Name: synthesis of functionalized magnetic nanoparticles, their conjugation with the siderophore feroxamine and its evaluation for bacteria detection
Uploaded: 2020-06-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection at JoVE.com

Los autores agradecen al profesor Klaus Hantke (Universidad de Tubinga, Alemania) por suministrar amablemente las cepas Yersinia enterocolitica utilizadas en esta obra. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones AGL2015-63740-C2-1/2-R y RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) de España, cofinanciada por el Programa FEDER de la Unión Europea. Los trabajos en la Universidad de Santiago de Compostela y la Universidad de A Coruña también contaron con el apoyo de las becas GRC2018/018, GRC2018/039 y ED431E 2018/03 (grupo estratégico CICA-INIBIC) de Xunta de Galicia. Por último, queremos agradecer a Nuria Calvo su gran colaboración haciendo la voz de este protocolo de vídeo.

NOTA: Para las reacciones realizadas en condiciones de atmósfera inerte, toda la cristalería se secó previamente en un horno a 65oC, sellada con un tabique de goma y purgada con argón tres veces.
1. Síntesis de nanopartículas magnéticas conjugadas con feroxamina
<ol><li>Síntesis de nanopartículas magnéticas Fe3O4 (MNP)<ol>
<li>Añadir 0,5 g de Fe(acac)3 en un vial de vidrio de 20 ml y luego mezclar con 10 ml de alcohol bencílico.</li>
		<li>Sonicar...

<ol>
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J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+HMDSO/O2+plasma+deposits+using+a+high-sensitivity+and+-energy+resolution+XPS+instrument:+curve+fitting+of+the+Si+2p+core+level.">A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level.</a> Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).</li><li>Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+bacteriophage+conjugated+magnetic+particles+for+E.+coli+capturing:+Influence+of+bacteriophage+loading,+temperature+and+tryptone.">T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).</li><li>Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+amino-functionalized+magnetic+nanoparticles+for+enhancement+of+bacterial+capture+efficiency.">Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency.</a> RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).</li><li>Zhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+removal+of+pathogenic+bacteria+and+viruses+by+multifunctional+amine-modified+magnetic+nanoparticles.">Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles.</a> Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).</li></ol>

Este protocolo describe la síntesis de un conjugado entre nanopartículas magnéticas y la feroxamina siderofore mediante unión covalente. La síntesis de magnetita se llevó a cabo utilizando el protocolo reportado por Pinna et al.5 seguido de recubrimiento de sílice para proteger el núcleo magnético de la corrosión en sistemas acuosos, minimizar la agregación y proporcionar una superficie adecuada para la funcionalización6. Se modificó el proceso de recubrimiento...

Los métodos de detección de bacterias que utilizan MNP se basan en el reconocimiento molecular de anticuerpos, aptámeros, bioproteínas, carbohidratos conjugados con MNP por la bacteria patógena1. Teniendo en cuenta que los sideróforos son reconocidos por receptores específicos en la membrana externa de las bacterias, también podrían vincularse a MNP para aumentar su especificidad2. Los sideróforos son pequeñas moléculas orgánicas implicadas en la absorción De Fe3+ por bacterias3,,4. Todavía no se ha notificado la preparación de conjugados entre los sideróforos y MNP junto con su evaluación para la captura y aislamiento de bacterias.
Uno de los pasos cruciales en la síntesis de conjugados de nanopartículas magnéticas con moléculas pequeñas es la selección del tipo de enlace o interacción entre ellas para asegurar que la molécula pequeña esté unida a la superficie del MNP. Por esta razón, el procedimiento para preparar el conjugado entre nanopartículas magnéticas y feroxamina —el sideróforo reconocido por Yersinia enterocolitica—se centró en la generación de una superficie modificable del MNP para permitir vincularlo covalentemente al sideróforo por la química del carbodia. Con el fin de obtener una nanopartículas de magnetita uniforme (MNP) y para mejorar la nucleación y el control de tamaño, se llevó una reacción de solvolisis con alcohol bencílico en un bloque térmico sin sacudir5. A continuación, se generó un recubrimiento de sílice por el método St-ber para conferir protección y mejorar la estabilidad de la suspensión de nanopartículas en medios acuosos6. Teniendo en cuenta la estructura de la feroxamina, la introducción de grupos de aminas es necesaria para producir nanopartículas adecuadas (MNP@SiO2@NH2)que se conjugan con el sideroforo. Esto se logró mediante la condensación de (3-aminopropil)triexisilano (APTES) con los grupos de alcohol presentes en la superficie de las nanopartículas modificadas de sílice (MNP@SiO2) utilizando un método sol-gel7.
Paralelamente, el complejo de hierro de feroxamina(III) se preparó mediante la complejidad de la deferoxamina disponible comercialmente con acetil acetil de hierro en solución acuosa. N-succinilferoxamina, que lleva grupos sucintos que actuarán como enlaces, se obtuvo por la reacción de la feroxamina con anhídrido succínico.
La conjugación entre MNP@SiO2@NH2 y N-succinilferoxamina para dar MNP@SiO2@NHFase llevó a cabo a través de la química de carbodiimida utilizando como reactivos de acoplamiento benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP) y 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) en un medio básico suave para activar el grupo de ácido terminal en N-succinylferoxamine8.
Una vez que los MNP se caracterizaron, evaluamos las capacidades de las nanopartículas magnéticas desnudas y funcionalizadas para capturar el tipo salvaje (WC-A) y un mutante de Y. enterocolitica carente de receptor de feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Los MNP simples, los MNP funcionalizados y el MNP@SiO conjugado2@NHFase les permitió interactuar con cada cepa de Y. enterocolitica. Los agregados bacteria-conjugados fueron separados de la suspensión bacteriana por la aplicación de un campo magnético. Los agregados separados se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS), re-suspendido en PBS para preparar diluciones en serie y luego, fueron chapados para el conteo de colonias. Este protocolo demuestra cada paso de la síntesis de MNP@SiO2@NH@Fa, la caracterización estructural de todos los intermedios y el conjugado, y un ensayo de captura de bacterias como una manera fácil de evaluar la especificidad del conjugado en relación con los intermedios. 9

