Name: exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells
Uploaded: 2020-05-07T12:30:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия научным грантам для научных исследований (C) «Грант No 18K07544 до Y.A.», Гранты-в-помощь для исследований по нервным и психическим расстройствам (грант No 28-6 до Y.A.) и Японское агентство медицинских исследований и разработок (grant nos. 18ek0109239h002), 18lm0203066h0001, и 18lm0203069h001 к Y.A.A.A.

<ol>
	<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Cirak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+skipping+and+dystrophin+restoration+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+after+systemic+phosphorodiamidate+morpholino+oligomer+treatment:+an+open-label,+phase+2,+dose-escalation+study.">Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study.</a> Lancet. 378, 595-605 (2011).</li><li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065/NCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy.">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li><li>Antoury, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+extracellular+mRNA+in+human+urine+reveals+splice+variant+biomarkers+of+muscular+dystrophies.">Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies.</a> Nature Communications. 9, 3906 (2018).</li><li>Rahmoune, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transporters+in+human+renal+proximal+tubular+cells+isolated+from+the+urine+of+patients+with+non-insulin-dependent+diabetes.">Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes.</a> Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+derived+cells+are+a+potential+source+for+urological+tissue+reconstruction.">Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction.</a> The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).</li><li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride.">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9, 3807 (2019).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples.">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+myogenic+differentiation+of+human+urine-derived+cells+as+a+potential+source+for+skeletal+muscle+regeneration.">Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).</li><li>Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+urine-derived+cells+with+inducible+MyoD+for+modeling+human+muscle+disease.">Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease.</a> Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).</li></ol>

Национальный центр неврологии и психиатрии в настоящее время разрабатывает NS-065/NCNP-01, экзон 53 пропуск наркотиков для DMD, с Nippon Shinyaku Co., Ltd.

Здесь мы описываем подробный протокол пропуска экзона в MYOD1-преобразованныхUDCs, полученных от пациентов DMD. Используя систему ассс, мы эффективно проверяли оптимальные антисмысловые последовательности. Мы предполагаем, что MYOD1-преобразованныеУДК могут быть полезны для исследования патофизиологии заболевания.
Оценка пропуска экзона с использованием клеток, полученных из числа пациентов на уровне мРНК, необходима для скрининга новых препаратов и оценки права пациента до проведения клинических испытаний. Расчет эффективности пропуска экзона может быть оценен только на уровне мРНК.
Оценка экзона пропуска на уровне белка также важно, потому что восстановление дистрофина имеет важное значение в качестве суррогатного биомаркера, чтобы предсказать преимущества экзона пропуска. На сегодняшний день скрининг антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей часто выполняется с использованием первичных линий мышечных клеток или увековечил линии клеток миобласта, включая клетки рабдомиосаркомы человека (РД), но мы не можем измерить восстановление уровня дистрофина с помощью линий мышечных клеток или RD-клеточных линий, потому что они выражают этот белок негодуродно. Мы можем четко обнаружить восстановление дистрофина в DMD пациента производных MYOD1-UDCsв дозе зависимым образом. В нашем новом анализе мы считаем, что оценка восстановленного белка западным испугом превосходит по количественной оценке. С другой стороны, оценка иммуноцитохимии с использованием 96 скважин ных пластин идеально подходит для скрининга многих соединений кандидата одновременно.
В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышц ЫМД с использованием MYOD1-преобразованныхUDCs вместе с RT-PCR, Западным блоттингом и иммуноцитохимией для оценки восстановленного дистрофина на мРНК и уровня белка после пропуска экзона. UDCs могут быть собраны неинвазивно и легко. Таким образом, мы предполагаем, что совершенно новый анализ in vitro может быть применен к широкому спектру основных и трансляционных исследований независимо от типа мышечных расстройств.

