نحن ممتنون للمساهمات المالية في تطوير خط الشعاع من قبل CEMHTI (أورليانز ، فرنسا ، ANR-13-BS08-0012-01) و Labex OSUG@2020 (غرونوبل ، فرنسا ، ANR-10-LABX-0056). يتم دعم مشروع FAME-UHD ماليا من قبل EquipEx الفرنسية "Grand emprunt" (EcoX ، ANR-10-EQPX-27-01) ، واتحاد CEA-CNRS CRG ومعهد INSU CNRS. نحن ممتنون لجميع المساهمات خلال التجارب وخاصة جميع الأشخاص الذين يعملون على BM30B و BM16. يعترف المؤلفون بأن المرفق الأوروبي للإشعاع السنكروتروني يوفر وقت شعاع إشعاع السنكروترون. كما نعترف بمشروع PHYTOMET ANR للدعم المالي (ANR-16-CE01-0008) ومشروع SEDMAC للدعم المالي (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

1. إعداد الكريات البشرية PC-3 و OVCAR-3 الخلايا السرطانية لانتواع السيلينيوم
ملاحظة: البروتوكول التالي مقتبس من Weekley et al.10. يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء استزراع الخلايا بموجب شروط وقيود السلامة الأحيائية من المستوى 2 ، باستخدام تقنيات التعقيم.
<ol><li>عد الخلايا باست...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة الشكل الكيميائي للسيلينيوم والحديد في العينات البيولوجية عن طريق التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية. وهو يركز على إعداد وتخزين العينات البيولوجية والمركبات المرجعية بالتبريد ، وكذلك على قياسات HERFD-XAS.
إعداد التبريد وتخزينه ي...