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate 
			HOBT</td>
			<td>Acros</td>
			<td>300561000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#8242;-Bipyridyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D216305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltriethoxysilane 99%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>151081000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution 28% NH3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent</td>
			<td>Acros</td>
			<td>209800050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>822259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deferoxamine mesylate salt &#62;92,5% (TLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous, 96%</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>131085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) acetylacetonate 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal</td>
			<td>Acros</td>
			<td>459591000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal</td>
			<td>Acros</td>
			<td>326871000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal</td>
			<td>Acros</td>
			<td>339421000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex LH-20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>LH20100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic anhydride &#62;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>239690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethyl orthosolicate &#62;99,0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of functionalized magnetic nanoparticles, their conjugation with the siderophore feroxamine and its evaluation for bacteria detection

En el presente trabajo, se describe la síntesis de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO2,seguido de su funcionalización de aminas con (3-aminopropil)triexisilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina, un sideroforo reconocido por Yersinia enterocolitica,utilizando una moieteidad sucinil como enlacedor.
Las nanopartículas magnéticas (MNP) de magnetita (Fe3O4) se prepararon mediante método solvotermal y se recubrieron con SiO2 (MNP@SiO2) mediante el proceso de Stéber seguido de la funcionalización con APTES (MNP@SiO2@NH2). Luego, la feroxamina se conjugaba con el MNP@SiO2@NH2 por acoplamiento de carbodímida para dar MNP@SiO2@NH2@Fa. La morfología y las propiedades del conjugado y los intermedios fueron examinadas por ocho métodos diferentes, incluyendo la difracción de rayos X en polvo (RDX), la espectroscopia infrarroja de transformación de Fourier (FT-IR), la espectroscopia de Raman, la espectroscopia de fotoelectrón de rayos X (XPS), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el mapeo de rayos X dispersivos de energía (EDX). Esta caracterización exhaustiva confirmó la formación del conjugado. Finalmente, con el fin de evaluar la capacidad y especificidad de las nanopartículas, se probaron en un ensayo de bacterias de captura utilizando Yersinia enterocolitica.

Se lleva a cabo una caracterización estructural exhaustiva para determinar la morfología y las propiedades de cada conjugado intermedio y final. Para ello, se utilizan las técnicas XRD, FT-IR, Espectroscopia Raman, TGA, TEM, mapeo EDX y XPS para demostrar la formación del conjugado. Los estados de oxidación de los átomos en la superficie de las nanopartículas adquiridas por espectroscopia de fotoelectrón de rayos X (XPS) son los datos más relevantes para confirmar la formación de enlaces covalentes entre la nan...

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Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

Este trabajo describe protocolos para la preparación de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO2,seguido de su funcionalización de amina con (3-aminopropil)trietilsilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina utilizando una moiedad sucinil como enlace. También se describe en detalle una descripción estructural profunda y un ensayo de bacterias de captura utilizando Y. enterocolitica para todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final.