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD), прогрессирующее, смертельное заболевание мышц, вызвано перестановками в гене DMD, которые приводят к отсутствию белка дистрофина1. Антисмысловая олигонуклеотидная экзонная терапия, как полагают, является многообещающей для DMD. Эта терапия основана на преобразовании более тяжелого фенотипа DMD в более мягкий беккер мышечной дистрофии, как фенотип путем изменения пре-мРНК сращивания для восстановления DMD чтениякадра 2. Недавно мы завершили первое в человеке исследование, основанное на повторном внутривенном введении фосфородиамидат морфолино олигомер (PMO) viltolarsen, который может вызвать экзон 53 пропуск в DMD, и продемонстрировали отличный профиль безопасности, перспективные эффективности,3и приемлемые фармакокинетические параметры (зарегистрирован как UMIN: 000010964 и ClinicalTrials.gov0000.
Однако, чтобы разработать экономически эффективные и эффективные методы лечения болезни, в пробирке тесты с использованием первичных мышечных клеток, полученных от пациентов DMD имеют важное значение для скрининга наркотиков и проверки права пациента до проведения клинических испытаний, а также биомаркеры, которые отражают эффективность экзон пропуска терапии во время испытаний на людях4. Совсем недавно мы сообщили о новой технологии для разработки пациентов конкретных MYOD1-преобразованныхмочи полученных клеток (UDCs)5,6 в качестве основной модели миобласт DMD7. Таким образом, для генерации миобластов требуется только сбор мочи у пациентов и не требуется инвазивная процедура. В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышц DMD с использованием MYOD1-преобразованныхУДК, обработанных гидрохлоридом 3-деазанепланоцин а для оценки восстановленного дистрофина мРНК и белка после пропуска экзона.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% P/S Solution Stabilized</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td>Western blot (WB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-dystrophin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-DYS1</td>
			<td>Immunocytochemistry(ICC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, Dylight 488</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>DK-2488</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td>Western bot and ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-X800</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-800</td>
			<td>Fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLBANKER</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>CB011</td>
			<td>Cell stock in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8280J1</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639298</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>Protein extraction for WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH5 &#945; Competent Cells</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>9057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-Porter</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>2922498000</td>
			<td>ASO transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Thick Blot Filter Paper</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703965</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EzFastBlot HMW</td>
			<td>Atto</td>
			<td>AE-1460</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibroblast growth factor-basic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP2-293 packaging cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631458</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11765-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM with GlutaMAX-I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSpeed Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12643</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histofine Simple Stain MAX PO</td>
			<td>NICHIREI BIOSCIENCE INC.</td>
			<td>424151</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PDGF-AB</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-00AB-10UG</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2020</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBind Flex Western Device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SLF2000</td>
			<td>WB (Automated mestern-processing device)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF)</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD cloning Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639648</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3146</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILTEX HV 0.45 &#956;m filter</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOD1 (GFP-tagged)</td>
			<td>ORIGENE</td>
			<td>RG209108</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740986.20</td>
			<td>PCR clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EA03785BOX</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LA0041</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR066A</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003</td>
			<td>Retroviral infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRetroX-TetOne-Puro Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634307</td>
			<td>Retroviral vecor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631305</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN OneStep RT-PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>210212</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3190</td>
			<td>Material for growth medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REGM SingleQuots</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4127</td>
			<td>Material for primary medium of UDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrovirus Titer Set</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>6166</td>
			<td>Titer check of retroviral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retro-X Concentrator</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631455</td>
			<td>Retroviral production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89901</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>RNA extraction for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline-free foetal bovine serum</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631106</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>ICC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>WB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect transfection reagent</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>631317</td>
			<td>Transfection of plasmids into packaging cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exon skipping in directly reprogrammed myotubes obtained from human urine-derived cells

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD), прогрессирующее и смертельное заболевание мышц, вызвана мутациями в гене DMD, которые приводят к отсутствию белка дистрофина. На сегодняшний день мы завершили исследование, инициированное исследователем в Национальном центре неврологии и психиатрии, основанное на системной инъекции морфолино олигонуклеотидов, которые склонны к пропуску экзон-53. Для эффективного лечения DMD, в пробирке тестирования с myoblasts, полученных из DMD пациентов для проверки наркотиков и оценки права пациента до проведения клинических испытаний считается необходимым. Совсем недавно мы сообщили о новой MYOD1-преобразованноймочи полученных клеток (UDC) лечение ингибитором гистон метилтрансферазы (3-деазанепланоцин гидрохлорид), как клеточная модель DMD. Новый аутологичный УДК может показать фенокопию специфических фенотипов ДМД, что приводит к применению высокоточной медицины при различных заболеваний, связанных с мышцами. В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечных клеток DMD с использованием MYOD1-преобразованныхUDCs вместе с обратной транскриптазной полимеразной цепной реакцией (RT-PCR), западной блоттингом и иммуноцитохимией для оценки восстановления дистрофина мРНК и уровней белка после пропуска экзона.

