Name: synthesis of functionalized magnetic nanoparticles, their conjugation with the siderophore feroxamine and its evaluation for bacteria detection
Uploaded: 2020-06-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection at JoVE.com

著者らは、クラウス・ハントケ教授(ドイツ・テュービンゲン大学)が、この研究で使用されたエルシニア・エンテオコリティカ株を親切に供給してくれたことを感謝する。この研究は、欧州連合(EU)のFEDERプログラムが共同出資するスペインの国家研究機関(AEI/FEDER)からのAGL2015-63740-C2-1/2-RおよびRTI2018-093634-B-C22(AEI/FEDER、EU)からの助成金によって支えられました。サンティアゴ・デ・コンポステーラ大学とア・コルーニャ大学での研究も、GC2018/018、GRC2018/039、およびED431E 2018/03(CICA-INIBIC戦略グループ)の助成金によって支えられ、Xunta de Galiciaから。最後に、このビデオプロトコルのボイスオフを行う彼女の素晴らしいコラボレーションのためにヌリアカルボに感謝したいと思います。

注:不活性雰囲気条件下で行われた反応については、すべてのガラス製品は、以前に65°Cでオーブンで乾燥し、ゴム中隔で密封し、アルゴンで3回パージしました。
1. フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成
<ol><li>Fe3O4磁性ナノ粒子(MP)の合成<ol>
<li>20 mLガラスバイアルに0.5gのFe(acac)3を加え、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。3</li>
		<li>こ...

<ol>
	<li>Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticles+for+the+manipulation+of+proteins+and+cells.">Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells.</a> Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).</li><li>Zheng, T., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-based+detection+of+Fe(III)+and+microbial+pathogens.">Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens.</a> Metallomics. 4, 866-880 (2012).</li><li>Hider, R. 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このプロトコルは、共有結合による磁性ナノ粒子とシドロフォアフェロキサミンとのコンジュゲートの合成を記述する。マグネタイトの合成は、水系における腐食の磁気コアを保護するためにシリカコーティングを続けて、ピナら5によって報告されたプロトコルを用いて行い、凝集を最小限にし、機能化に適した表面を提供する6。シリカコーティング工?...

MNPを用いた細菌検出方法は、抗体の分子認識に基づく、アプタマー、バイオプロテイン、病原性細菌1によってMNPに結合した炭水化物。シレブロフォアは細菌の外膜上の特定の受容体によって認識されることを考慮に入れて、彼らはまた、それらの特異性を増加させるためにMNPにリンクすることができます2.シドロフォアは、細菌3、44によるFe3+取り込み3に関与する小さな有機分子である。サイドロフォアとMNPの間のコンジュゲートの調製と、細菌の捕獲および単離に対する評価はまだ報告されていない。
小分子を用いた磁性ナノ粒子のコンジュゲート合成における重要なステップの1つは、MNPの表面に小分子が結合していることを確認するために結合の種類または相互作用の選択である。このため、磁気ナノ粒子とフェロキサミン(エルシニア・エンゴコリチカが認識するシドロフォア)とのコンジュゲートを調製する手順は、MNPの変更可能な表面の生成に焦点を当て、カルボジイミド化学によってシデロフォアに共有結合することを可能にした。均一なマグネタイトナノ粒子(MNP)を得るために、核形成及びサイズ制御を改善するために、ベンジルアルコールとのソルボ分解反応を、振盪せずに熱ブロック中に運んだ。次いで、水性媒体6におけるナノ粒子懸濁液の保護と安定性を向上させるステーバー法によりシリカコーティングを生成した。フェロキサミンの構造を考慮して、シデロフォアと共役する適切なナノ粒子(MNP@SiO2@NH2)2を生成するためにアミン基の導入が必要である。2これは、ソルゲル法7を用いてシリカ改変ナノ粒子(MNP@SiO2)の表面に存在するアルコール基を用いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(apTES)の凝縮によって達成された。
並行して、フェロキサミン鉄(III)錯体は、水溶液中のアセチルアセトネートの鉄と市販のデフェオキサミンを複合化することによって調製した。N-スクシニルフェロキサミンは、リンカーとして作用するスクシニル基を持ち、コハク酸無水とフェロキサミンの反応により得られた。
MNP@SiO2@NH22とN-succinylferoxamineの間の結合は、MNP@SiO2@NH@Fa@を与えるために、カップリング試薬ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-()を使用してカルボジイミド化学を介して行った( ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(BOP)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を軟質塩基性培地中でN-スクシニルフェロキサミン8中の末端酸基を活性化する。 N2
MPが特徴付けられると、野生型(WC-A)およびフェロキサミン受容体FoxAを欠くY.エンテオコリチカ(FoxA WC-A 12-8)の変異体を捕捉する、裸で機能的な磁気ナノ粒子の能力を評価した。プレーンMP、機能化されたMPおよび共役MNP@SiO2@NH@Faは、各@Y.エンゴコリチカ株と相互作用することを許可した。バクテリア共役凝集体を、磁場の印加により細菌懸濁液から分離した。分離した凝集体をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で2回リンスし、PBSで再懸濁して連続希釈を調製し、次いでコロニー計数用にメッキした。このプロトコルは、MNP@SiO2@NH@Faの合成の各ステップ、全ての中間体および共役体の構造的特徴付け、および中間体に関するコンジュゲートの特異性を評価する容易な方法として細菌捕獲アッセイを示す。9

