Name: exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells
Uploaded: 2020-05-07T12:30:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells at JoVE.com

इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) [ग्रांट नंबर 18के07544 से वाईए] का समर्थन किया गया था, तंत्रिका और मानसिक विकारों पर अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता [वाईए को अनुदान संख्या 28-6], और चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी [अनुदान नग 18ek0109239h0002, 18lm020303066h0001, और 18lm0203069h0001 को]

<ol>
	<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Cirak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+skipping+and+dystrophin+restoration+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+after+systemic+phosphorodiamidate+morpholino+oligomer+treatment:+an+open-label,+phase+2,+dose-escalation+study.">Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study.</a> Lancet. 378, 595-605 (2011).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Antoury, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+mRNA+in+human+urine+reveals+splice+variant+biomarkers+of+muscular+dystrophies.">Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies.</a> Nature Communications. 9, 3906 (2018).</li><li>Rahmoune, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transporters+in+human+renal+proximal+tubular+cells+isolated+from+the+urine+of+patients+with+non-insulin-dependent+diabetes.">Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes.</a> Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction.">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9, 3807 (2019).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples.">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+myogenic+differentiation+of+human+urine-derived+cells+as+a+potential+source+for+skeletal+muscle+regeneration.">Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).</li><li>Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+urine-derived+cells+with+inducible+MyoD+for+modeling+human+muscle+disease.">Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease.</a> Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).</li></ol>

न्यूरोलॉजी और मनोरोग के राष्ट्रीय केंद्र अब एनएस-065/NCNP-01, DMD के लिए एक exon ५३ लंघन दवा विकसित कर रहा है, निप्पॉन Shinyaku कंपनी, लिमिटेड के साथ