Мы могли бы собирать UDCs легко и неинвазивно. UDCs сформировали колонии в течение недели после начала первичной культуры клеток мы наблюдали заметной пролиферативной способности. Культура UdCs была проста, и бактериальное или грибковое загрязнение было редким, когда процедура была выполнена правильно.
На рисунке 2 показаны репрезентативные фазово-контрастные изображения колонии УДК через неделю после первичной культуры(рисунок 2А)и MYOD1-UDCs через неделю после дифференциации(рисунок 2B). На рисунке 3 показано успешное обнаружение экзона пропуска в UDCs, полученных от пациентов DMD RT-PCR. Рисунок 3показывает RT-PCR анализ дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида лечения в ДЗНеп-обработанных MYOD1-UDCs,полученных от 6-летнего мужчины с экзоном 45-54 удаление в гене DMD. Открытая рамка чтения была восстановлена пропуском exon 44. На 14 день после дифференциации, мы подтвердили индукции экзона пропуска в дозе зависимым образом(Рисунок 3B). Верхние полосы обозначают родные продукты, а нижние полосы обозначают экзон 44-пропущенные продукты, которые восстановили открытую рамку чтения.
Рисунок 4 показывает успешное обнаружение дистрофина после пропуска экзона в UdCs, полученных от пациентов DMD западным изависимым от дозы образом. Мы также обнаружили восстановленное экспрессию дистрофина с помощью иммуноцитохимии(рисунок 5). Мы измерили интенсивность дистрофина флуоресцентным микроскопом через неделю после переклификации антисмыслового олигонуклеотида (ASO) на 96 хорошо пластины(рисунок 5А). Заметно более высокие флуоресцентные сигналы наблюдались в MYOD1-UDCs, обработанных ASO, чем в MYOD1-UDCs, обработанных с контролем ASO(рисунок 5B).
Эти результаты показывают, что наш новый анализ может оценить экзон пропуска эффективно в MYOD1-UDCs,полученных от пациентов DMD на уровне мРНК и белка.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление стека передачи для полусухого западного поместья. Две бумаги, пропитанные буфером сближания, были заложены на отрицательном терминале, и две бумаги, пропитанные буфером, были уложены поверх этого. Гель, который был пропитан в буфере, был аккуратно заложен над мембраной PVDF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig2.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативные изображения УДК. (A)Фазово-контрастное изображение УДК через неделю после первичной культуры. Шкала бар 200 мкм. Всет: увеличенное изображение области в белом прямоугольнике. (B) Фазовое контрастное изображение MYOD1-UDCs через неделю после дифференциации. Шкала бар 50 мкм. Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig3.jpg"> Рисунок 3: Успешная оценка пропуска экзона в клетках, полученных от мочи (UDCs), полученных от пациентов DMD RT-PCR. ()RT-PCR анализ дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида лечения в 3-деазанепланоцин гидрохлорид (ДЗНеп) лечение MYOD1-UDCs,полученных от мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) пациента с экзон45-54 удаления. Дзнеп-обработанный MYOD1-UDCsтакже были обработаны с антисмыслом управления на 1-10 мкм концентрации в качестве контроля. Верхние полосы были непропущенными продуктами (Удаление Ex 45-54), которые остались вне рамки для чтения. Нижние полосы были экзон 44-пропущенных продуктов (Ex 44-54 удаления и Ex 44 пропустил), которые восстановили открытый кадр чтения. (B) Пропуск эффективность была рассчитана как (экзон 44-пропущенный протокол моляритство)/(родной й экзон 44-пропущенный протокол моляристость »отмечена стрелками) х 100% с помощью системы электрофорасиса микрочипа. Для сравнения эффективности пропускающих (n- 3 для каждой группы) использовался односторонний ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Bonferroni(n) no 3 для каждой группы, «P »lt; 0.0001). Данные выражаются в виде среднего значения SEM. Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig4.jpg"> Рисунок 4: Успешная оценка экзона пропуска в мочеклеток (UDCs) от пациентов DMD западной подьеносец. (A) Представитель Западной пятно для дистрофина в ДЗНеп лечение MYOD1-UDCsот пациента DMD с экзон45-54 удаления после экзона 44 пропуска. Для обнаружения дистрофина использовался антидистрофин (против C-терминала). (B) Относительная интенсивность полос нормализованы до экспрессии з-тубулин были сравнены в пациента полученных клеток с и без антисмыслового олигонуклеотида лечения, выполняя одностороннее ANOVA следуют Bonferroni после hoc тест (n No 3 для каждой группы, "P lt; 0,01, Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60840/60840fig5.jpg"> Рисунок 5: Тепловые карты иммуноцитохимии для дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида в ЛЕЧЕНИи ДЗНеп MYOD1-UDCs, полученные от пациента DMD с удалением экзона 45-54. (A) Удаление экзона 45-54 восстановил открытый кадр чтения на основе экзона пропуска экзона 44. (B) Интенсивность сигнала была количественно с помощью флуоресцентного микроскопа после 1 недели антисмыслового олигонуклеотида трансфекции на 96 хорошо пластины. Для сравнения использовался односторонний ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Bonferroni (n No 3-4 для каждой группы, qs p slt; 0.0001). Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60840/60840fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Объем</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x пЦР-премикс</td>
