Vi er taknemmelige for økonomiske bidrag til beamline-udviklingen fra CEMHTI (Orleans, Frankrig, ANR-13-BS08-0012-01) og Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrig, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-projektet støttes finansielt af det franske "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet og INSU CNRS-instituttet. Vi er taknemmelige for alle bidragene under forsøgene, især alle de personer, der arbejder med BM30B og BM16. Forfatterne anerkender den europæiske synkrotronstrålingsfacilitet til levering af synkrotronstrålingsstråletid. Vi anerkender også PHYTOMET ANR-projektet for finansiel støtte (ANR-16-CE01-0008) og SEDMAC-projektet for finansiel støtte (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

1. Fremstilling af humane PC-3 og OVCAR-3 kræftcellepiller til selenspeciering
BEMÆRK: Følgende protokol er tilpasset fra Weekley et al.10. Alle trin skal udføres under en cellekulturhætte under biosikkerhedsniveau 2-betingelser og -begrænsninger ved hjælp af aseptiske teknikker.
<ol><li>Tæl cellerne ved hjælp af et Malassez-celletællingskammer. Frø 150.000-200.000 celler pr. kolbe til PC-3-cellelinjen og 300.000 celler til OVCAR-3-cellelinjen.</li>
	<li>Fr...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Denne protokol blev brugt til at studere den kemiske form af selen og jern i biologiske prøver ved røntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserer på kryo-forberedelse og opbevaring af biologiske prøver og referenceforbindelser samt på HERFD-XAS-målingerne.
Cryo-forberedelse og opbevaring Kryopræparatet af de biologiske prøvepiller i bulk gør det muligt at bevare den kemiske integritet af de arter, der er til stede i prøverne. Dette er afgørende, fordi der er obser...

Undersøgelsen af de cellulære biotransformationer af essentielle eller toksiske elementer kræver specieringsteknikker med høj følsomhed og bør minimere prøveforberedelsestrin, der ofte er tilbøjelige til modifikation af kemiske arter.
Fysiologiske elementer som selen og jern er kendt for at være særligt vanskelige at specificere på grund af deres komplekse kemi, forskellige stabiliteter af selen- eller jernarterne og deres lave koncentration i ppm (mg / kg) eller endda sub-ppm-området. Således kan undersøgelsen af specieringen af disse elementer af XAS være ekstremt udfordrende. Synkrotron XAS og især fluorescens med høj energiopløsning detekteret XAS (HERFD-XAS), som tillader et meget lavt signal-til-baggrund-forhold1, er tilgængelige ved synkrotronkilder for at specificere stærkt fortyndede elementer i komplekse biologiske matricer 2,3. Konventionelle fluorescens-XAS-målinger kan udføres ved hjælp af en energiopløst solid state-detektor (SSD) med en energibåndbredde ~ 150-250 eV på CRG-FAME-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, mens HERFD-XAS-målinger har brug for et krystalanalysatorspektrometer (CAS) med en energibåndbredde ~ 1-3 eV på CRG-FAME-UHD-strålelinjen ved ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineres med hensyn til deres energi med henholdsvis elektroniske eller optiske processer.
Prøve-kryo-præparatet er afgørende for at bevare strukturer og opretholde sammensætningsmæssig kemisk integritet, hvilket muliggør analyse tæt på den biologiske oprindelige tilstand5. Desuden tillader analyser udført ved kryogene temperaturer så lave som 10 K ved hjælp af flydende heliumkrogen køling (LN2), strålingsskader at bremse og bevare elementær speciering for XAS. Selvom nogle anmeldelser af XAS-teknikker anvendt på biologiske prøver rapporterer nødvendigheden af at forberede og analysere prøver under kryogene forhold (f.eks. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen af dem klart den relaterede detaljerede protokol. I denne publikation beskrives en metode til kryopræparation af kræftceller og planktonmikroorganismer for HERFD-XAS-speciering af Se8 og Fe9 ved kryogen temperatur.
God praksis for prøveforberedelse og miljø under state-of-the-art XAS-spektroskopimålinger kræver 1) en opsætning; 2) en analyseprocedure, der begrænser virkningerne af strålingsskader så meget som muligt og 3) en prøve (eller model sammensat reference) så homogen som muligt med hensyn til røntgenfotonernes strålestørrelse. Det første element tages i betragtning ved at udføre erhvervelsen ved en lav temperatur ved anvendelse af en flydende heliumkryostat. Det andet punkt behandles ved at udføre hver erhvervelse på et nyt område af prøven ved at flytte det i forhold til strålen. Endelig, i betragtning af den tredje betingelse, konditioneres prøver (pellets) og referencer (pulvere) i pressede bulkpellets for at begrænse porøsiteter og inhomogeniteter så meget som muligt og for at undgå ruhed med hensyn til strålestørrelsen på den røntgenpronderede prøveoverflade. Vi forklarer, hvordan protokollen behandler alle disse punkter.
Vi brugte human prostatacellelinje PC-3 (højt metastatisk potentiale) og ovariecellelinje OVCAR-3 (som tegner sig for op til 70% af alle tilfælde af kræft i æggestokkene) til at undersøge de antiproliferative egenskaber over for kræftceller i selennanopartikler (Se-NP'er) og Phaeodactylum tricornutum diatom som en modelart til at undersøge jernbinding i fytoplankton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