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate 
			HOBT</td>
			<td>Acros</td>
			<td>300561000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Bipyridyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D216305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltriethoxysilane 99%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>151081000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution 28% NH3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent</td>
			<td>Acros</td>
			<td>209800050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>822259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deferoxamine mesylate salt &#62;92,5% (TLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous, 96%</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) acetylacetonate 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal</td>
			<td>Acros</td>
			<td>459591000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal</td>
			<td>Acros</td>
			<td>326871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal</td>
			<td>Acros</td>
			<td>339421000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex LH-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>LH20100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic anhydride &#62;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>239690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethyl orthosolicate &#62;99,0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of functionalized magnetic nanoparticles, their conjugation with the siderophore feroxamine and its evaluation for bacteria detection

本研究では、磁気ナノ粒子の合成、SiO2によるそのコーティング、2続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、エルシニアエンゴコリチカによって認識される副腎泳動であるデフェオキシアミンとの共役が、コルチニル部分をリンカーとして用いた。
マグネタイト(Fe3O4)の磁性ナノ3粒子(MNP)をソルボ熱法で調製し、ステーバー法を用いてSiO2(MNP@SiO2)で被覆し、続いてAPTESとの官能化を行い、その後にAPTES(MNP@SiO2@NH2)を用いた。2 222次いで、フェロキサミンをカルボジイミドカップリングによりMNP@SiO2@NH2と共役し、MNP@SiO2@NH2@Faを与えた。222コンジュゲートおよび中間体の形態と特性は、粉末X線回折(XRD)、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)、ラマン分光法、X線光電子分光(XPS)、透過電子顕微鏡(TEM)、エネルギー分散X線(EDX)マッピングを含む8つの異なる方法で調べた。この徹底的な特徴付けにより、コンジュゲートの形成が確認された。最後に、ナノ粒子の容量と特異性を評価するために、それらは、エルシニアエンテオコリチカを用いた捕獲細菌アッセイで試験した。

各中間体と最終コンジュゲートの形態と特性を決定するために、徹底的な構造特性化が行われます。この目的のために、技術XRD、FT-IR、ラマン分光法、TGA、TEM、EDXマッピングおよびXPSは、共役体の形成を実証するために使用される。X線光電子分光法(XPS)によって獲得されたナノ粒子の表面における原子の酸化状態は、ナノ粒子とシドロフォアとの間の共有結合の形成を確認するための最も関?...