			<td>12,5 л</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Передняя грунтовка</td>
			<td>5 рмоль</td>
			<td>0,2 мкм</td>
		</tr>
<tr>
<td>Обратная грунтовка</td>
			<td>5 рмоль</td>
			<td>0,2 мкм</td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаблон</td>
			<td>80 нг</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Стерилизована дистиллированная вода</td>
			<td>до 25 л л</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем на одну реакцию</td>
			<td>25 зл.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Смесь для усиления MYOD1 по РТ-ПЦР.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>98 кв. c</td>
			<td>10 с</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>55 кк с</td>
			<td>10 с</td>
			<td>35 циклов</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 кк с</td>
			<td>10 с</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Условия для теплового цикла для усиления MYOD1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x K буфер</td>
			<td>2 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ретровирусный вектор (500 нг/л)</td>
			<td>2 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Фермент ограничения 1 (2–15 U)</td>
			<td>1 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Фермент ограничения 2 (2–15 U)</td>
			<td>1 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Стерилизована дистиллированная вода</td>
			<td>14 зл.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>20 зл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: Смесь для трубки для переваривания ретровирусного вектора.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Очищенный фрагмент MYOD1</td>
			<td>100 нг</td>
		</tr>
<tr>
<td>Усваиваемый ретровирусный вектор</td>
			<td>100 нг</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x Фермент ный премикс</td>
			<td>4 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Стерилизована дистиллированная вода</td>
			<td>до 20 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>20 зл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: Смесь для реакции клонирования синтеза.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Решение</td>
			<td>Объем/реакция (КЛ)</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Безrза</td>
			<td>Переменной</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Одноступенчатый буфер РТ-ПЦР</td>
			<td>4</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>смесь dNTP (содержащая 10 мМ каждого dNTP)</td>
			<td>0.8</td>
			<td>400 мМ каждого dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>Передняя грунтовка (10 мМ)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0,6 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Обратная грунтовка (10 мМ)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>0,6 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Одноступенчатая ферментная смесь RT-PCR</td>
			<td>0.8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ингибитор RNase (по желанию)</td>
			<td>Переменной</td>
			<td>5–10 единиц/реакция</td>
		</tr>
<tr>
<td>Шаблон РНК</td>
			<td>50-400 нг</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 5: Необходимые соединения для одной реакции одноступенчатой РТ-ПЦР.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 цикл</td>
			<td>Обратная транскрипция</td>
			<td>30 мин.</td>
			<td>50 кв. c</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 цикл</td>
			<td>Первоначальный шаг активации ПЦР</td>
			<td>15 мин.</td>
			<td>95 кв. c</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1 цикл</td>
			<td>Денатурация</td>
			<td>1 мин.</td>
			<td>94 кК</td>
		</tr>
<tr>
<td>Отжига</td>
			<td>1 мин.</td>
			<td>60 кк</td>
		</tr>
<tr>
<td>Расширение</td>
			<td>1 мин.</td>
			<td>72 кк с</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 цикл</td>
			<td>Окончательное расширение</td>
			<td>7 мин.</td>
			<td>72 кк с</td>
		</tr>
<tr>
<td>Держать</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 кк с</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 6: Тепловое состояние циклизатора для одноступенчатой РТ-ПЦР.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Объем</td>
		</tr>
<tr>
<td>Белок (15 мкг)</td>
			<td>10 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Образец буфера (4x)</td>
			<td>5 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Уменьшающий агент (10x)</td>
			<td>2 л</td>
		</tr>
<tr>
<td>Деионизированная вода</td>
			<td>3 зл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>20 зл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 7: Приготовление образцов для натрия додецил сульфат полиакриламида гель электрофорес (SDS-PAGE).