Undersøgelsen af elementer med røntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) er af særlig interesse, når man studerer metallernes rolle i biologiske systemer. Prøveforberedelse er en vigtig og ofte kompleks procedure, især for biologiske prøver. Selvom røntgenspecieringsteknikker er meget udbredt, er der endnu ikke udbredt nogen detaljeret protokol for brugere af teknikken. Endvidere er kemisk tilstandsmodifikation bekymrende, og kryobaserede teknikker anbefales til at analysere de biologiske prøver i deres næsten indfødte hydrerede tilstand for at give den maksimale bevarelse af cellernes eller vævets kemiske integritet. Her foreslår vi en cellulær forberedelsesprotokol baseret på kryo-konserverede prøver. Det er påvist i en højenergiopløsning fluorescens detekteret røntgenabsorptionsspektroskopi undersøgelse af selen i kræftceller og en undersøgelse af jern i fytoplankton. Denne protokol kan bruges sammen med andre biologiske prøver og andre røntgenteknikker, der kan blive beskadiget af bestråling.

Hovedformålene med disse præparater var at undersøge interaktionen mellem selennanopartikler (Se-NP'er) og kræftceller og jernbinding og sekvestrering i fytoplankton.
HERFD-XANES-spektre af selen i indledende tilstand (BSA Se-NPs) og i celler inkuberet i næringsmedium (BSA Se-NPs efter 24 timers inkubation) er vist i figur 10. Resultaterne viste, at selen i de indledende Se-NP'er var til stede som både Se(0) og selenitlignende former, mens selen i...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Denne protokol præsenterer en detaljeret procedure til fremstilling af biologiske kryoprøveudler til synkrotronbaserede røntgenabsorptionsspektroskopieksperimenter. Vi beskriver alle de trin, der kræves for at optimere prøveforberedelse og kryopræservering med eksempler på protokollen med kræft- og fytoplanktonceller. Denne metode tilvejebringer en universel standard for prøve kryo-forberedelse.

Biologiske prøver Forberedelse til speciering ved kryogen temperatur ved hjælp af røntgenabsorptionsspektroskopi med høj opløsning

