premix</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesteriliseerd gedestilleerd water</td>
			<td>tot 20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal volume</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 4: Mengsel voor de in-fusie klonen reactie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Oplossing</td>
			<td>Volume/reactie (μL)</td>
			<td>Definitieve concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-vrij water</td>
			<td>Variabele</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>RT-PCR-buffer in één stap</td>
			<td>4</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP-mix (met 10 mM van elke dNTP)</td>
			<td>0.8</td>
			<td>400 mM van elke dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorwaartse primer (10 mM)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0,6 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Omgekeerde primer (10 mM)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0,6 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>One-step RT-PCR enzymmix</td>
			<td>0.8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-remmer (optioneel)</td>
			<td>Variabele</td>
			<td>5−10 eenheden/reactie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sjabloon-RNA</td>
			<td>50−400 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal volume</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: Noodzakelijke verbindingen voor één reactie van de RT-PCR in één stap.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 cyclus</td>
			<td>Omgekeerde transcriptie</td>
			<td>30 min</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 cyclus</td>
			<td>Eerste PCR-activeringsstap</td>
			<td>15 min</td>
			<td>95 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1 cyclus</td>
			<td>Denaturation</td>
			<td>1 min</td>
			<td>94 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Annealing</td>
			<td>1 min</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensie</td>
			<td>1 min</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 cyclus</td>
			<td>Definitieve verlenging</td>
			<td>7 min</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Houden</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 6: Thermische cycler conditie voor RT-PCR in één stap.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eiwit (15 μg)</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Voorbeeldbuffer (4x)</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reducerende agent (10x)</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gedeïoniseerd water</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal volume</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 7: Bereiding van monsters voor natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE).

Watch this Scientific Journal Video about Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells at JoVE.com

Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt modelleren van Duchenne spierdystrofie met behulp van MYOD1-geconverteerdeurine-afgeleide cellen om het herstel van dystrofine mRNA en eiwitniveaus te evalueren na exon overslaan.

Exon Overslaan in direct geherprogrammeerd Myotubes verkregen uit menselijke urine-afgeleide cellen

Duchenne muscular dystrophy (DMD), a progressive and fatal muscle disease, is caused by mutations in the DMD gene that result in the absence of dystrophin ...

We hebben een nieuw protocol opgesteld voor de directe herprogrammering van menselijke urine-afgeleide cellen in myobuizen. Deze in vitro modellering stelt ons in staat om exon overslaan in de myotubes afgeleid van patiënt met Duchenne spierdystrofie te evalueren. We ontdekten dat 3-deazaneplanocin A hydrochloride, DZnep, histon methyltransferase remmer aanzienlijk kan bevorderen directe screening van UDC's in myotube in een korte tijd.Deze nieuwe autologe UDC gebaseerde ziekte modellering kan leiden tot de toepassing precisie geneeskunde voor verschillende spierziekten. Om te beginnen, centrifugeren het gehele urinemonster op 400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, aspirate de supernatant verlaten van een milliliter in de buis.Resuspend de pellets individueel in de resterende een milliliter urine. Verzamel die in een enkele 50 milliliter buis en voeg 10 milliliter wasbuffer aan de buis. Centrifugeren de monsters op 200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Aspirate de supernatant verlaten 0,2 milliliter in de buis. Resuspend de cel pellets in 4,5 milliliter van primaire medium. Zaad de cellen in drie putten van gelatine-gecoate zes-put plaat, 1,5 milliliter cel suspensie per put.Cultuur op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Gedurende drie dagen voeg 1,5 milliliter van het primaire medium per dag. Op dag vier, vervang het medium met 1,5 milliliter groeimedium aangevuld zoals beschreven in het manuscript.Na dag vier, vervang het aangevulde groeimedium om de andere dag tot de UDC cultuur is 80 tot 90%confluent. Verwijder vervolgens het medium en was de cellen met PBS. Splits de cellen met 0,25% trypsin-EDTA.Zaad de cellen op een dichtheid van 3.000 tot 5.000 cellen per vierkante centimeter op een nieuwe gelatine-gecoate 60 millimeter schotel. Zaad de UDC's op 3.000 tot 5.000 cellen per vierkante centimeter op een gelatinegecoate 60 millimeter schotel en plaats de schotel in de couveuse. 24 uur na het zaaien, infecteren de cellen met ontdooid retrovirus bij een veelheid van infectie van 200.Gebruik vers medium met een hexadimethrine bromideconcentratie van 8 microgram per milliliter. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Om de MYOD1-getransduceerde cellen te selecteren, vervangt u het kweekmedium door vers groeimedium dat één microgram per milliliter puromycine bevat.Blijf het medium om de andere dag gedurende zeven tot tien dagen wijzigen. Plaat de MYOD1-getransduceerde UDC's in een collageen gecoate multi-well plaat. Na het uitbroeden van de cellen gedurende 24 uur, verander het groeimedium naar differentiatiemedium beschreven in het manuscript.Verander na drie dagen het differentiatiemedium in vers differentiatiemedium zonder DZNep. Blijf het medium om de drie dagen veranderen. Om de antisense oligonucleotide te transfecteren in de MYOD1-getransduceerde UDC's, meng ASO transfection reagens en differentiatiemedium tot een uiteindelijke concentratie van één tot 10 micromolar.En gebruik dit mengsel om het medium in de putten te vervangen. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius en 5%vochtigheid. Na 72 uur incubatie met ASO, verander het medium naar vers differentiatie medium zonder ASO.Drie tot zeven dagen na aso-transfectie, verwijder het differentiatiemedium. Was de UDC's één keer met PBS en voeg de cellysebuffer toe. Oogst het totale RNA met behulp van een RNA extractiekit.Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer. Zoals beschreven in het manuscript, combineren de reagentia voor een stap RT-PCR in PCR buizen. Plaats de PCR-buizen in de thermocycler en voer de thermocycler uit.Voer microchip elektroforese uit en bereken de exon overslaan efficiëntie. UDC's werden gemakkelijk en niet-invasief verzameld en vormden kolonies binnen een week na de primaire cultuur. MYOD1 transfected UDC's in differentiatiemedium met DZNep konden naar elkaar fuseren en multinucleated myotubes efficiënt vormen.RT-PCR detecteerde duidelijk exon overslaan in MYOD1-UDC's afgeleid van patiënten met Duchenne spierdystrofie. Het overslaan van efficiëntie was afhankelijk van de dosis ASO. Dosis-afhankelijke exon overslaan werd ook gedetecteerd door westerse vlek.Intensiteiten van dystrofie werden gemeten met fluorescerende microscoop een week na ASO-transfectie. Aanzienlijk hogere fluorescerende signalen werden waargenomen in MYOD1-UDC's behandeld met ASO dan in de controle. We kunnen elke spierziekte modelleren die leidt tot het begrijpen van pathofysiologie van die ziekten.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Kunstmatige Factoren om specifiek manipuleren alternatieve splitsing in menselijke cellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...