Síntesis de nanopartículas magnéticas funcionalizadas, su conjugación con el Siderophore Feroxamine y su Evaluación para la Detección de Bacterias

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Las nanopartículas magnéticas son herramientas ideales para la ciencia analítica y la nano medicinea debido a sus fuertes propiedades magnéticas y la fácil funcionalización de su superficie. Aquí informamos de la primera instancia de un conjugado entre las partículas magnéticas de sílice funcionalizadas amino y la feroxamina siderofore junto con la evaluación para la captura de material fotogénico. Los sideróforos son moléculas pequeñas y orgánicas que desempeñan un papel clave en el mecanismo de participación de hierro, y son reconocidas por receptores específicos de membrana externa de bacterias.Este vídeo muestra, paso a paso, un protocolo eficiente para preparar nanopartículas magnéticas de hierro. Luego, fueron recubiertos con sílice para proteger la dispersión y proteger el núcleo magnético. La superficie resultante del reactor fue funcionalizada con grupos de aminas.Síntesis de nanopartículas magnéticas conjugadas con feroxamina. Añadir 0,5 gramos de Fe(acac)3 en un vial de vidrio de 20 ml. Luego, mezcle con 10 ml de alcohol bencílico.Sonicar esta mezcla durante 2 minutos. A continuación, transfiera a un bloque de calefacción y caliente a 180 grados Centigrados durante 72 horas. Enjuague las nanopartículas con 96%etanol.Y centrifugar durante 30 minutos. Separe las nanopartículas del sobrenadante por atracción magnética, utilizando un imán de neodimio. Deseche el disolvente residual.Deseche el sobrenadante, alternando con la sonicación, hasta que el disolvente se vea claro. Preparar una suspensión de 2 gramos de MNP en 80 mililitros de isopropanol, añadir 4 mililitros de 21%amoníaco, 7,5 mililitros de agua destilada y 0,56 mililitros de TEOS. Calentar la mezcla a 40 grados Centigrados durante 2 horas, con agitación continua.Luego, sonicar durante 1 hora. Separe el MNP con un imán, deseche el sobrenadante, disperse en 30 mililitros de isopropanol, agregue amoníaco, agua destilada y TEOS, en el mismo orden descrito anteriormente. Calentar la mezcla a 40 grados Centigrados durante dos horas con agitación continua.Luego, sonicar durante una hora. Retire y lave convenientemente la barra de agitación magnética, para recuperar todo el material. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96%etanol tres veces, alternando con sonicación.Seque las nanopartículas al vacío a temperatura ambiente durante 12 horas. Enjuagar 500 miligramos del MNP@SIO2 obtenidos del paso anterior con dimetilformamida. Sonicarlos y descartarlos.Vuelva a suspender las partículas en un matraz de fondo redondo, revuelva con una barra magnética y añada 9 mililitros de APTES. Revuelva la mezcla a 60 grados Centígrados durante 12 horas. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96%etanol tres veces, alternando con sonicación.Disolver 100 mg de deferoxamina, sal de mesilato y 53,0 miligramos de acetiladacetonato de hierro en 5 mililitros de agua destilada. Revuelva la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Lave el producto resultante tres veces con 20 mililitros de acetato de etilo en un embudo de separación.Retire el disolvente orgánico al vacío. Seque la fase acuosa para permitir la feroxamina y un sólido rojo. Añadir 350 miligramos de anhídrido succínico a una solución de 100 mg de feroxamina en 5 mililitros de piridina en un matraz de fondo redondo de 50 mililitros.Revuelva la mezcla resultante, a temperatura ambiente, durante 16 horas. Retire el exceso de piridina bajo presión reducida. Disolver el crudo de reacción en 3 mililitros de metanol.Transfiera la solución metanólica a una columna LH-20 y elula a 0,5 ml/minuto. Recoger la fracción roja y retirar el metanol bajo vacío. Enjuague 30 mg de nanopartículas funcionalizadas de amina seca dos veces con DMF y sonice las nanopartículas en un matraz Erlenmeyer de 100 mililitros durante 30 minutos.Preparar una solución de 200 miligramos de N-succinilferoxamina, 173 miligramos de Benzotriazol 1-yl-oxy-tris-phosphonium hexafluorophosphate BOP, 46 mg 1-hydroxybenzotriazol HOBt y 128,8 miligramos N, N-diisopropylethylamine DIPEA, en 10 ml de DMF, en un matraz de fondo redondo de 50 mililitros. Suspenda el MNP@SiO2@NH2 previamente enjuagado en un 3 mililitros de DMF, bajo sonicación en condiciones secas y libres de oxígeno. Usa la atmósfera de argón.Añadir, gota a gota, mezclar A para mezclar B.Shake la mezcla final, usando un agitador orbital, a temperatura ambiente durante la noche. Separe el conjugado resultante de la suspensión utilizando