تتطلب دراسة التحولات الحيوية الخلوية للعناصر الأساسية أو السامة تقنيات انتواع ذات حساسية عالية ويجب أن تقلل إلى أدنى حد من خطوات إعداد العينات التي غالبا ما تكون عرضة لتعديل الأنواع الكيميائية.
من المعروف أن العناصر الفسيولوجية مثل السيلينيوم والحديد يصعب تحديدها بشكل خاص بسبب كيمياءها المعقدة ، والثبات المختلفة لأنواع السيلينيوم أو الحديد ، وتركيزها المنخفض في نطاق جزء في المليون (مغ / كغ) أو حتى دون جزء في المليون. وبالتالي ، فإن دراسة انتواع هذه العناصر بواسطة XAS يمكن أن تكون صعبة للغاية. السنكروترون XAS وخاصة التألق عالي الدقة للطاقة المكتشف XAS (HERFD-XAS) ، والذي يسمح بنسبة إشارة إلى خلفية منخفضة للغاية1 ، متوفرة في مصادر السنكروترون لتحديد العناصر المخففة للغاية في المصفوفات البيولوجية المعقدة 2,3. يمكن إجراء قياسات التألق XAS التقليدية باستخدام كاشف الحالة الصلبة المحلولة للطاقة (SSD) مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 150-250 eV ، على خط شعاع CRG-FAME في المرفق الأوروبي لإشعاع السنكروترون (ESRF)4 ، في حين تحتاج قياسات HERFD-XAS إلى مطياف محلل البلورات (CAS) ، مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 1-3 eV ، على خط شعاع CRG-FAME-UHD في ESRF2 . يتم تمييز الفوتونات الفلورية فيما يتعلق بطاقتها مع العمليات الإلكترونية أو البصرية على التوالي.
يعد تحضير العينة بالتبريد ضروريا للحفاظ على الهياكل والحفاظ على السلامة الكيميائية التركيبية ، مما يسمح بالتحليل بالقرب من الحالة البيولوجية الأصلية5. وعلاوة على ذلك، فإن التحليلات التي تجرى في درجات حرارة مبردة تصل إلى 10 كلفن باستخدام التبريد المبرد بالهيليوم السائل (LN2)، تسمح للضرر الإشعاعي بالتباطؤ وتحافظ على الانتواع الأولي ل XAS. على الرغم من أن بعض المراجعات حول تقنيات XAS المطبقة على العينات البيولوجية تفيد بضرورة إعداد وتحليل العينات في الظروف المبردة (على سبيل المثال ، Sarret et al.6 و Porcaro et al.7) ، إلا أن أيا منها لا يصف بوضوح البروتوكول التفصيلي ذي الصلة. في هذا المنشور ، يتم وصف طريقة للتحضير المبرد للخلايا السرطانية والكائنات الحية الدقيقة للعوالق لانتواع HERFD-XAS ل Se8 و Fe9 في درجة حرارة مبردة.
تتطلب الممارسة الجيدة لإعداد العينات والبيئة أثناء قياسات التحليل الطيفي XAS الحديثة 1) إعدادا ؛ 2) إجراء تحليل يحد من آثار الضرر الإشعاعي قدر الإمكان ؛ و 3) عينة (أو مرجع مركب نموذجي) متجانسة قدر الإمكان فيما يتعلق بحجم شعاع فوتونات الأشعة السينية. يؤخذ العنصر الأول في الاعتبار عن طريق إجراء عملية الاستحواذ عند درجة حرارة منخفضة ، باستخدام كريوستات الهيليوم السائل. يتم التعامل مع البند الثاني من خلال تنفيذ كل عملية اقتناء على مساحة جديدة من العينة عن طريق تحريكها فيما يتعلق بالشعاع. وأخيرا، وبالنظر إلى الشرط الثالث، فإن العينات (الكريات) والمراجع (المساحيق) مشروطة في كريات سائبة مضغوطة من أجل الحد من المساميات وعدم التجانس قدر الإمكان، وتجنب الخشونة فيما يتعلق بحجم الحزمة على سطح العينة الذي تم فحصه بالأشعة السينية. نوضح كيف يتعامل البروتوكول مع كل هذه النقاط.
استخدمنا خط خلايا البروستاتا البشرية PC-3 (إمكانات نقيلي عالية) وخط خلية المبيض OVCAR-3 (الذي يمثل ما يصل إلى 70٪ من جميع حالات سرطان المبيض) للتحقيق في الخصائص المضادة للتكاثر تجاه الخلايا السرطانية لجسيمات السيلينيوم النانوية (Se-NPs) ، و Phaeodactylum tricornutum diatom كنوع نموذجي للتحقيق في عزل الحديد في العوالق النباتية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

إن دراسة العناصر ذات التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية (XAS) ذات أهمية خاصة عند دراسة دور المعادن في النظم البيولوجية. يعد تحضير العينات إجراء رئيسيا وغالبا ما يكون معقدا ، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية. وعلى الرغم من أن تقنيات انتواع الأشعة السينية تستخدم على نطاق واسع، لم يتم بعد نشر أي بروتوكول مفصل لمستخدمي هذه التقنية. علاوة على ذلك ، فإن تعديل الحالة الكيميائية أمر مثير للقلق ، ويوصى بالتقنيات القائمة على التبريد لتحليل العينات البيولوجية في حالتها المائية شبه الأصلية لتوفير أقصى قدر من الحفاظ على السلامة الكيميائية للخلايا أو الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكول إعداد خلوي يعتمد على العينات المحفوظة بالتبريد. ويتضح ذلك في التألق عالي الدقة للطاقة الذي تم الكشف عنه دراسة طيفية لامتصاص الأشعة السينية للسيلينيوم في الخلايا السرطانية ودراسة للحديد في العوالق النباتية. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع عينات بيولوجية أخرى وتقنيات الأشعة السينية الأخرى التي يمكن أن تتضرر من التشعيع.