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Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

この研究は、磁気ナノ粒子の調製のためのプロトコル、SiO2でのコーティング、続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、コクニル部分をリンカーとして使用したデフェキサミンとの結合を説明する。すべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートに対してY.エンゴコリティカを用いた深い構造特性評価の説明および捕獲細菌アッセイも詳細に説明する。

機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

磁気ナノ粒子は、磁気特性が強く、表面の機能化が容易なため、分析科学やナノ医薬品に最適なツールです。ここでは、アミノ機能化シリカ磁性粒子とシドロフォアフェロキサミンとの間のコンジュゲートの最初のインスタンスを、フォトジェニック材料の捕捉評価と共に報告する。シドロフォアは、鉄のパタケ機構において重要な役割を果たす小さな有機分子であり、細菌の特定の外膜受容体によって認識されています。このビデオは、ステップバイステップで、磁気鉄ナノ粒子を調製するための効率的なプロトコルを表示します。次いで、分散液を保護し、磁気核を保護するためにシリカでコーティングしました。得られた反応器表面をアミン基で機能させた。フェロキサミンと共役した磁性ナノ粒子の合成20 mLガラスバイアルに0.5グラムのFe(acac)3を加えます。その後、10mLのベンジルアルコールと混ぜます。この混合物を2分間超音波処理します。その後、加熱ブロックに移し、摂氏180度で72時間加熱します。ナノ粒子を96%エタノールでリンスします。そして30分間遠心分離機。ネオジム磁石を用いて、磁力により上清からナノ粒子を分離する。残留溶媒を捨てる。溶剤が透明に見えるまで、超音波処理と交互に上清を捨てます。80ミリリットルのイソプロパノールで2グラムのMNPの懸濁液を調製し、4ミリリットルの21%アンモニア、7.5ミリリットルの蒸留水、および0.56ミリリットルのTEOSを加える。混合物を摂氏40度で2時間加熱し、連続攪拌します。その後、1時間超音波処理します。MNPを磁石で分離し、上澄み物を捨て、イソプロパノールの30ミリリットルに分散し、アンモニア、蒸留水、およびTEOSを、前述の順序と同じ順序で添加する。連続攪拌で2時間40度の摂氏で混合物を加熱します。その後、1時間超音波処理します。磁気スターバーを取り外して便利に洗い、すべての材料を回収します。上清を捨て、96%エタノールでナノ粒子を3回すすいで、超音波処理と交互に。室温でナノ粒子を真空下で12時間乾燥させます。ジメチルホルムアミドを用いて前工程から得られたMNP@SIO2の500ミリグラムをリンスする。それらを超音波処理し、破棄します。丸底フラスコで粒子を再懸濁し、磁気バーでかき混ぜ、9ミリリットルのAPTESを加えます。60度で12時間かき混ぜます。上清を捨て、96%エタノールでナノ粒子を3回すすいで、超音波処理と交互に。100mgのデフェキサミン、メシル酸塩、53.0ミリグラムの鉄アセチルアセトネートを5ミリリットルの蒸留水に溶解します。混合物を室温で一晩かき混ぜます。得られた生成物を分離漏斗で20ミリリットルの酢酸エチルで3回洗浄する。真空下で有機溶剤を除去します。水相を凍結乾燥させて、フェロキサミンと赤い固体を与えます。50ミリリットルの丸底フラスコで5ミリリットルのピリジンで100mgのフェロキサミンの溶液に350ミリグラムのコハク酸無水物を加える。得られた混合物を室温で16時間かき混ぜる。減圧下で過剰のピリジンを除去する。反応粗物を3ミリリットルのメタノールに溶かします。メタノール溶液をLH-20カラムに移し、0.5 mL/分で溶出します。赤い分画を収集し、真空下でメタノールを除去します。乾燥アミンの30mgをDMFで2回、ナノ粒子を100ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで30分間超音波処理する。200ミリグラムN-スクシニルフェロキサミンの溶液を準備し、 173 ミリグラム ベンゾトリアゾール 1-yl-オキシトリスホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩 BOP, 46 mg 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール HOBt および 128.8 ミリグラム N, N-ジイソプロピレチルアミン DIPEA, DMF 10 mL, 50 ミリリットルラウンドボトムフラスコス.乾燥した酸素のない状態で超音波処理の下で、DMFの3ミリリットルで、以前にすすったMNP@SiO2@NH2を中断します。