यहां, हम डीएमडी रोगियों से प्राप्त MYOD1-परिवर्तितयूडीसी में एक्सोन लंघन के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परख प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने इष्टतम एंटीसेंस दृश्यों की कुशलता से जांच की। हम मानते हैं कि MYOD1-परिवर्तितयूडीसी रोग के रोगविज्ञान की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है।
एमआरएनए स्तर पर रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके लंघन करने वाले एक्सोन का मूल्यांकन नई दवाओं की स्क्रीनिंग और नैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले रोगी पात्रता का आकलन करने के लिए अपरिहार्य है । एक्सोन लंघन दक्षता की गणना केवल एमआरएनए स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है।
प्रोटीन के स्तर पर लंघन एक्सोन का मूल्यांकन भी महत्वपूर्ण है क्योंकि डिस्ट्रोफिन बहाली एक किराए के बायोमार्कर के रूप में महत्वपूर्ण है एक्सॉन लंघन के लाभों की भविष्यवाणी करने के लिए । आज तक, एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दृश्यों की स्क्रीनिंग अक्सर प्राथमिक मांसपेशी कोशिका रेखाओं का उपयोग करके की जाती है या मानव rhabdomyosarcoma (RD) कोशिकाओं सहित myoblast सेल लाइनों को अमर कर दिया जाता है, लेकिन हम मांसपेशियों की कोशिका रेखाओं या आरडी सेल लाइनों का उपयोग करके डिस्ट्रोफिन के स्तर की वसूली को माप नहीं सकते क्योंकि वे इस प्रोटीन को एंडोजेनेस से व्यक्त करते हैं। हम स्पष्ट रूप से डीएमडी रोगी-व्युत्पन्न MYOD1-UDCsमें डिस्ट्रोफिन की बहाली का पता लगा सकते हैं। हमारे नए परख में, हम मानते है कि पश्चिमी दाग द्वारा बहाल प्रोटीन का मूल्यांकन मात्रात्मकता में बेहतर है । दूसरी ओर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा मूल्यांकन 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके एक साथ कई उम्मीदवार यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है।
इस लेख में, हम एक कुशल मॉडलिंग DMD मांसपेशी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन MYOD1का उपयोग कर-आरटी-पीसीआर, पश्चिमी दाग के साथ UDCs परिवर्तित, और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ एकण लंघन के बाद mRNA और प्रोटीन के स्तर पर बहाल डिस्ट्रोफिन का मूल्यांकन करने के लिए । यूडीसी को गैर-आक्रामक रूप से और आसानी से एकत्र किया जा सकता है। इसलिए, हम मानते हैं कि मांसपेशियों के विकारों के प्रकार की परवाह किए बिना ब्रांड-न्यू इन विट्रो परख को बुनियादी और अनुवादअध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), एक प्रगतिशील, घातक मांसपेशी रोग, डीएमडी जीन में फ्रेम-शिफ्ट म्यूटेशन के कारण होता है जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रोफिन प्रोटीन1की अनुपस्थिति होती है। एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड आधारित एक्सोन लंघन चिकित्सा डीएमडी के लिए वादा करने के लिए सोचा है । यह थेरेपी डीएमडी रीडिंग फ्रेम2को बहाल करने के लिए प्री-एमआरएनए स्प्लिकिंग में फेरबदल करके गंभीर डीएमडी फेनोटाइप को मामूली बेकर मस्कुलर डिस्ट्रॉफी जैसी फेनोटाइप में बदलने पर आधारित है। हमने हाल ही में फॉस्फोरोडिडेट मॉर्फोलिनो ओलिगोमर (पीएमओ) विल्टोलरसेन के बार-बार नसों में प्रशासन के आधार पर एक पहला मानव अध्ययन पूरा किया है, जो डीएमडी में एक्सोन 53 लंघन को प्रेरित कर सकता है, और एक उत्कृष्ट सुरक्षा प्रोफ़ाइल, आशाजनक प्रभावकारिता, और स्वीकार्य फार्माकोकिनेटिक पैरामीटर (यूएमआईएन के रूप में पंजीकृत: 000010964 और ClinicalTrials.gov: एनसीटीएनसी020811111) का प्रदर्शन कियाहै।
हालांकि, रोग के लिए लागत प्रभावी और कुशल उपचार विकसित करने के लिए, डीएमडी रोगियों से प्राप्त प्राथमिक मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग करइन विट्रो परीक्षणनैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले दवा स्क्रीनिंग और रोगी पात्रता सत्यापन के लिए आवश्यक हैं, साथ ही बायोमार्कर जो मानव परीक्षणों के दौरान लंघन उपचार ों की प्रभावकारिता को दर्शाते हैं4। हाल ही में, हमने डीएमडी7के प्राथमिक मायोब्लास्ट मॉडल के रूप में रोगी-विशिष्ट MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं (यूडीसी)5,,6 को विकसित करने के लिए एक उपन्यास तकनीक की सूचना दी। इस प्रकार, मायोब्लास्ट उत्पन्न करने के लिए, केवल रोगियों से मूत्र के संग्रह की आवश्यकता होती है और किसी आक्रामक प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं होती है। इस लेख में, हम एक्पोन लंघन के बाद बहाल डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए 3-deazaneplanocin एक हाइड्रोक्लोराइड के साथ इलाज MYOD1-परिवर्तितयूडीसी का उपयोग करDMD मांसपेशी के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% P/S Solution Stabilized</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td>Western blot (WB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-DYS1</td>
			<td>Immunocytochemistry(ICC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, Dylight 488</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>DK-2488</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Western bot and ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-X800</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-800</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLBANKER</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>CB011</td>
			<td>Cell stock in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8280J1</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639298</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>Protein extraction for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5 &#945; Competent Cells</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td>ASO transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzFastBlot HMW</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2-293 packaging cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631458</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM with GlutaMAX-I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12643</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>NICHIREI BIOSCIENCE INC.</td>
			<td>424151</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PDGF-AB</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-00AB-10UG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2020</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Western Device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2000</td>
			<td>WB (Automated mestern-processing device)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD cloning Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639648</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILTEX HV 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOD1 (GFP-tagged)</td>
			<td>ORIGENE</td>
			<td>RG209108</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740986.20</td>
			<td>PCR clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR066A</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td>Retroviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRetroX-TetOne-Puro Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634307</td>
			<td>Retroviral vecor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631305</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3190</td>
			<td>Material for growth medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM SingleQuots</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4127</td>
			<td>Material for primary medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus Titer Set</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>6166</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-X Concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631455</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline-free foetal bovine serum</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect transfection reagent</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631317</td>
			<td>Transfection of plasmids into packaging cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells

ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी), एक प्रगतिशील और घातक मांसपेशियों की बीमारी, डीएमडी जीन में उत्परिवर्तन के कारण होती है जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रोफिन प्रोटीन की अनुपस्थिति होती है। आज तक, हमने मॉर्फोलिनो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के प्रणालीगत इंजेक्शन के आधार पर न्यूरोलॉजी और मनोरोग के राष्ट्रीय केंद्र में एक अन्वेषक-प्रारंभिक प्रथम-इन-ह्यूमन अध्ययन पूरा कर लिया है जो एक्सोन-53 लंघन से ग्रस्त हैं। डीएमडी के प्रभावी उपचार के लिए, डीएमडी रोगियों से प्राप्त मायोब्लास्ट के साथ इन विट्रो परीक्षण दवाओं को स्क्रीन करने और नैदानिक परीक्षण शुरू करने से पहले रोगी पात्रता का आकलन करना आवश्यक माना जाता है। हाल ही में, हमने डीएमडी के सेलुलर मॉडल के रूप में हिस्टोन मिथाइलट्रांसफरेन्से अवरोधक (3-deazaneplanocin A हाइड्रोक्लोराइड) के साथ इलाज किया गया एक नया MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न सेल (यूडीसी) की सूचना दी। नए ऑटोलॉगस यूडीसी डीएमडी के रोग-विशिष्ट फेनोटाइप की फेनोकॉपी दिखा सकता है, जिससे मांसपेशियों से संबंधित विभिन्न बीमारियों में सटीक दवा का उपयोग हो सकता है। इस लेख में, हम एक्क्रोन लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर की बहाली का मूल्यांकन करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिटेज़ पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), वेस्टर्न ब्लॉटिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ MYOD1-परिवर्तितयूडीसी का उपयोग करके डीएमडी मांसपेशी कोशिकाओं के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

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Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells

इस लेख में, हम एक्सॉन लंघन के बाद डिस्ट्रोफिन एमआरएनए और प्रोटीन के स्तर की बहाली का मूल्यांकन करने के लिए MYOD1-परिवर्तितमूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी मांसपेशियों के कुशल मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

मानव मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं से प्राप्त सीधे रीप्रोग्राम्ड मायोट्यूब में एक्सोन लंघन

Duchenne muscular dystrophy (DMD), a progressive and fatal muscle disease, is caused by mutations in the DMD gene that result in the absence of dystrophin ...