كانت الأهداف الرئيسية لهذه المستحضرات هي التحقيق في التفاعل بين جسيمات السيلينيوم النانوية (Se-NPs) والخلايا السرطانية ، وربط الحديد وعزله في العوالق النباتية.
أطياف HERFD-XANES من السيلينيوم في الحالة الأولية (BSA Se-NPs) وفي الخلايا المحتضنة في وسط غذائي (BSA Se-NPs بعد حضانة 24 ساعة) موضحة...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

يقدم هذا البروتوكول إجراء مفصلا لإعداد عينات التبريد البيولوجية لتجارب التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية القائمة على السنكروترون. نحن نصف جميع الخطوات المطلوبة لتحسين إعداد العينات والحفظ بالتبريد مع أمثلة على البروتوكول مع خلايا السرطان والعوالق النباتية. توفر هذه الطريقة معيارا عالميا لإعداد العينات بالتبريد.

تحضير العينات البيولوجية للانتواع في درجة حرارة التبريد باستخدام التحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

تم توحيد هذا البروتوكول للعينات الخلوية ، مما يسمح بمقارنة التجارب التي تعمل في مواقع السنكروترون المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي سير عمل بسيط ومباشر يسمح بالحفاظ السريع والموثوق به على التكامل الكيميائي للعينة. قد يكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية مع تكوير الخلايا المتكررة المجمدة والتحميل السريع للحبيبات الخلوية في ترتيب العينة المبردة.يعد فك الارتباط الدقيق والسريع للعينات في درجة الحرارة المبردة أمرا بالغ الأهمية. على هذا النحو ، يعد العرض المرئي ضروريا لفهم كيفية أداء التقنية. لإعداد الكريات الخلوية لخط خلايا البروستاتا البشرية وسرطان المبيض لانتواع السيلينيوم ، قم بزرع العدد المناسب من الخلايا من كل خط خلية في ثلاث قوارير T-75 لكل حالة في وسط زراعة الخلايا المناسب في غطاء تدفق صفائحي ووضع القوارير في 37 درجة مئوية و 5٪ حاضنة زراعة خلايا ثاني أكسيد الكربون حتى تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪.لتعريض الخلايا السرطانية لعلاج السيلينيوم, أول سونيكات محضر طازج حلول مخزون الجسيمات النانوية في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تخفيف متسلسل محلول الجسيمات النانوية السيلينيوم في وسط زراعة الخلايا الكامل إلى تركيزات العمل المناسبة. في غطاء التدفق الرقائقي ، اغسل الخلايا بلطف مرتين بخمسة ملليلترات من 37 درجة مئوية PBS لكل غسل واستخدم ماصة معقمة 25 ملليلتر لإضافة 15 ملليلتر بعناية من معالجة السيلينيوم ذات الأهمية إلى أسفل القارورة. أغلق الأغطية دون إغلاق القارورة تماما وضع القوارير أفقيا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة.لتحضير كريات الخلايا بعد غسل وتجديد وسط الزرع، استخدم مكشطة خلية واحدة لكل قارورة لفصل الخلايا بلطف. استخدم الوسط لطرد أي خلايا عالقة بالقارورة في السوبرناتانت وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. اغسل الكريات مرتين في خمسة ملليلترات من PBS لكل أنبوب لكل غسل لإزالة جميع الآثار المتبقية من العلاج وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من PBS.انقل الخلايا إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 ملليلتر وجمع الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي آخر. ثم استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإزالة كل المادة الفائقة بلطف وإغراق الجزء السفلي من كل أنبوب سعة 1.5 ملليلتر في النيتروجين السائل إلى مستوى حبيبة الخلية. مباشرة بعد التجميد ، انقل الأنابيب إلى ديوار النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.