アルゴン雰囲気を使用してください。加えます, ドロップワイズ, Bを混合 B.シェイク最終混合物, 軌道シェーカーを使用して, 室温で一晩.得られたコンジュゲートを磁石を用いて懸濁液から分離する。Y.エンゴコリチカ株による細菌アッセイは、ナノ粒子を含む病原性細菌の単離および捕獲を定量化する。滅菌チューブ内の1mg /mLですべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートをPBSに調製します。ルリアベルタニ、LB、スープの5 mLでY.entorocoliticaの文化を一晩準備します。鉄欠乏性の5 mLのトリプケース大豆ブロス、TSB、10 mM 2、2-ビピリジル溶液の50マイクロリットルを添加して調製します。Y.エンゴコリチカの一晩培養物の50マイクロリットルで5ミリリットルの鉄欠乏性TSBブロスを接種する。0.5~0.8のOD600に達するまで、攪拌で37度のインキュベート。一晩培養した100マイクロリットルを取り、900マイクロリットルのPBSを含むチューブで希釈し、最初の1/10希釈液を得る。次いで、同じ手順を用いて最初の希釈から1/100希釈を調製し、10で細菌細胞の濃度を得て、ミリリットル当たり6コロニー形成単位の電力を得た。1/100細菌希釈液の1ミリリットルに100マイクロリットルのナノ粒子懸濁液と1mg/mLを加えます。MNP菌凝集体を分離し、磁石を用いて、廃棄し、慎重に、上清を廃棄する。分離したナノ粒子を1ミリPBSで2回、渦を使用してリンスする。前の懸濁液から4つの連続した1/10希釈液を準備し、マイナス4希釈の力に10を供給する。TS寒天プレートに各希釈液の10マイクロリットルをプレート。エピホワイトモードでゲルデジタイザーでプレートを撮影します。画像を処理し、便利なソフトウェアを使用して、個々のコロニーの数をカウントするスポットを増幅する。ナノ粒子とシドロフォアとの共有結合の形成を確認するために、我々は、各ステップで新しい官能基と一致して新しいバンドがどのように出現するかを観察し、合成を監視するためにFT-IRラマン分光法を採用しています。TEMおよびSEM顕微鏡を用いて、形態および粒子サイズを観察した。熱重量分析は、有機材料の添加による重量損失を測定する。そして、XPSは、表面の原子の異なる酸化状態を分析し、共有結合の形成を確認することを可能にします。最後に、最終的なコンジュゲート上のすべての中間体を使用して、細菌を捕捉する能力をテストし、バイオセンサーとしての特性を確立しました。このプロトコルは、マグネタイトナノ粒子の高い生体適合性を利用するように設計されました。シリカによるコーティングは、分散を改善し、水性媒体の劣化から磁気核を保護します。また、カルボディイミド化学によって酸修飾シデロフォアを共有結合するために必要なアミン基と機能化する反応性表面を与える。この場合、N-スクシニルフェロキサミン。コンジュゲート細菌捕獲能力を試験し、その結果、PBS細菌懸濁液に提示されたかさばる効果に関する特定の相互作用のために中間体と有意な差を与えることなく、少数のコロニーが見つかった。

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Amide coupling reactions can be used to synthesize bispyridine-based ligands for use as bridging linkers in multinuclear platinum anticancer drugs. ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

官能化有機金属構造体の合成とキャラクタリゼーション

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

グリコシダーゼ活性の検出のためのインドキシル配糖体の合成

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

周囲条件下での金ナノ粒子の安定オリゴマークラスターのサイズ制御された合成のための簡単​​な方法

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

安定した二環性 Aziridinium イオンと開環の Azaheterocycles の合成のための準備

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

ナノダイアモンドおよびその低減銀ナノ粒子の生体 Polydopamine 表面改質

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

親和性金ナノ粒子の合成と特性化

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...