हमने मानव मूत्र-व्युत्पन्न कोशिकाओं को मायोट्यूब में सीधे पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए एक नया प्रोटोकॉल स्थापित किया है। यह इन विट्रो मॉडलिंग हमें ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी के साथ रोगी से प्राप्त मायोट्यूब में एक्सोन लंघन का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है। हमें पता चला कि 3-deazaneplanocin एक हाइड्रोक्लोराइड, DZnep, हिस्टोन मिथाइलट्रांसफरेज अवरोधक काफी समय की एक छोटी राशि में myotube में UDCs की सीधी स्क्रीनिंग को बढ़ावा दे सकता है ।इस नए ऑटोलॉगस यूडीसी आधारित रोग मॉडलिंग विभिन्न मांसपेशियों की बीमारियों के लिए आवेदन सटीक दवा के लिए नेतृत्व कर सकता है। शुरू करने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर पूरे मूत्र नमूना अपकेंद्रित्र। इसके बाद, ट्यूब में एक मिलीलीटर छोड़ने वाले सुपरनेट को एस्पिरेट करें।मूत्र के शेष एक मिलीलीटर में अलग-अलग छर्रों को फिर से खर्च करें। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में उन ले लीजिए और ट्यूब के लिए 10 मिलीलीटर वाशिंग बफर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।ट्यूब में 0.2 मिलीलीटर छोड़ने वाले सुपरनेट को एस्पिरेट करें। प्राथमिक माध्यम के 4.5 मिलीलीटर में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें। जिलेटिन के तीन कुओं में कोशिकाओं को बीज-लेपित छह अच्छी तरह से थाली, १.५ मिलीलीटर सेल निलंबन प्रति अच्छी तरह से ।37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर संस्कृति। तीन दिनों के लिए प्रत्येक दिन प्राथमिक माध्यम के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। चार दिन, पांडुलिपि में वर्णित के रूप में विकास माध्यम पूरक के १.५ मिलीलीटर के साथ माध्यम की जगह ।चार दिन के बाद, पूरक विकास माध्यम हर दूसरे दिन की जगह जब तक UDC संस्कृति ८० से ९०% ढुलमुल है । फिर माध्यम निकालें और कोशिकाओं को पीबीएस से धो लें। 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके कोशिकाओं को विभाजित करें।एक नए जिलेटिन-लेपित 60 मिलीमीटर पकवान पर प्रति चुकता सेंटीमीटर 3, 000 से 5, 000 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं को बीज। एक जिलेटिन लेपित 60 मिलीमीटर पकवान पर प्रति वर्ग सेंटीमीटर 3, 000 से 5, 000 कोशिकाओं पर यूडीसी बीज और इनक्यूबेटर में पकवान जगह है। सीडिंग के 24 घंटे बाद, कोशिकाओं को 200 के संक्रमण की बहुलता पर गल रेट्रोवायरस से संक्रमित करें।8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड एकाग्रता के साथ ताजा माध्यम का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट। MYOD1-transduced कोशिकाओं का चयन करने के लिए, ताजा विकास माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह प्यूरोमाइसिन के एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर युक्त ।सात से 10 दिन तक हर दूसरे दिन माध्यम बदलते रहें। एक कोलेजन लेपित बहु-अच्छी प्लेट में MYOD1-transduced UDCs प्लेट। कोशिकाओं को 24 घंटे तक इनक्यूबेटिंग करने के बाद, विकास माध्यम को पांडुलिपि में वर्णित विभेदन माध्यम में बदलें।फिर तीन दिनों के बाद, DZNep के बिना नए भेदभाव माध्यम में भेदभाव माध्यम बदलें। हर तीन दिन में माध्यम बदलते रहें। मायओडी1-ट्रांसड्यूडेड यूडीसी में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड को स्थानांतरित करने के लिए, एसो ट्रांसफैक्शन रीएजेंट और विभेदन माध्यम को एक से 10 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता में मिलाएं।और इस मिश्रण का उपयोग कुओं में माध्यम को बदलने के लिए करें। थाली को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें। एएसओ के साथ इनक्यूबेशन 72 घंटे के बाद, एएसओ के बिना माध्यम को नए सिरे से भेदभाव माध्यम में बदलें।ASO ट्रांसफैक्शन के तीन से सात दिन बाद, विभेदन माध्यम को हटा दें। पीबीएस के साथ एक बार यूडीसी धोएं और सेल लाइसिस बफर जोड़ें। आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कुल आरएनए को काटा।स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए एकाग्रता को मापें। जैसा कि पांडुलिपि में वर्णित है, पीसीआर ट्यूबों में वन-स्टेप आरटी-पीसीआर के लिए रिएजेंट्स को मिलाएं। पीसीआर ट्यूब को थर्मोसाइकिलर में रखें और थर्मोसाइकिल चलाएं।माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस करें और एक्सोन लंघन दक्षता की गणना करें। यूडीसी को प्राथमिक संस्कृति के एक सप्ताह के भीतर आसानी से और गैर-निवास और गठन कॉलोनियों को आसानी से एकत्र किया गया था। DZNep के साथ विभेदन माध्यम में MYOD1 संक्रमित यूडीसी एक दूसरे को फ्यूज कर सकता है और कुशलता से बहुनीय मायोट्यूब का गठन कर सकता है।आरटी-पीसीआर ने ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी वाले रोगियों से प्राप्त MYOD1-UDCs में एक्सोन लंघन का स्पष्ट रूप से पता लगाया । लंघन दक्षता ASO की खुराक पर निर्भर था। खुराक पर निर्भर exon लंघन भी पश्चिमी दाग द्वारा पता चला था ।डिस्ट्रोफिन की तीव्रता को एएसओ ट्रांसफैक्शन के एक सप्ताह बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ मापा गया था। नियंत्रण की तुलना में एएसओ के साथ इलाज किए गए MYOD1-UDCs में स्पष्ट रूप से उच्च फ्लोरोसेंट सिग्नल देखे गए। हम किसी भी मांसपेशियों की बीमारी मॉडल उन रोगों के रोगविज्ञान की समझ के लिए अग्रणी कर सकते हैं ।

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

पर हौसले अलग मानव विलस Cytotrophoblasts siRNA अभिकर्मक और EMSA विश्लेषण

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

मानव प्राथमिक सेल संस्कृतियों में circadian घड़ी जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन के स्राव के समानांतर मापन

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

इंजिनियरिंग कृत्रिम कारक विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में वैकल्पिक स्पष्टीकरण में हेरफेर करने के लिए

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

शारीरिक ऑक्सीजन स्थिति से अवगत कराया मानव कोशिकाओं में कैप बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

आइसोलेटिंग, अनुक्रमण और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से extracellular micrornas का विश्लेषण

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट Drosophila का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

ट्यूमर मंडल व्युत्पत्ति और प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं से उपचार माउस Rabdoyosarcomas से अलग

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल में CRISPR-CAS9 का उपयोग कर परिभाषित जीनोमिक संशोधनों का उत्पादन

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...