بالنسبة للتحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية ، قم بتحسين جميع البلورات من مطياف محلل البلورات في ظروف براغ فيما يتعلق بطاقة خط التألق ذات الأهمية واستخدم مرجعا يعرف عنه موقع الطاقة لحافة الامتصاص بمعايرة طاقة الحزمة أحادية اللون الحادثة. انقل حامل العينة إلى كريوستات الهيليوم السائل للحصول على عينات بيولوجية واضبط الكريستات على 10 درجات كلفن، ثم أغلق الخزانة التجريبية باتباع قواعد سلامة السنكروترون، وابدأ التحليل. هنا ، تظهر أطياف التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية عالية الدقة للسيلينيوم في الحالة الأولية وفي الخلايا المحتضنة إلى وسط غذائي أن السيلينيوم في جسيمات السيلينيوم النانوية الأولية كانت موجودة كأشكال صفر السيلينيوم وأشكال تشبه السيلوليت.بعد التفاعلات مع خلايا PC3 ، ومع ذلك ، كان السيلينيوم موجودا بشكل رئيسي في الخلايا كصفر السيلينيوم ، مما يدل على تغيير أنواع السيلينيوم داخل الخلايا. بالنسبة للحديد، تظهر الأطياف المرجعية للتحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية مواقع حافة متميزة اعتمادا على حالة أكسدة الحديد، مع تحول الأنواع المخفضة من الحديد إلى قيم طاقة منخفضة. كان هناك طيفان متتاليان تم جمعهما على نفس موضع حبيبة الدياتوم متشابهان ، مما يشير إلى أن تلف الحزمة كان محدودا بين عمليتي اكتساب عند استخدام كريوستات الهيليوم عند 10 كلفن.وعلاوة على ذلك، كانت الأطياف من مواقع مختلفة من حبيبات الدياتوم متطابقة، مما يدل على أن حبيبة العينة متجانسة وأنه يمكن حساب متوسط الأطياف للحصول على طيف أفضل لنسبة الإشارة إلى الضوضاء. الخطوات الأكثر أهمية هي إعداد تمدد الجسيمات النانوية ، والتكوير في درجة حرارة التبريد ، وإعداد العينات المرجعية القياسية. ويمكن تطبيق هذا الإجراء على تقنيات تحليلية سائبة أخرى، مثل برنامج المقارنات الدولية - MS أو HCPLC-ICP-MS أو غيرها من التقنيات الطيفية غير السنكروترونية التي يمكن تنفيذها في شكل في درجة حرارة مبردة.يمكن استكشاف أسئلة علمية أخرى باستخدام هذا الإجراء ، خاصة في مجالات الجيولوجيا الحيوية ، والكيمياء الحيوية ، والعلوم البيئية أو أبحاث السموم. يمكن أن تكون مركبات السيلينيوم وجسيمات السيلينيوم النانوية شاقة لصحتك ويجب التلاعب بها في غطاء كيميائي مخصص باستخدام القفازات والنظارات وقناع الوجه.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

الايض غير مستهدفة من مصادر بيولوجية عن طريق Ultraperformance اللوني السائل عالية الدقة الطيف الكتلي (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

إعداد Nanosheets الكربون في درجة حرارة الغرفة

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

سريع سرعة عالية الإنتاجية الأنواع النباتية تحديد المواد عن طريق تحليل المباشر في الوقت الحقيقي عالية الدقة قياس الطيف الكتلي

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

التحديد الكمي للبيانات Fluorescence الأشعة السينية باستخدام خرائط

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

التأمل الداخلي الإجمالي الامتصاص الطيفي (تيرس) للكشف عن ومذاوبة الإلكترونات في واجهة سائل البلازما

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

رقائق موائع جزيئية لنثر الخفيفة الديناميكية في الموقع حيود الأشعة السينية كريستال و في الموقع لعلم البلورات المسلسل

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

امتصاص المعادن الأساسية في البكتيريا سلبية الغرام: الأشعة السينية الأسفار، النظائر المشعة، والخلية تجزئة

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

الكشف عن عنصري المراعية لمادة الكيمياء في البطاريات عن طريق التحليل الطيفي امتصاص الأشعة السينية اللينة، وتبعثر الأشعة السينية غير مرن رنانة

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...