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Denne protokol er blevet standardiseret for cellulære prøver, hvilket gør det muligt at sammenligne eksperimenter, der kører på forskellige synkrotronplaceringer. Den største fordel ved denne teknik er en enkel og ligetil arbejdsgang, der muliggør en hurtig og pålidelig bevarelse af prøvens kemiske integration. Personer, der er nye til denne teknik, kan kæmpe med de frosne itererede celler pelletering og den hurtige belastning af den cellulære pellet i cryosample rækkefølgen.En præcis og hurtig afkobling af en prøve i kryogen temperatur er kritisk. Som sådan er en visuel demonstration en vigtig for at forstå, hvordan man udfører teknikken. For at forberede cellepiller i human prostata- og æggestokkræftcellelinje til selenspeciering skal man indsæde det passende antal celler fra hver cellelinje i tre T-75-kolber pr. tilstand i det relevante cellekulturmedium i en laminær strømningshætte og anbringe kolberne i 37 grader Celsius og 5 % kuldioxidcellekulturinkubator, indtil cellerne er 80 % sammenflydende.For at udsætte kræftcellerne for selenbehandling skal du først sonikere frisklavede nanopartikelopløsninger i et ultralydsvandbad i 30 minutter ved stuetemperatur, før selennanopartikelopløsningen serielt fortyndes i komplet cellekulturmedium til de relevante arbejdskoncentrationer. I den laminære flowhætte vaskes cellerne forsigtigt to gange med fem ml 37 grader Celsius PBS pr. vask, og der anvendes en steril pipette på 25 ml til forsigtigt at tilsætte 15 ml selenbehandling af interesse til bunden af kolben. Lågene lukkes uden at forsegle kolben helt, og kolberne anbringes vandret i cellekulturinkubatoren i 24 timer.For at forberede cellepillerne efter vask og genopfyldning af kulturmediet skal du bruge en celleskraber pr. Kolbe til forsigtigt at løsne cellerne. Brug medium til at skylle eventuelle celler, der sidder fast i kolben, ind i supernatanten og opsaml de dissocierede celler ved centrifugering. Vask pellets to gange i fem milliliter PBS pr. rør pr. vask for at fjerne alle resterende spor af behandlingen og resuspend cellerne i en milliliter PBS.Overfør cellerne til et 1,5 ml polypropylenrør og opsaml cellerne med en anden centrifugering. Brug derefter en 200 mikroliter pipette til forsigtigt at fjerne hele supernatanten og dykke den nederste del af hvert 1,5 ml rør i flydende nitrogen til niveauet af cellepillen. Umiddelbart efter frysning overføres rørene til en flydende nitrogendewar til langtidsopbevaring.Ved røntgenabsorptionsspektroskopi i høj opløsning skal alle krystallerne fra krystalanalysatorspektrometeret optimeres under Bragg-forhold med hensyn til fluorescenslinjeenergien af interesse og anvende en reference, for hvilken absorptionskantens energiposition er kendt for at kalibrere den indfaldende monokromatiske stråleenergi. Overfør prøveholderen til en flydende heliumkrøostat til biologiske prøver, og sæt kryostaten til 10 grader Kelvin, luk derefter forsøgskabinen efter synkrotronsikkerhedsreglerne, og start analysen. Her viser repræsentative højopløselige røntgenabsorptionsspektroskopispektre af selen i indledende tilstand og i celler inkuberet til næringsmedium, at selen i de oprindelige selennanopartikler var til stede som både selen nul og cellulitelignende former.Efter interaktioner med PC3-cellerne var selen dog hovedsageligt til stede i cellerne som selen nul, hvilket viste en ændring af selenarter i cellerne. For jern udviser referencespektre med høj opløsning røntgenabsorptionsspektroskopi forskellige kantpositioner afhængigt af jernoxidationstilstanden, med reducerede jernarter skiftet til lave energiværdier. To på hinanden følgende spektre indsamlet på samme position af en kiselpille var ens, hvilket indikerer, at stråleskaden var begrænset mellem to erhvervelser ved anvendelse af en heliumkromoostat ved 10 Kelvin.Desuden var spektre fra forskellige positioner af kiselpillen identiske, hvilket viste, at prøvepillen var homogen, og at spektrene kunne gennemsnitliggøres for at opnå et bedre signal-støj-forholdsspektrum. De mest kritiske trin er fremstillingen af nanopartikeldituionen, pelletering ved kryogen temperatur og fremstilling af standardreferenceprøverne. Denne procedure kan anvendes på andre bulkanalytiske teknikker, såsom ICP-MS eller HPLC-ICP-MS eller andre ikke-synkrotronspektroskopiske teknikker, der kan udføres ved kryogen temperatur.Andre videnskabelige spørgsmål kan udforskes ved hjælp af denne procedure, især inden for biogeologi, biokemi og miljøvidenskab eller toksikologiforskning. Selenforbindelser og selennanopartikler kan være lige så besværlige for dit helbred og bør manipuleres i en dedikeret kemisk hætte ved hjælp af handsker, briller og en ansigtsmaske.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Målrettede Metabolomics fra biologiske kilder Brug Ultraperformance væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

Udarbejdelse af Carbon Nanosheets ved stuetemperatur

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Hurtig High-throughput Arter Identifikation af Botanisk Materiale Brug Direct Analyse i Real Time High Resolution massespektrometri

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantificere X-Ray fluorescens Data ved hjælp af kort

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total interne Reflection Absorption spektroskopi (TIRAS) til påvisning af Solvated elektroner på en Plasma-flydende Interface

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrofluid Chips for In Situ Crystal røntgen diffraktion og In Situ dynamisk lysspredning for serielle krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Væsentlige Metal udbredelse i Gram-negative bakterier: X-ray fluorescens, radioisotoper, og celle fraktionering

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-følsomme påvisning af kemi i batterier gennem bløde X-ray Absorption spektroskopi og Resonant uelastisk X-ray spredning

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Forbedre høj viskositet ekstrudering af Microcrystals for tidsopløst seriel femtosekund krystallografi på X-ray lasere

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...