un imán. Ensayo bacteriano con cepas de Y.enterocolitica para cuantificar el aislamiento y la captura de bacterias patógenas con nanopartículas.Preparar una suspensión de todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final en PBS a 1 mg/ml en tubos estériles. Preparar una cultura de Y.entorocolitica en 5 ml de Luria Bertani, LB, caldo durante la noche. Preparar un caldo de soja de tripa de 5 ml de hierro deficiente, TSB, mediante la adición de 50 microlitros de 10 mM 2, 2-bipirutilo solución.Inocular el 5 mililitro de caldo TSB deficiente de hierro con 50 microlitros del cultivo nocturno de Y.enterocolitica. Incubar a 37 grados Centígrados con agitación hasta que se alcance una OD600 de 0.5 a 0.8. Tomar unas 100 microlitros del cultivo nocturno y diluirlo en un tubo que contenga 900 microlitros de PBS para obtener la primera dilución 1/10.Luego, preparar una dilución 1/100 de la primera dilución usando el mismo procedimiento para obtener una concentración de células bacterianas a 10 a la potencia de 6 Unidades Formadoras de Colonias por mililitro aproximadamente. Añadir 100 microlitros de suspensión de nanopartículas y 1 mg/ml a 1 mililitro de dilución de bacterias 1/100. Separe los agregados de la bacteria MNP, utilizando un imán, deseche, cuidadosamente, el sobrenadante.Enjuague las nanopartículas separadas dos veces con PBS de 1 milímetro utilizando un vórtice. Preparar cuatro diluciones sucesivas 1/10 desde la suspensión anterior, hasta un 10 a la potencia de menos 4 dilución. Placa 10 microlitros de cada dilución en placas de agar TS.Fotografía la placa con un digitalizador de gel en modo epi blanco. Procesar la imagen, utilizando el software conveniente, para amplificar un lugar para contar el número de colonias individuales. Para confirmar la formación del vínculo covalente entre las nanopartículas y el sideróforo, empleamos espectroscopia FT-IR Raman para monitorear la síntesis, observando cómo las nuevas bandas aparecen de acuerdo con un nuevo grupo funcional en cada paso.La microscopía TEM y SEM se utilizaron para observar la morfología y el tamaño de las partículas. Análisis termogravimétrico para medir la pérdida de peso debido a la adición de material orgánico. Y XPS nos permite analizar los diferentes estados de oxidación de los átomos en la superficie y confirmar la formación de enlaces covalentes.Finalmente, utilizamos todos los intermedios en el conjugado final para probar su capacidad de capturar bacterias, con el fin de establecer sus propiedades como biosensor. Este protocolo fue diseñado para aprovechar la alta biocompatibilidad de las nanopartículas de magnetita. El recubrimiento con sílice mejora la dispersión y protege el núcleo magnético de la degradación en medios acuosos.Y también dar una superficie reactiva para funcionalizar con grupos de aminas que son necesarios para unir covalentemente un ácido modificado sideróforo por la química de carbodiamida. En este caso, N-succynilferoxamine. La capacidad de captura de bacterias conjugadas fue probada y como resultado, se encontró un bajo número de colonias, sin diferencia significativa con los intermedios debido a una interacción específica sobre los efectos voluminosos presentados en la suspensión bacteriana PBS.

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Amida de reacción para la Síntesis de ligandos basados ​​en bispiridina y su complejación a Platinum como dinucleares Agentes anticancerígenos

Amide coupling reactions can be used to synthesize bispyridine-based ligands for use as bridging linkers in multinuclear platinum anticancer drugs. ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Marcos de síntesis y caracterización de funcionalizado metal-orgánico

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Síntesis de indoxil-glucósidos para la detección de glucosidasa Actividades

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Un método simple para la síntesis controlada de tamaño estables Clusters oligómeros de nanopartículas de oro bajo condiciones ambientales

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Preparación de iones Aziridinium bicíclica estable y su apertura para la síntesis de Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Modificación de superficie bio-inspirado de la Polydopamine de nano-diamantes y su reducción de nanopartículas de plata

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Copolímeros de bloque sin capacidad de ejecución funcionalización de metionina para la entrega de ADN de plásmido dirigido

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro anfifílicas

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...