Watch this Scientific Journal Video about Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells at JoVE.com

Exon Skipping in Directly Reprogrammed Myotubes Obtained from Human Urine-Derived Cells

В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечной дистрофии мышц Дюшенна с использованием MYOD1-преобразованныхмочевых клеток для оценки восстановления дистрофин мРНК и уровня белка после пропуска экзона.

Exon Пропуск в непосредственно перепрограммированных Myotubes Полученные из человеческих мочи производные клетки

Duchenne muscular dystrophy (DMD), a progressive and fatal muscle disease, is caused by mutations in the DMD gene that result in the absence of dystrophin ...

Мы установили новый протокол для прямого перепрограммирования клеток человека, полученных из мочи, в миотрубы. Это моделирование in vitro позволяет нам оценить exon пропуская в myotubes выведенных от пациента с мышечной дистрофией Duchenne. Мы обнаружили, что 3-deazaneplanocin гидрохлорид, D'nep, являются ингибитором метилтрансферазы гистона может значительно способствовать прямому скринингу UDCs в миоту в короткий промежуток времени.Это новое аутологичное моделирование болезней на основе УДК может привести к применению точной медицины для различных мышечных заболеваний. Для начала центрифуга всей мочи составляет 400 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее, аспирировать супернатант оставив один миллилитр в трубке.Resuspend гранулы индивидуально в оставшемся один миллилитр мочи. Соберите их в одну 50 миллилитровую трубку и добавьте 10 миллилитров стирального буфера в трубку. Центрифуга образцов при температуре 200 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.Аспирировать супернатант оставляя 0,2 миллилитров в трубке. Повторное производство клеточных гранул в 4,5 миллилитров первичной среды. Семя клетки в трех колодцах желатина покрытием шесть скважин пластины, 1,5 миллилитров клеточной суспензии на скважину.Культура при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. В течение трех дней добавляйте 1,5 миллилитров первичной среды каждый день. На четвертый день замените носитель 1,5 миллилитров среды роста, дополненных, как описано в рукописи.После дня четыре, заменить дополненную среду роста через день, пока культура УДК от 80 до 90% стечения. Затем удалите среду и промыть клетки с PBS. Разделите ячейки, используя 0.25%трипсин-EDTA.Семя клеток при плотности от 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на новый желатин покрытием 60 миллиметров блюдо. Семя UDCs на 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на желатин покрытием 60 миллиметров блюдо и поместите блюдо в инкубатор. Через 24 часа после посева, заразить клетки с разморожевания ретровируса на множественность инфекции 200.Используйте свежую среду с концентрацией бромистого гексадиметрина 8 микрограмм на миллилитр. Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Чтобы выбрать клетки, индуцированные MYOD1, замените культурную среду свежей средой роста, содержащей один микрограмм на миллилитр пуромицина.Продолжайте менять носитель через день в течение семи-10 дней. Плита MYOD1-трансдуцированных UDCs в коллагена покрытием несколько хорошо пластины. После инкубации клеток в течение 24 часов измените средний рост на среду дифференциации, описанную в рукописи.Затем, через три дня, измените среду дифференциации на свежую дифференциацию среды без ДЗНЕП. Продолжайте менять носитель каждые три дня. Чтобы трансфицируют антисенсовый олигонуклеотид в MYOD1-трансдуцированные UDCs, смешайте реагент аСО трансинфекции и дифференциацию среды до конечной концентрации от одного до 10 микромолеров.И использовать эту смесь для замены среды в скважинах. Инкубировать пластину при 37 градусах По Цельсию и 5%влажности. После 72 часов инкубации с ASO, изменить средний на свежий дифференциации среды без ASO.Через три-семь дней после трансфекции ASO удалите дифференциацию среды. Вымойте UDCs один раз с PBS и добавить буфер лиза ячейки. Урожай общей РНК с помощью комплекта извлечения РНК.Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Как описано в рукописи, объединить реагенты для одношагового RT-PCR в ПЦР труб. Поместите трубки ПЦР в термоциклер и запустите термоциклер.Выполните электрофорез микрочипа и вычислите эффективность пропуска экзона. UDCs были собраны легко и неинвазивно и сформированные колонии в пределах недели главным образом культуры. MYOD1 трансфицированных UDCs в дифференциации среды с D'Nep может сливаться друг с другом и формируется многоядерных миотрубов эффективно.RT-PCR четко обнаружены эксон пропуск в MYOD1-UDCs, полученных от пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна. Эффективность пропуска зависит от дозы АСО. Доза-зависимых экзон пропуск был также обнаружен западной пятно.Интенсивности дистрофина были измерены с помощью флуоресцентного микроскопа через неделю после трансфекции ASO. Заметно более высокие флуоресцентные сигналы наблюдались в MYOD1-UDCs, обработанных ASO, чем в контроле. Мы можем смоделировать любое мышечное заболевание, ведущее к пониманию патофизиологии этих заболеваний.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Опухолевая сфера произвлечения и лечения из первичных опухолевых клеток, изолированных от мыши Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...